Мыши с гуманизированной легкой цепью

Мыши с гуманизированной легкой цепью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Генетически модифицированные отличные от человека фертильные животные, которые экспрессируют вариабельные последовательности λ легкой цепи иммуноглобулина человека, когнатные вариабельным последовательностям тяжелой цепи человека. Описаны генетически модифицированные мыши, клетки, зародыши и ткани, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6a, функциональный в локусе ADAM6 мыши, причем мыши, клетки, зародыши и ткани содержат лямбда генные сегменты легкой цепи иммуноглобулина человека, которые способны к реаранжировке для образования функционального вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина. Модификации включают в себя относящиеся к человеку и/или гуманизированные локусы иммуноглобулина. Описаны мыши, которые обладают функцией ADAM6, включая мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6. Описаны генетически модифицированные самцы мышей, которые содержат генетическую модификацию эндогенного локуса области V_H иммуноглобулина мыши и которые дополнительно обладают активностью ADAM6, включая мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая восстанавливает фертильность самца мыши.

Предусмотрены генетически модифицированные отличные от человека фертильные животные, которые содержат делецию или модификацию эндогенного гена ADAM6 или его гомолога или ортолога и которые содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает функцию ADAM6 (или его гомолога или ортолога), причем отличные от человека животные экспрессируют λ вариабельную последовательность иммуноглобулина человека, ассоциированную с константной последовательностью λ или κ легкой цепи.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Фармацевтические применения антител в последних двух десятилетиях активизировали большое количество исследований в области получения антител, подходящих для применений в качестве терапевтических средств для людей. Ранее существующие терапевтические средства на основе антител, основанные на мышиных антителах, не были оптимальными в качестве терапевтических средств для людей, поскольку повторное введение мышиных антител людям приводит к проблемам в отношении иммуногенности, которые могут нарушать схемы длительного лечения. Разрабатывали решения, основанные на гуманизации мышиных антител, чтобы сделать их более похожими на антитела человека и менее похожими на антитела мыши. Придерживались способов экспрессии последовательностей иммуноглобулина человека для применения в антителах, преимущественно основанных на in vitro экспрессии библиотек иммуноглобулина человека в фаге, бактериях или дрожжах. В конце концов, были предприняты попытки создания применимых антител человека из лимфоцитов человека in vitro, в организмах мышей, которым пересадили гематопоэтические клетки человека, и в организмах трансхромосомных или трансгенных мышей с недееспособными эндогенными локусами иммуноглобулина. У трансгенных мышей, было необходимо инактивировать эндогенные гены иммуноглобулина мыши так, чтобы случайным образом интегрированные полностью человеческие трансгены могли бы функционировать в качестве источника последовательностей иммуноглобулина, экспрессированных в организме мыши. Такие мыши могут произовдить антитела человека, подходящие для применения в качестве терапевтических средств для людей, но эти мыши демонстрируют существенные проблемы в отношении их иммунной системы. Эти проблемы (1) делают мышей непригодными для создания разнообразного в достаточной степени набора антител, (2) требуют применения решений для всестороннего переконструирования, (3) обеспечивают субоптимальный процесс селекции клонов, вероятно, вследствие несовместимости между элементами человека и мыши и (4) предоставляют этим мышам ненадежный источник больших и разнообразных популяций вариабельных последовательностей человека, нуждающихся в том, чтобы быть действительно применимыми для получения терапевтических средств для людей.

Трансгенные мыши, которые содержат трансгены полностью человеческих антител, содержат случайным образом вставленные трансгены, которые содержат нереаранжированные вариабельные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека (последовательности V, D и J), соединенные с константными последовательностями тяжелой цепи человека, и нереаранжированные вариабельные последовательности легкой цепи иммуноглобулина человека (V и J), соединенные с константными последовательностями легкой цепи человека. Мыши, следовательно, создают реаранжированные гены антитела из локусов, отличных от эндогенных мышиных локусов, причем реаранжированные гены антитела являются полностью человеческими. Как правило, мыши содержат последовательности тяжелой цепи человека и последовательности легкой цепи человека, хотя также сообщалось о мышах по меньшей мере с несколькими последовательностями λ человека. Трансгенные мыши, как правило, содержат поврежденные и нефункциональные эндогенные локусы иммуноглобулина или нокауты эндогенных локусов иммуноглобулина, так чтобы мыши были неспособны к реаранжировке последовательностей антитела человека на эндогенном локусе иммуноглобулина мыши. Изменения у таких трансгенных мышей делают их менее чем оптимальными для создания достаточно разнообразного репертуара антител человека в организме мышей, вероятно, по меньшей мере частично вследствие субоптимального процесса селекции клонов, который обеспечивает контакт молекул полностью человеческих антител в пределах эндогенной системы селекции мыши.

В настоящей области техники остается потребность в получении улучшенных генетически модифицированных отличных от человека животных, которые применимы в создании последовательностей иммуноглобулина, включая последовательности антител человека, и которые применимы в создании достаточно разнообразного набора антител человека. Кроме того, остается необходимость в мышах, которые способны к реаранжировке генных сегментов иммуноглобулина для образования применимых реаранжированных генов иммуноглобулина, включая в себя вариабельные домены тяжелой цепи человека, которые являются когнатными вариабельным доменам λ человека или вариабельным доменам κ человека или которые способны к созданию белков из измененных локусов иммуноглобулина, включая в себя локусы, которые содержат достаточно разнообразную селекцию вариабельных последовательностей λ легкой цепи человека и/или вариабельных последовательностей κ легкой цепи человека. Существует потребность в отличных от человека животных, которые могут создавать вариабельные области антител как из сегментов κ человека, так и сегментов λ человека, причем сегменты κ человека и сегменты λ человека являются когнатными вариабельным доменам тяжелой цепи человека. Также существует необходимость в увеличенной частоте использования последовательностей λ человека у генетически модифицированных животных.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Описаны генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержат модификацию, которая снижает или устраняет активность гена ADAM6 или его гомолога или ортолога, причем модификация приводит к потере фертильности, и животные дополнительно содержат последовательность, которая кодирует активность, взаимодополняющую или восстанавливающую утраченную или сниженную активность ADAM6 (или активность гомолога или ортолога), и отличные от человека животные дополнительно содержат модификации, которые позволяют им экспрессировать вариабельные области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые являются когнатными вариабельным областям λ легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно различным аспектам экспрессируются вариабельные области λ легкой цепи иммуноглобулина человека, слитые с константными областями λ или κ.

Согласно различным аспектам последовательность, которая кодирует активность ADAM6, является смежной с последовательностью иммуноглобулина человека. Согласно различным аспектам последовательность, которая кодирует активность ADAM6, является смежной с не относящейся к человеку последовательностью иммуноглобулина. Согласно различным аспектам последовательность присутствует на той же хромосоме, что и эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного. Согласно различным аспектам последовательность присутствует на другой хромосоме, чем локус тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного.

Описаны генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержат модификацию, которая поддерживает активность гена ADAM6 или его гомолога или ортолога, причем модификация включает в себя вставку одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека выше не относящейся к человеку константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и отличные от человека животные дополнительно содержат модификации, которые позволяют им экспрессировать вариабельные области λ легкой цепи иммуноглобулина человека, когнатные вариабельным областям тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно различным аспектам экспрессируются вариабельные области λ легкой цепи иммуноглобулина человека, слитые с константными областями λ или κ.

Согласно различным аспектам вставку одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека проводят 3' или ниже гена ADAM6 отличного от человека животного. Согласно различным аспектам вставку одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека проводят таким способом, чтобы ген(ы) ADAM6 отличного от человека животного не был(и) разрушен(ы), удален(ы) и/или функционально выключен(ы) так, чтобы активность ADAM6 отличного от человека животного находилась на таком же или сопоставимом уровне, как у отличного от человека животного, которое не содержит такой вставки. Иллюстративные разрывы, делеции и/или модификации функционального сайленсинга включают в себя любые модификации, которые приводят к снижению, устранению и/или потере активности белка(ов) ADAM6, кодируемого(ых) геном(ами) ADAM6 отличного от человека животного.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновых кислот, клетки, зародыши, мыши и способы для получения мышей, которые содержат модификацию, которая дает в результате нефункциональный эндогенный белок ADAM6 или ген ADAM6 мыши (например, нокаут или делецию в эндогенном гене ADAM6), причем мыши содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновой кислоты, клетки, зародыши, мыши и способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация снижает или устраняет активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; также предусмотрены мыши, которые содержат эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, и по меньшей мере одну генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей способны производить потомство путем спаривания. Согласно одному варианту осуществления самцы мышей способны производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина и локуса легкой цепи иммуноглобулина, причем применение способов модификации локуса тяжелой цепи дает в результате самцов мышей, которые проявляют снижение фертильности, и мыши содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы самцов мышей мигрировать от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется наличием спермы, которая проявляет in vivo нарушение миграции. Согласно различным вариантам осуществления генетическая модификация, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает замещение эндогенных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина вариабельными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина другого вида (например, отличного от мыши вида). Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку ортологичных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем делеция приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 связана со снижением фертильности у самцов мышей.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает инактивацию эндогенного не относящегося к человеку вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем инактивация не приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Инактивация может включать в себя замещение или делецию одного или нескольких эндогенных не относящихся к человеку генных сегментов, что дает в результате эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который по существу является неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, которое содержит эндогенные не относящиеся к человеку генные сегменты. Инактивация может включать в себя другие модификации, которые делают эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, причем модификация не включает в себя замещение или делецию эндогенных генных сегментов. Иллюстративные модификации включают в себя хромосомные вставки и/или транслокации, опосредованные молекулярными техниками, например, с использованием точного размещения сайтов сайт-специфической рекомбинации (например, технологии Cre-lox). Другие иллюстративные модификации включают в себя блокирование функциональной связи между не относящимися к человеку вариабельными генными сегментами иммуноглобулина и не относящимися к человеку константными областями иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку в геном отличного от человека животного фрагмента ДНК, содержащего один или несколько генных сегментов V_H человека, один или несколько генных сегментов D_H человека и один или несколько генных сегментов J_H человека другого вида (например, отличного от мыши вида), функционально связанных с одной или несколькими последовательностями константной области (например, геном IgM и/или IgG). Согласно одному варианту осуществления фрагмент ДНК способен подвергаться реаранжировке в геноме отличного от человека животного для образования последовательности, которая кодирует вариабельный домен тяжелой цепи антитела. Согласно одному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека ниже или 3' по отношению к эндогенному гену ADAM6 отличного от человека животного так, чтобы активность ADAM6 (например экспрессия и/или функция кодируемого белка) являлась одинаковой или сопоставимой с отличным от человека животным, которое не содержит вставку.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат модификацию, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши из эндогенного аллеля ADAM6 так, что самец мыши с модификацией проявляет сниженную фертильность (например, сильно сниженную способность производить потомство путем спаривания), или является по существу стерильным вследствие снижения или устранения эндогенной функции ADAM6, причем мыши дополнительно содержат эктопическую последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному аспекту модификация, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши, представляет собой модификацию (например, вставку, делецию, замещение и т.д.) в локусе иммуноглобулина мыши.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность или существенную неспособность мыши производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сперматозоидов, произведенных в объеме эякулята мыши, являются неспособными пройти через яйцевод in vivo после копуляции и оплодотворить яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность образования или существенную неспособность образования комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления потеря функции ADAM6 предусматривает существенную неспособность оплодотворить яйцеклетку мыши путем копуляции с самкой мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, и содержит белок (или эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок), который предоставляет мыши функциональность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самца мыши, и функциональность содержит усиленную фертильность по сравнению с мышью, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно одному варианту осуществления эктопический белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус ассоциирован с тканеспецифической экспрессией. Согласно одному варианту осуществления тканеспецифическая экспрессия присутствует в репродуктивных тканях. Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, случайным образом вставленной в зародышевую линию мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит относящуюся к человеку или химерную относящуюся к человеку/мыши или химерную относящуюся к человеку/крысе (например, относящуюся к человеку вариабельную, относящуюся к мыши или крысе константную) легкую цепь и химерную относящуюся к человеку вариабельную/относящуюся к мыши или крысе константную тяжелую цепь. Согласно конкретному варианту осуществления мышь содержит трансген, который содержит химерный ген относящейся к человеку вариабельной/относящейся к крысе или мыши константной легкой цепи, функционально связанный с транскрипционно активным промотором, например, промотором ROSA26. Согласно дополнительному конкретному варианту осуществления химерный трансген относящейся к человеку/мыши или крысы легкой цепи содержит реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи человека в зародышевой линии мыши.

Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность расположена в пределах не относящегося к иммуноглобулину локуса в зародышевой линии мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящийся к иммуноглобулину локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту осуществления транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность размещена в виде вставленной случайным образом в зародышевую линию мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6, причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая взаимодополняет потерю функции ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность предоставляет мыши способность производить потомство, которое является сопоставимым с таковым у соответствующей мыши дикого типа, которая содержит функциональный эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет мыши способность образовывать комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет сперматозоиду мыши способность проходить от матки мыши через яйцевод мыши к яйцеклетке мыши для оплодотворения яйцеклетки.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от числа пометов, которые производит мышь дикого типа мышь того же возраста и линии за шестимесячный период времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз или приблизительно в 10 раз или более потомства при разведении в течение шестимесячного периода времени, чем мышь такого же возраста и такой же или аналогичной линии, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которую разводят в течение по существу такого же периода времени и по существу при таких же условиях.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит в среднем по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 3 раза или в 4 раза большее число детенышей на помет за 4- или 6-месячный период разведения, чем мышь, которые не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, и которую разводят в течение такого же периода времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, представляет собой самца мыши, и самец мыши производит сперму, которая будучи извлеченной из яйцеводов приблизительно через 5-6 часов после копуляции, отражает миграцию в яйцеводе, которая больше по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, в 100 раз, в 110 раз или в 120 раз или выше, чем у мыши, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, при копуляции с самкой мыши образует сперму, которая способна к прохождению матки и попаданию и прохождению яйцевода в течение приблизительно 6 часов при результативности, которая приблизительно равна сперме мыши дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза или приблизительно в 4 раза или более пометов в сопоставимый период времени, чем мышь, которая не содержит функциональный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, содержащая в своей зародышевой линии не относящуюся к мыши последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок иммуноглобулина, причем не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина содержит вставку гена ADAM6 мыши или его гомолога или ортолога или функционального фрагмента. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к мыши последовательность иммуноглобулина содержит последовательность иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления последовательность содержит один или несколько генных сегментов V, один или несколько генных сегментов D и один или несколько генных сегментов J; согласно одному варианту осуществления последовательность содержит один или несколько генных сегментов V и один или несколько генных сегментов J. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов V, D и J или один или несколько генных сегментов V и J являются переаранжированными. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов V, D и J или один или несколько генных сегментов V и J являются реаранжированными. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки одного или нескольких генных сегментов V, D и J или одного или нескольких генных сегментов V и J мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере две последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в В-клетке. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в клетке, не относящейся к В-клетке.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые экспрессируют вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент из эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем мыши содержат активность ADAM6, которая является функциональной у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат один немодифицированный эндогенный аллель ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент на эндогенном локусе ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат эктопическую последовательность ADAM6 мыши или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, который кодирует белок, которые предоставляет функцию ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в положении в геноме мыши, которое приблизительно соответствует положению эндогенного аллеля ADAM6 мыши, например, 3' по отношению к последовательности генного сегмента V и 5' по отношению к первому генному сегменту D.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, фланкированный выше, ниже или выше и ниже (относительно направления транскрипции последовательности ADAM6) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный генный сегмент иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека, и последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, функциональный у мыши, находится между генными сегментами V человека; согласно одному варианту осуществления мышь содержит два или более генных сегментов V человека, и последовательность находится в положении между последним генным сегментом V и предпоследним генным сегментом V; согласно одному варианту осуществления последовательность находится в положении после последнего генного сегмента V и первого генного сегмента D.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, который расположен в положении в эндогенном локусе иммуноглобулина, которое является таким же или по существу таким же, как и у самца мыши дикого типа. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус является неспособным кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, причем вариабельная область содержит или происходит из эндогенного не относящегося к человеку генного сегмента. Согласно конкретному варианту осуществления эндогенный локус размещен в положении в геноме самца мыши, которое делает его неспособным кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела. Согласно различным вариантам осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6, расположенную на той же хромосоме, что и генные сегменты иммуноглобулина человека, и последовательность ADAM6 кодирует функциональный белок ADAM6.

Согласно одному аспекту предусмотрен самец мыши, который содержит нефункциональный эндогенный ген ADAM6 или делецию эндогенного гена ADAM6, в своей зародышевой линии; причем сперматозоиды мыши способны проходить яйцевод самки мыши и оплодотворять яйцеклетку.

Согласно одному аспекту предусмотрен самец мыши, который содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления модификацию производят ниже, или 3', по отношению к эндогенному гену ADAM6. Согласно одному варианту осуществления модификация представляет собой замещение одного или нескольких эндогенных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина одним или несколькими генными сегментами тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления модификация представляет собой вставку одного или нескольких генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека выше эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат генетическую модификацию, которая снижает эндогенную функцию ADAM6 мыши, причем мышь содержит по меньшей мере некоторую функциональность ADAM6, обеспеченную либо эндогенным немодифицированным аллелем, который является функциональным полностью или частично (например, гетерозигота), либо экспрессией из эктопической последовательности, которая кодирует ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления мыши содержат функцию ADAM6, достаточную для предоставления самцам мышей способности производить потомство путем спаривания по сравнению с самцами мышей, у которых отсутствует функциональный ADAM6. Согласно одному варианту осуществления функция ADAM6 обеспечивается путем присутствия эктопической нуклеотидной последовательности, которая кодирует ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления функция ADAM6 обеспечивается эндогенным геном ADAM6, присутствующим в эндогенном локусе иммуноглобулина, причем эндогенный локус иммуноглобулина является неспособным кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела. Гомологи или ортологи ADAM6 или его фрагменты, которые являются функциональными у самца мыши, включают в себя те, которые восстанавливают, полностью или частично, потерю способности производить потомство, наблюдаемую у самца мыши, у которого отсутствует достаточная эндогенная активность ADAM6 мыши, например, потеря способности, наблюдаемая у нокаутной в отношении ADAM6 мыши. В этом смысле нокаутные в отношении ADAM6 мыши включают в себя мышей, которые содержат эндогенный локус или его фрагмент, но который не является функциональным, т.е. который вообще не экспрессирует ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b) или который экспрессирует ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b) на уровне, недостаточном для поддержания по существу нормальной способности самца мыши дикого типа производить потомство. Потеря функции может быть обусловлена, например, модификацией в структурном гене локуса (т.е. в кодирующей области ADAM6a или ADAM6b) или в регуляторной области локуса (например, в последовательности 5' по отношению к гену ADAM6a или 3' по отношению к кодирующей области ADAM6a или ADAM6b, причем последовательность контролирует, полностью или частично, транскрипцию гена ADAM6, экспрессию РНК ADAM6 или экспрессию белка ADAM6). Согласно различным вариан