Полипептиды гемагглютининов, а также связанные с ними реагенты и способы

Полипептиды гемагглютининов, а также связанные с ними реагенты и способы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/389639, поданной 4 октября 2010 г, полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Государственная поддержка

[0002] Данное изобретение было сделано при государственной поддержке по грантам под номерами GM57073 и U54 GM62116, выданным Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство Соединенных Штатов Америки может иметь определенные права на данное изобретение.

Уровень техники

[0003] Грипп имеет долгую историю пандемий, эпидемий, возобновления активности и вспышек. Птичий грипп, включая штамм H5N1, является высоко контагиозным и потенциально смертельным патогеном, но в настоящее время он обладает лишь ограниченной способностью инфицировать людей. Однако были сделаны исторические наблюдения, что у вирусов птичьего гриппа могут накапливаться мутации, которые изменяют их специфичность в отношении хозяина и позволяют легко инфицировать человека. Фактически две из крупных пандемий гриппа в последние сто лет были вызваны вирусами птичьего гриппа, которые изменили свое генетическое строение и стали способны инфицировать человека.

[0004] Существует серьезная обеспокоенность тем, что существующие в настоящее время штаммы вирусов птичьего гриппа H5N1, H7N7, H9N2 и H2N2 могли накопить мутации, которые изменили их специфичность в отношении хозяина и позволяют легко инфицировать человека. Следовательно, есть необходимость установить, действительно ли белок-гемагглютинин (ГА) у данных штаммов превращается в форму, которая может легко инфицировать человека, а также далее требуется идентифицировать варианты ГА с такой способностью. Также необходимо получить представление о характеристиках белков ГА в общем, которые делают возможным или препятствуют инфицированию различных субъектов, в частности людей. Также есть необходимость в разработке вакцин и терапевтических стратегий для эффективного лечения или отсрочки начала заболевания, вызванного вирусом гриппа.

Краткое описание

[0005] Настоящее изобретение относится к связывающим агентам с определенными характеристиками связывания с гликанами. В частности, согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты, которые связываются с сиалированными гликанами, обладающими топологией, напоминающей зонтик. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами, обладающими топологией зонтика, с высоким сродством и/или специфичностью. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению демонстрируют предпочтительное связывание с гликанами, обладающими топологией зонтика, по сравнению с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами на рецепторах гемагглютининов. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами с топологией зонтика.

[0006] Также согласно настоящему изобретению предложены диагностические и терапевтические реагенты и способы, связанные с предложенными связывающими агентами, включая вакцины.

[0007] В частности, настоящее изобретение основано на установление того факта, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с измененным гликозилированием могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации эталонным полипептидом ГА является любой из следующих полипептидов ГА:

[0008] А/Южная Каролина/1/18 (H1):

[0009] А/Брисбен/59/07 (H1):

[0010] А/Калифорния/04/09 (H1):

[0011] А/Албания/6/58 (H2):

[0012] А/Аичи/1/68 (H3):

[0013] А/Москва/10/99 (H3):

[0014] А/Перт/16/09 (H3):

[0015] А/Вьетнам/1203/04 (H5):

[0016] A/Египет/2786-NAMRU3/06 (H5):

[0017] А/Нью-Йорк/107/03 (H7):

[0018] Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с изменениями в петлевой области ГА могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА (например, включая полипептид ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:43-52).

[0019] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение основао на том, что варианты полипептида ГА H5 с измененным гликозилированием могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом является любой из следующих полипептидов ГА:

[0020] А/Гонконг/486/97

[0021] А/Гонконг/213/03

[0022] А/Вьетнам/1203/04

[0023] А/Индонезия/5/05

[0024] A/Египет/2786-NAMRU3/06

[0025] Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептида ГА H5 с изменениями в петлевой области ГА могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА (например, включая полипептид ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:50, 51 и 53-55).

Краткое описание рисунков

[0026] Фигуры 1A-1C. Выравнивание примерных последовательностей ГА дикого типа. Последовательности были получены из базы данных вирусов гриппа NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). H1_Av (SEQ ID №:1). H1_Hu1 (SEQ ID №:2). H1_Hu2 (SEQ ID №:3). H2_Av (SEQ ID №:4). H2_Hu (SEQ ID №:5). H3_Av (SEQ ID №:6). H3_Hul (SEQ ID №:7). H3_Hu2 (SEQ ID №:8). H4_Av (SEQ ID №:9). H5_Av1 (SEQ ID №:10). H5_Av2 (SEQ ID №:11). H6_Av (SEQ ID №:12). H7_Av (SEQ ID №:13). H8_Av (SEQ ID №:14). H9_Av (SEQ ID №:15). H10_Av (SEQ ID №:16). H11_Av (SEQ ID №:17). H12_Av(SEQ ID №:18). H13_Av (SEQ ID №:19). H14_Av (SEQ ID №:20). H15_Av (SEQ ID №:21). H16_Av (SEQ ID №:22).

[0027] Фигуры 2A-2B. Выравнивание последовательностей связывающего гликан домена ГА. Серый цвет: консервативные аминокислоты, участвующие в связывании сиаловой кислоты. Красный цвет: конкретные аминокислоты, участвующие в связывании мотивов Neu5Acα2-3/6Gal. Желтый цвет: аминокислоты, которые влияют на позиционирование Q226 (137, 138) и Е190 (186, 228). Зеленый цвет: аминокислоты, участвующие в связывании с другими моносахаридами (или модификациями), присоединенными к мотиву Neu5Acα2-3/6Gal. Последовательности ASI30, APR34, ADU63, ADS97 и Viet04 были получены из соответствующих кристаллических структур. Другие последовательности были получены из SwissProt (http://us.expasy.org). Сокращения: ADA76, А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) (SEQ ID №:23); ASI30, А/свинья/Айова/30 (H1N1) (SEQ ID №:24); APR34, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) (SEQ ID №:25); ASC18, А/Южная Каролина/1/18 (H1N1) (SEQ ID №:26); AT91, А/Техас/36/91 (H1N1) (SEQ ID №:27); ANY 18, А/Нью-Йорк/1/18 (H1N1) (SEQ ID №:28); ADU63, А/утка/Украина/1/63 (H3N8) (SEQ ID №:29); AAI68, А/Аичи/2/68 (H3N2) (SEQ ID №:30); AM99, А/Москва/10/99 (H3N2) (SEQ ID №:31); ADS97, А/утка/Сингапур/3/97 (H5N3) (SEQ ID №:32); Viet04, А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1) (SEQ ID №:33).

[0028] Фигуры 3A-3B. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H1. На Фигуре 3A представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1A, за исключением того, что на Фигуре 3A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности. На Фигуре 3B представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 3A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.

[0029] Фигуры 4A-4B. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H3. На фигуре 4A представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1А, за исключением того, что на Фигуре 4A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности. На Фигуре 4В представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 4A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.

[0030] Фигура 5A-1. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H5. На Фигуре 5A-1 представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1A, за исключением того, что на Фигуре 5A-1 указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.

[0031] На Фигуре 5A-2 представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 5A-2 указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.

[0032] На Фигурах 5B1-5B5 представлено выравнивание дополнительных последовательностей H5HA. Консенсусная последовательность (SEQ ID №:34); AAL59142 (SEQ ID №:35); AAZ29963 (SEQ ID №:36); ABA70758 (SEQ ID №:37); ABB87042 (SEQ ID №:38); ABD14810 (SEQ ID №:39); ABD46740 (SEQ ID №:40); ABD85144 (SEQ ID №:41); и ABE97569 (SEQ ID №:42).

[0033] На Фигуре 5B-6 представлены дополнительные штаммы вирусов птичьего гриппа 4 (ГА) H5N1.

[0034] Фигуры 6A, 6B-1-6B-2 и 6C-A-6C-F. Основа для понимания специфичности рецепторов гликанов. α2-3- и/или α2-6-связанные гликаны могут принимать разную топологию. Согласно настоящему изобретению способность полипептида ГА к связыванию с определенными из данных топологий придает ему способность к опосредованию инфицирования у разных хозяев, например, человека. Как проиллюстрировано на панели А данной фигуры, в настоящем изобретении определены две особенно значимые топологии - тополгия «конуса» и топология «зонтика». Топологию конуса могут принимать α2-3- и/или α2-6-связанные гликаны, и она типична для коротких олигосахаридов или разветвленных олигосахаридов, присоединенных к коровой структуре (хотя данную топологию могут принимать и определенные длинные олигосахариды). Топологию зонтика могут принимать только α2-6-связанные гликаны (предположительно из-за повышенной конформационной некомпактности, обеспечиваемой дополнительной С5-С6 связью, которая присутствует в связи α2-6), и ее преимущественно принимают длинные олигосахариды или разветвленные гликаны с длинными цепями олигосахаридов, особенно содержащие мотив Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNAc-. Как описано в настоящей заявке, способность полипептидов ГА к связыванию с гликанами с топологией зонтика дает возможность связывания с рецепторами человека и/или способность к опосредованию инфицирования человека. На панели B данной фигуры кокретно показана топология α2-3 и α2-6, регулируемая углами внутреннего вращения гликозидов трисахаридных мотивов - Neu5Acα2-3Galβ1-3/4GlcNAc и Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc, соответственно. Чтобы охарактеризовать топологию определяли параметр (θ) - угол между атомом C2 Neu5Ac и атомом C1 последующего Gal и сахарами GlcNAc в данных трисахаридных мотивах. Наложение контура θ и конформационные карты мотивов α2-3 и α2-6 показывают, что мотивы α2-3 и α2-6 в 100% случаев принимают топологию конуса, а мотивы α2-6 принимают и топологию, напоминающую конус, и топологию, напоминающую зонтик (панель C). В топологии, напоминающей конус, которую принимают и α2-3, и α2-6, GlcNAc и последующие сахара расположены вдоль области, охватывающей конус. Взаимодействия ГА с топологией, напоминающей конус, главным образом включают контакты аминокислот в пронумерованных положениях (на основании нумерации ГА H3) с сахарами Neu5Ac. С другой стороны, в топологии, напоминающей зонтик, которая уникальна для α2-6, GlcNAc и последующие сахара изгибаются по направлению к сайту связывания ГА (который выявляется в совместной кристаллической структуре ГА-α2-6). Для более длинных α2-6-олигосахаридов (например, по меньшей мере для тетрасахаридов) данная конформация может быть предпочтительной, поскольку она стабилизирована внутриуглеводными Вандервальсовыми силами между ацетильными группами GlcNAc и Neu5Ac. Взаимодействия ГА с топологией, напоминающей зонтик, включают контакты аминокислот в нумерованных положениях (на основании нумерации ГА H3) с сахарами GlcNAc и последующими сахарами, наряду с контактами с сахарами Neu5Ac и Gal. На панели С данной фигуры показано распределение конформаций для топологии, напоминающей конус, и топологии, напоминающей зонтик, у структур α2-3 и α2-6. В секциях (A)-(D) показаны конформационные (φ, ψ) карты связей Neu5Acα2-3Gal, Neu5Acα2-6Gal, Galβ1-3GlcNAc и Galβ1-4GlcNAc, соответственно. Указанные карты, полученные от GlycoMaps DB (http://www.glvcosciences.de/modeling/glycomapsdb/). были сгенерированы при помощи моделирования методом молекулярной динамики ab initio с применением силового поля метода ММ3. Распределение энергии закодировано цветом от темного (соответствует максимальной энергии) до светлого, соответствующего наименьшей энергии. Обведенные кружком области 1-5 соответствуют (φ, ψ) значениям, наблюдаемым для олигосахаридов α2-3 и α2-6 в совместной кристаллической структуре ГА-гликан. Транс-конформация (обведенная область 1) Neu5Acα2-3Gal преобладает в связывающем кармане ГА за исключением совместной кристаллической структуры ГА А/Аичи/2/68 H3N2 с α2-3, в которой данная конформация является гош-конформацией (обведенная область 2). С другой стороны цис-конформация Neu5Acα2-6Gal (обведенная область 3) преобладает в связывающем кармане ГА. Топология, напоминающая конус, выбрана обведенными областями 1 и 2, а топология, напоминающая зонтик, выбрана обведенной областью 3. В секциях (E)-(F) показано распределение топологии, напоминающей конус, и топологии, напоминающей зонтик, мотивами α2-3 и α2-6, соответственно. Более темные области на конформационных картах применяли в качестве внешних границ для расчета параметра θ (угол между атомом C2 Neu5Ac и атомом C1 последующего Gal и сахарами GlcNAc) для данного набора значений (φ, ψ). На основании порогового значения энергии, для описания топологии, напоминающей конус, применяли значение θ>110°, а для описания топологии, напоминающей зонтик, значение θ<100°. Наложение контура θ и конформационные карты показывали, что мотив α2-3 принимает 100% топологию, напоминающую конус, поскольку ему энергетически не выгодно принимать топологию, напоминающую зонтик. С другой стороны, мотив α2-6 принимает и топологию, напоминающую конус, и топологию, напоминающую зонтик, и данный выбор был классифицирован на основании угла ω (O-C6-C5-H5) связи Neu5Acα2-6Gal.

[0035] Фигура 7. Взаимодействия остатков ГА с топологией конуса в сравнении с топологией зонтика. Анализ совместной кристаллической структуры ГА-гликанов выявил, что положение Neu5Ac относительно сайта связывания ГА почти неизменно. Контакты с Neu5Ac включают высоко консервативные остатки, такие как F98, S/T136, W153, H183 и L/I194. Контакты с другими сахарами включают разные остатки в зависимости от того, α2-3 или α2-6 связь между углеводами, а также от того, топология типа консуса или зонтика. Например, в топологии конуса основные контакты образуются с Neu5Ac и с сахарами Gal. E190 и Q226 играют определяющую роль в таком связывании. Данная фигура также иллюстрирует другие положения (например, 137, 145, 186, 187, 193, 222), которые могут участвовать в связывании со структурами типа конусов. Тип аминокислоты в указанных положениях может влиять на способность полипептида ГА связываться с рецепторами с разной модификацией и/или характером ветвления в структурах гликанов. В топологии зонтика контакты образованы сахарами за пределами Neu5Ac и Gal. Данная фигура также иллюстрирует другие положения (например, 137, 145, 156, 159, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 196, 222, 225, 226), которые могут участвовать в связывании со структурами типа зонтика. В некоторых случаях другие остатки могут образовывать другие контакты с разными структурами гликанов. Тип аминокислоты в указанных положениях может влиять на способность полипептида ГА связываться с рецепторами с разной модификацией и/или характером ветвления в структурах гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в связывание с топологиями зонтика вносит остаток D в положении 190 и/или остаток D в положении 225.

[0036] Фигура 8. Примеры топологии конуса. Данная фигура иллюстрирует примеры (не исчерпывающие) структур гликанов, которые принимают топологию конуса.

[0037] Фигуры 9A-1-9A-7 и 9B. Примеры топологии зонтика. (A) Конкретный пример (не исчерпывающий) структур N- и O-связанных гликанов, которые могут принимать топологию зонтика. (B) Конкретный пример (не исчерпывающий) структур O-связанных гликанов, которые могут принимать топологию зонтика.

[0038] Фигуры 10A-10B. Профиль гликанов в клетках эпителия бронхов человека и клеток эпителия толстой кишки. Для дальнейшего изучения многообразия гликанов в тканях верхних дыхательных путей из НВЕ (линия клеток, репрезентативных для верхних дыхательных путей) выделяли N-связанные гликаны и анализировали их посредством MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы). Преобладающая экспрессия α2-6 в HBE была подтверждена посредством предварительной обработки пробы сиалидазой S (α2-3-специфичной) и сиалидазой A (расщепляет и SA). Преобладающая экспрессия гликанов с длинными ветвями подтверждается посредством анализа фрагментации TOF-TOF (тандемной времяпролетной) репрезентативных максимумов масс-спектра. Чтобы получить эталон для оценки многообразия гликанов в тканях верхних дыхательных путей, был получен профиль N-связанных гликанов в эпителиальных клетках толстой кишки. Данная линия клеток была выбрана, поскольку было показано, что современные вирусы H5N1 инфицируют клетки кишечника. Контроли с предварительной обработкой сиалидазой А и S показали преобладание экспрессии α2-3-гликанов в клетках HT-29. Кроме того, топология гликанов с длинными цепями не настолько распространена, как в случае клеток НВЕ. Следовательно, адаптация ГА H5N1 к организму человека может подразумевать мутации ГА, которые создают возможность для связывания с разнообразными гликанами, экспрессируемыми в тканях верхних дыхательных путей, с высоким сродством (например, гликаны с топологией зонтика).

[0039] Фигуры 11A-11D. Конформационная карта и доступность для растворителей мотивов Neu5Acα2-3Gal и Neu5Acα2-6Gal. На панели А показана конформационная карта связи Neu5Acα2-3Gal. Обведенная кружком область 2 представляет собой транс-конформацию, наблюдаемую в совместных кристаллических структурах APR34_H1_23, ADU63_H3_23 и ADS97_H5_23. Обведенная кружком область 1 представляет собой конформацию, наблюдаемую в совместной кристаллической структуре АА168_H3_23. На панели В показана конформационная карта связи Neu5Acα2-6Gal, где цис-конформация (обведенная область 3) наблюдается во всех совместных кристаллических структурах ГА-α2-6-сиалированный гликан. На панели C показано различие между площадью доступной для растворителя поверхности (SASA) в Neu5Acα2-3 и α2-6-сиалированных олигосахаридах в совместных кристаллических структурах ГА-гликан. Красные и синие столбцы, соответственно, показывают, что Neu5Ac в α2-6 (положительное значение) или α2-3 (отрицательное значение) - сиалированных гликанах образует больше контактов с сайтом связывания гликана. На панели D показано различие между SASA NeuAc в α2-3-сиалированных гликанах, связанных с H1 свиньи и человека (H1_α2-3), H3 птиц и человека (H3_α2-3), и NeuAc в α2-6-сиалированных гликанах, связанных с H1 свиньи и человека (H1_α2-6). Отрицательный столбик для H3_α2-3 показывает, что контактов ГА H3 человека с Neu5Acα2-3Gal меньше, чем у H3 птиц. Углы внутреннего вращения - φ: C2-C1-O-C3 (для связи Neu5Acα2-3/6); ψ: C1-O-C3-H3 (для Neu5Acα2-3Gal) или C1-O-C6-C5 (для Neu5Acα2-6Gal); ω: O-C6-C5-H5 (для Neu5Acα2-6Gal) связей. Карты φ, ψ были получены от GlycoMaps DB (http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/), которые были разработаны доктором Мартином Франком и доктором Клаус-Вильгельмом фон дер Лит (Германский центр исследования рака, Гейдельберг, Германия). Цветовая схема от высокой энергии к низкой энергии соответствует переходу от ярко-красного к ярко-зеленому цвету, соответственно.

[0040] Фигура 12A-12B. Окрашивание срезов ткани верхних дыхательных путей пектинами. Совместное окрашивание ткани трахеи Джакалином (светлее) и Конканавалином A (ConA - темнее) выявило предпочтительное связывание Джакалина (специфически связывается с O-связанными гликанами) с бокаловидными клетками на апикальной поверхности трахеи и ConA (специфически связывается с N-связанными гликанами) с клетками ресничного эпителия трахеи. Не вдаваясь в конкретные теоретические объяснения, стоит отметить, что такое связывание указывает на то, что бокаловидные клетки экспрессируют преимущественно O-связанные гликаны, тогда как клетки ресничного эпителия экспрессируют преимущественно N-связанные гликаны. Совместное окрашивание трахеи Джакалином и SNA (темный; специфически связывается с α2-6) указывает на связывание SNA как с бокаловидными, так и с ресничными клетками. С другой стороны, совместное окрашивание Джакалином (светлее) и MAL (темнее), который специфически связывается с α2-3-сиалированными гликанами, показывает слабое минимальное связывание или отсутствие связывания MAL с многорядным эпителием трахеи, но интенсивное связывание с нижележащими областями данной ткани. В совокупности данные, полученные при окрашивании пектинами, показали преобладающую экспрессию и широкое распределение α2-6-сиалированных гликанов в составе N-связанных или O-связанных гликанов, соответственно, в ресничных и бокаловидных клетках на апикальной стороне эпителия трахеи.

[0041] Фигура 13: Сравнение RBS (связывающих сайтов рецептора) ГА в разных генетических кладах. А/Гонконг/486/97, Генетическая клада 0 (HK_486_97_C0) (SEQ ID №:76); А/утка/человек/795/02, Генетическая клада 2.1.1 (DK_Hunan_795_02_c.2.1.1) (SEQ ID №:77); А/Гонконг/213/03, Генетическая клада 1 (Hk_213_03_c1) (SEQ ID №:78); А/Вьетнам/1194/04, Генетическая клада 1 (Viet_1194_04_c1) (SEQ ID №:79); А/Вьетнам/1203/04, Генетическая клада 1 (Viet_1203_04_c1) (SEQ ID №:80); А/Индонезия/5/05, Генетическая клада 2.1.3 (Ind_5_05_c2.1.3) (SEQ ID №:81); А/Аньхой1/05, Генетическая клада 2.3.4 (Anhui_1_05_c2.3.4) (SEQ ID №:82); A/Египет/2786-NAMRU3/06, Генетическая клада 2.2 (Egypt_2876-N3_06_c2.2) (SEQ ID №:83); А/гусь/Гуйян/337/06, Генетическая клада 4 (Go_Guiy_337_06_c4) (SEQ ID №:84); А/Египет/2321-NAMRU3/07, Генетическая клада 2.2.1 (Egypt_2321-N3_07_c2.2.1) (SEQ ID №:85); A/Египет/3300-NAMRU3/08, Генетическая клада 2.2.1 (Egypt_3300-N3_08_c.2.2.1) (SEQ ID №:86); А/сорока/Гонконг/5052/07, Генетическая клада 2.3.2 (Mag_HK_5052_07_c.2.3.2) (SEQ ID №:87); А/курица/Вьетнам/NCVD-016/2008, Генетическая клада 7 (Ck_Viet_NCVD-016_08_c7) (SEQ ID №:88).

[0042] Фигура 14: Адаптирована из Stevens et al., 2008, J. Mol. Biol., 381: 1382-94. Viet0304: А/Вьетнам/1203/04. Ind505: А/Индонезия/5/05. LS: Мутации RBS ГА Q226L и G228S.

[0043] Фигура 15: ГА Viet0304-LS и Viet0304-RLS (эквивалентен Ind505-LS) дозозависимо анализировали на нашей матрице гликанов, содержащей репрезентативные рецепторы птиц и человека. Оба мутанта продемонстрировали минимальное связывание с α2-6 (сигналы связывания наблюдались только при высокой концентрации ГА), что отличается от высокого сродства связывания с α2-6, которое характерно и для адаптированных к организму человека ГА.

[0044] Фигура 16: Анализ зависимости от дозы для ГА H5N1, которые не подвергаются гликозилированию на N158 в контексте мутации LS. Устранение гликозилирования на N158 в контексте мутации LS повышало сродство связывания с рецепторами до того же диапазона (Kd' ~20 пМ), который наблюдался для ГА адаптированных к организму человека H1N1 and H2N2. Устранение гликозилирования на N158 в матрице ГА H5 с одной только мутацией Q226L (т.е., без G228S мутации LS) приводило к повышенному предпочтению в отношении рецепторов человека (по сравнению с рецепторами птиц), но к существенно сниженному сродству связывания с рецепторами по сравнению с N158-дегликозилированным мутантом LS.

[0045] Фигура 17: Сравнение отличительных признаков RBS между ГА адаптированного к организму человека H2N2 (Alb6_58) и ГА H5N1 (Viet1203_04). Четыре различия между ГА H2N2 и ГА H5N1 включают: (1) состав 130 петли в ГА H2N2, который включает делецию, (2) отсутствие гликозилирования в положении 158 ГА H2N2, (3) аминокислотный состав основания участвующих в RBS положений 137, 221, 226 и 228, и (4) аминокислотный состав на верхней части участвующих в RBS положений 188, 192 и 193.

[0046] Фигура 18: Сравнение RBS мутантов ГА H5 с RBS ГА H2N2. Alb6_58_H2N2 (SEQ ID №:89): А/Албания/6/58 H2N2 HA; Viet1203_04_D (SEQ ID №:90): модифицированная версия А/Вьетнам/1203/04 HA; Viet1203_04_D_H2RBS (SEQ ID №:91): мутант Vietl203_04_D с делецией в положении 130 и 13 заменами аминокислот; Viet1203_04_D_H2RBSmin (SEQ ID №:92): мутант Viet1203_04_D с делецией в положении 130 и 7 заменами; ckEgy_07 (SEQ ID №:93): А/курица/Египет/R2/2007 ГА H5N1, который уже содержит делецию в положении 130; ckEgy_07_H2RBS (SEQ ID №:94): мутант ckEgy_07 с 8 заменами; ckViet_08 (SEQ ID №:95): А/курица/Вьетнам/NCVD-093/2008 H5N1 HA, который уже содержит смену заряда в положениях 192 и 193; ckViet_08_H2RBS (SEQ ID №:96): мутант ckViet_08 с делецией в положении 130 и 6 заменами; ckViet_08H2RBSmin (SEQ ID №:97): мутант ckViet_08 с делецией в положении 130 и 6 заменами; ckViet_08_H2RBSmin (SEQ ID №:98): мутант ckViet_08 делецией в положении 130 и 4 заменами. Остальные положения, в которых произошли замены, выделены жирным шрифтом и цветом. Указанная делеция в петле 130 показана жирным шрифтом и выделена цветом. Гликозилирование в положении 158 выделено цветом.

[0047] Фигура 19: Анализ зависимости от дозы для ГА H5N1 (Viet1203_04_D_H2RBS), модифицированного так, что молекулярный состав его RBS имитирует ГА адаптированного к организму человека H2N2. Данный мутант демонстрирует связывание с рецепторами человека с высокой специфичностью и высоким сродством, что характерно для других ГА, адаптированных к организму человека. Сродство связывания данного мутанта с рецептором человека (6'SLN-LN) оценивают количественно по Kd' ~3 пМ, что попадает в тот же диапазон, что и сродство для адаптированных к организму человека ГА H1N1 и H2N2.

[0048] Фигура 20: Характерные свойства связывания гликан-рецептор для пандемичных ГА

ГА из прототипных адаптированных к организму человека пандемичных штаммов 1918 H1N1 (57) и 1958 H2N2 (S2), а также штамма 2009 H1N1 (S3) демонстрируют специфическое высокоаффинное связывание с рецепторами человека (6'SLN-LN), и минимальное или существенно сниженное сродство связывания с рецепторами птиц (3'SLN-LN) (по сравнению со сродством к рецепторам человека). С другой стороны введение характерной мутации LS в последовательность ГА Viet1203_04 H5N1 не приводит к переключению рецепторного предпочтения на связывание с рецептором человека, отмечаемого у пандемических ГА.

[0049] Фигура 21: Филогенетическое дерево репрезентативных последовательностей из подтипов ГА

Ветви, ведущие к кладам 1 и 2 ГА, отмечены и показаны красным и синим цветом, соответственно. Близкородственные подтипы расположены на ветвях, расположенных близко друг к другу.

[0050] Фигура 22: Ключевые структурные особенности в RBS ГА H5

На данной фигуре показана схема, отражающая RBS ГА Alb6_58 (серый цвет) и Viet0304 (зеленый цвет) с боковыми цепями аминокислот, которые различаются между указанными ГА. Четыре характерные черты, которые отличают RBS H2 от H5, которые описаны в тексте, выделены цветом в пунктирных красных кружках.

[0051] Фигура 23: Выравнивание последовательностей RBS репрезентативных ГА H2 и H5

Выравниванию подвергают последовательности ГА из пандемичного штамма H2N2 (А/Албания/6/58 или Alb58) (SEQ ID №:98), репрезентативных изолятов, выделенных у человека с 1997 по 2006 год (А/Гонконг/486/97 или НК_486_97 (SEQ ID №:105), А/Гонконг/213/03 или НК_213_03 (SEQ ID №:104), А/Вьетнам/1203/04 или Viet1203_04 (SEQ ID №:103), А/Индонезия/5/05 или Ind_5_05 (SEQ ID №:102), A/Египет/2786-NAMRU3 или Egy_2786-N3_06 (SEQ ID №:101)) вместе с выбранным в качестве матрицы ГА H5 (А/курица/Египет/R2/07 или ckEgy_07) (SEQ ID №:100) для введения мутации LS (ckEgy_07mutv5.3) (SEQ ID №:99)).

[0052] Фигуры 24A-24C: Свойства связывания с рецепторами гликанов ckEgy_07 и ckEgy_07, содержащих замены аминокислот LS

Дозозависимое прямое связывание ГА с гликанами проводили на матрице вариантов гликанов, включающей репрезентативные рецепторы человека и животных. A - ГА ckEgy_07 дикого типа демонстрирует типичное специфичное и высокоаффинное связывание с рецептором птиц, характерное для других ГА H5N1 дикого типа. B - Введение мутаций LS в данный ГА количественно сдвигает данную специфичность в сторону рецептора человека (6'SLN-LN) и к существенному уменьшению связывания с рецептором птиц до минимального уровня. C - связывание мутанта LS ckEgy_07 с физиологическими рецепторами человека, экспрессируемыми преимущественно на апикальной поверхности среза ткани трахеи человека. Специфичность и сродство по отношению к рецептору человека, определенные на основании профиля дозозависимого связывания в совокупности с данными окрашивания тканей трахеи человека на мутантный ГА, таковы, что они могут быть достаточными, чтобы обеспечить воздушно-капельную передачу вируса H5N1, содержащего данный мутантный ГА в контексте других необходимых изменений (таких как PB2).

[0053] Фигура 25: Анализ влияния утраты гликозилирования в положении 158 в контексте мутаций LS на связывание ГА H5 с гликанами рецепторов. A - мутант ckEgy_07_LS демонстрирует количественное переключение, в чем напоминает другие пандемичные ГА. B - для сравнения показана кривая связывания для ГА А/Калифорния/04/2009 H1N1, адаптированная из предыдущего исследования (S3). C - мутация T160A в мутанте Viet03_04_ALS приводит к удалению сиквона гликозилирования в положении N158, что ведет к утрате гликозилирования на данном сайте. Хотя данный мутант демонстрирует существенное увеличение связывания с рецептором человека, он сохраняет большую часть связывания с рецептором птиц, что не характерно для пандемических ГА и мутанта ckEgy_07_LS (на верхней панели). D - мутации LS в последовательности аминокислот, введенные в последовательность ГА Egy_06, в которой от природы не происходит гликозилирования в положении 158, также демонстрируют такой же профиль связывания, как и мутант Viet03_04_ALS.

[0054] Фигура 26: Адаптирующие к организму человека изменения в последовательности аминокислот ГА H5N1, который в природе приобрел свойство 2

ГА вируса птиц H5N1 А/курица/Вьетнам/NCVD-093/2008 уже приобрел изменения последовательности аминокислот в петле 190, где положение 192 обычно содержит Thr, который мутировал и заменился на Lys, а положение 193 обычно содержит Lys/Arg, который мутировал и заменился на Met. Введение 6 аминокислотных замен и делеции, чтобы обеспечить соответствие свойству 1 (делеция в петле 130+A130T) и свойству 3 (S137R/S221P/Q226L/S227G/G228S), приводит к образованию мутантного ГА, который имеет количественный сдвиг к сторону предпочтения в отношении рецепторов человека, даже при наличии гликозилирования в положении 158. Однако при введении утраты гликозилирования T160A наряду с LS, без делеции петли 130 приводит к существенному снижению связывания с рецепторами человека и птиц (данные не показаны). Следовательно, для данных ГА H5N1 делеция петли 130 является более важным изменением, чем утрата гликозилирования в контексте мутации LS.

[0055] Фигуры 27A-27B: Выявление свойств у изолятов последнего H5 птиц и H5N1 человека

A - Процент изолятов H5N1 птиц и человека, у которых ГА приобрел изменения в последовательности аминокислот, чтобы соответствовать свойствам 1 и 4 RBS ГА H2, отложен на графике как функция от года, когда был выделен конкретный штамм. Имело место существенное увеличение процента изолятов, обладающих указанными ключевыми свойствами, с тех пор как они были впервые выявлены в 2007 году. Филогенетический анализ последовательностей данных изолятов показал, что они принадлежат к кладе 2.2.1. B - Процент изолятов вирусов птиц и человека, у которых ГА приобрел изменения в последовательности аминокислот, чтобы соответствовать свойству 2 RBS ГА H2. Данное свойство приобрел лишь малый процент изолятов H5N1. Было выполнено выравнивание непроцессированных неизбыточных последовательностей ГА из Ресурса вирусов гриппа NCBI, и встречаемость каждого из свойств вычисляли за нужный год и выражали в процентах. Всего для анализа применили 2277 непроцессированных неизбыточных последовательностей H5N1.

[0056] Фигура 28: Расширенная номенклатура гликанов, применяемых в матрице гликанов

Neu5Ac: N-ацетил-D-нейраминовая кислота; Gal: D-галактоза; GlcNAc: N-ацетил-D-глюкозамин. α/β: аномерная конфигурация пиранозных Сахаров. Все сахара связаны посредством линкера через спейсер - биотин

(-Sp-LC-LC-биотин, как описано на сайте http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecored5.shtml).

Описание элементов последовательностей ГА

Элемент 1 последовательности ГА

[0057] Элемент 1 последовательности ГА представляет собой элемент, соответствующий приблизительно остаткам в положениях 97-185 (где положения остатков обозначают, приняв за эталон ГА H3) многих белков ГА, обнаруживаемых у природных изолятов вирусов гриппа. Данный элемент последовательности обладает базовой структурой:

С(Y/F)PX₁CX₂WX₃WX₄HHP (SEQ ID №:106), в которой:

X₁ обладает приблизительной длиной 30-45 аминокислот;

X₂ обладает приблизительной длиной 5-20 аминокислот;

X₃ обладает приблизительной длиной 25-30 аминокислот; и

X₄ обладает приблизительной длиной 2 аминокислоты.

[0058] Согласно некоторым вариантам реализации X₁ обладает длиной приблизительно 35-45, или приблизительно 35-43, или приблизительно 35, 36, 37, 38, 38, 40, 41, 42 или 43 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, Х₂ обладает длиной приблизительно 9-15, или приблизительно 9-14, или приблизительно 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, X₃ обладает длиной приблизительно 26-28, или приблизительно 26, 27 или 28 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, X₄ обладает последовательностью (G/A) (I/V). Согласно некоторым вариантам реализации X₄ обладает последовательностью GI; согласно некоторым вариантам реализации X₄ обладает последовательностью GV; согласно некоторым вариантам реализации X₄ обладает последовательностью AI; согласно некоторым вариантам реализации X₄ обладает последовательностью AV. Согласно некоторым вариантам реализации элемент 1 последовательности ГА содержит дисульфидную связь. Согласно некоторым вариантам реализации указанная дисульфидная связь соединяет остатки в положениях 97 и 139 (на основании канонической системы нумерации H3, применяемой в настоящей заявке).

[0059] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, X₁ обладает длиной приблизительно 43 аминокислоты, и/или X₂ обладает длиной приблизительно 13 аминокислот, и/или X₃ обладает длиной приблизительно 26 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:

CYPX_1AT(A/T)(A/S)CX₂WX₃WX₄HHP (SEQ ID №:107), в которой:

X_1A обладает длиной приблизительно 27-42 или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 26-41, или приблизительно 31-41, или приблизительно 31-39, или приблизительно 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот, а X₂-X₄ такие же, как описаны выше.

[0060] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:

CYPX_1AT(A/T)(A/S)CX₂W(I/L)(T/V)X_3AWX₄HHP (SEQ ID №:108), в которой:

X_1A обладает длиной приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот,

X_3A обладает длиной приблизительно 23-28, или приблизительно 24-26, или приблизительно 24, 25 или 26 аминокислот, а X₂ и X₄ такие же, как описаны выше.

[0061] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:

QLSSISSFEK (SEQ ID №:109),

обычно в пределах X₁, (в том числе, в пределах X_1A) и конкретно начинаясь около остатка 12 X₁ (как проиллюстрировано, например, на Фигурах 1-3).

[0062] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, X₁ обладает длиной приблизительно 39 аминокислот, и/или X₂ обладает длиной приблизительно 13 аминокислот, и/или X₃ обладает длиной приблизительно 26 аминокислот.

[0063] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3,