Гуманизированные грызуны, которые экспрессируют тяжелые цепи, содержащие домены vl

Гуманизированные грызуны, которые экспрессируют тяжелые цепи, содержащие домены vl

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Предусмотрены генетически модифицированные отличные от человека фертильные животные, которые экспрессируют иммуноглобулиноподобные связывающие белки человека, содержащие константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина, а также связывающие белки, содержащие вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, слитый с константным доменом легкой цепи, и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, слитый с константным доменом тяжелой цепи. Описаны генетически модифицированные мыши, клетки, зародыши и ткани, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует функциональный белок ADAM6, причем мыши, клетки, зародыши и ткани содержат генные сегменты легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанные с одним или несколькими не относящимися к человеку константными генами тяжелой цепи иммуноглобулина. Модификации включают в себя относящиеся к человеку и/или гуманизированные локусы иммуноглобулина. Описаны мыши, которые содержат функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6. Описаны генетически модифицированные самцы мышей, которые содержат генетическую модификацию эндогенного локуса области V_H иммуноглобулина мыши, и которые дополнительно содержат активность ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая восстанавливает или поддерживает фертильность у самца мыши. Иллюстративная фертильность представляет собой фертильность, которая сопоставима с фертильностью мышей дикого типа.

Предусмотрены генетически модифицированные не относящиеся к человеку фертильные животные, которые содержат делецию или модификацию эндогенного гена ADAM6 или его гомолога или ортолога, и которые содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает функцию ADAM6 (или его гомолога или ортолога), причем отличные от человека животные экспрессируют вариабельную последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека, ассоциированную с константной последовательностью тяжелой цепи. Также предусмотрены клетки, экспрессирующие такие связывающие белки, грызуны (например, мыши), которые их производят, и относящиеся к этому способы и композиции.

Описаны генетически сконструированные животные, которые экспрессируют антитела, содержащие вариабельные области легкой цепи, слитые с константными областями тяжелой цепи, причем отличные от человека животные не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, включая в себя грызунов (например, мышей), которые содержат модификацию эндогенного локуса вариабельной области тяжелой цепи (V_H) иммуноглобулина, который делает мышь неспособной производить функциональный белок ADAM6 и приводит к потере фертильности. Описаны генетически модифицированные мыши, которые содержат локус V_H иммуноглобулина, характеризующийся множеством генных сегментов V_L, J_L и необязательно D_H человека или их комбинацией, и которые дополнительно содержат функцию ADAM6, включая в себя мышей, которые содержат эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая восстанавливает фертильность у самца мыши. Генетически модифицированные мыши экспрессируют антитела, которые не содержат вариабельные домены тяжелой цепи и вместо этого содержат вариабельные домены, содержащие реаранжированные генные сегменты легкой цепи.

Описаны генетически модифицированные грызуны (например, мыши), клетки, зародыши и ткани, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный локус ADAM6, причем мыши, клетки, зародыши и ткани экспрессируют тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую вариабельный домен легкой цепи человека. Кроме того, мыши, клетки, зародыши и ткани не содержат функциональный эндогенный ген ADAM6, но сохраняют функцию ADAM6, характеризующуюся присутствием эктопической последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6. Предусмотрены способы получения последовательностей антител у фертильных отличных от человека животных, которые применимы для связывания антигенов.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

За последние два десятилетия фармацевтические применения антител активизировали большое количество исследований в области получения антител, подходящих для применений в качестве терапевтических средств для людей. Ранее существующие терапевтические средства на основе антител, основанные на мышиных антителах, не были оптимальными в качестве терапевтических средств для людей, поскольку повторное введение мышиных антител людям приводит к проблемам с иммуногенностью, которые могут нарушать схемы длительного лечения. Разрабатывали решения, основанные на гуманизации мышиных антител, чтобы сделать их более похожими на антитела человека и менее похожими на антитела мыши. Придерживались способов экспрессии последовательностей иммуноглобулина человека для применения в антителах, преимущественно основанных на in vitro экспрессии библиотек иммуноглобулина человека в фаге, бактериях или дрожжах. В конце концов, были предприняты попытки создания применимых антител человека из лимфоцитов человека in vitro, в организмах мышей, которым пересадили гематопоэтические клетки человека, и в организмах трансхромосомных или трансгенных мышей с недееспособными эндогенными локусами иммуноглобулина.

Для создания таких мышей было необходимо инактивировать эндогенные гены иммуноглобулина мыши так, чтобы случайным образом интегрированные полностью человеческие трансгены могли бы функционировать в качестве экспрессированного репертуара иммуноглобулинов в организме мыши. Такие мыши могут создавать антитела человека, подходящие для применения в качестве терапевтических средств для людей, но эти мыши демонстрируют существенные проблемы в отношении их иммунных систем. Эти проблемы приводят к некоторым экспериментальным препятствиям, например, мыши становятся неспособными производить в достаточной степени разнообразные репертуары антител, требуют применения решений для широкомасштабного реконструирования, обеспечивают субоптимальный процесс селекции клонов, вероятно, вследствие несовместимости между элементами человека и мыши, и представляют собой ненадежный источник больших и разнообразных популяций вариабельных последовательностей человека, которые должны были быть действительно применимыми для получения терапевтических средств для людей.

Трансгенные мыши, которые содержат трансгены полностью человеческих антител, содержат случайным образом вставленные трансгены, которые содержат нереаранжированные вариабельные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека (последовательности V, D и J), соединенные с константными последовательностями тяжелой цепи человека, и нереаранжированные вариабельные последовательности легкой цепи иммуноглобулина человека (V и J), соединенные с константными последовательностями легкой цепи человека. Мыши, следовательно, создают реаранжированные гены антитела из локусов, отличных от эндогенных локусов, причем реаранжированные гены антитела являются полностью человеческими. Как правило, мыши содержат последовательности тяжелой цепи человека и последовательности легкой цепи человека, хотя также сообщалось о мышах по меньшей мере с несколькими последовательностями λ человека. Трансгенные мыши, как правило, содержат поврежденные и нефункциональные эндогенные локусы иммуноглобулина или нокауты эндогенных локусов иммуноглобулина, так чтобы мыши были неспособны к реаранжировке последовательностей антитела человека на эндогенном локусе иммуноглобулина. Изменения у таких трансгенных мышей делают их менее чем оптимальными для создания достаточно разнообразного репертуара антител человека в организме мышей, вероятно, по меньшей мере частично, вследствие субоптимального процесса селекции клонов, который обеспечивает контакт молекул полностью человеческих антител в эндогенной системе селекции, и неблагоприятных эффектов от изменений на эндогенный генетический состав таких мышей.

В настоящей области техники остается потребность в получении улучшенных генетически модифицированных отличные от человека животные, которые применимы в создании последовательностей иммуноглобулина, включая в себя последовательности антител человека, и которые применимы в создании разнообразного репертуара иммуноглобулиноподобных молекул, которые проявляют разнообразие, отличающееся от традиционных молекул антител, при этом в то же время снижая или устраняя неблагоприятные изменения, к которым могут привести генетические модификации. Кроме того, остается необходимость в мышах, которые способны к реаранжировке генных сегментов иммуноглобулина для образования применимых реаранжированных генов иммуноглобулина, включая в себя вариабельные домены легкой цепи иммуноглобулина человека, ассоциированные с константными доменами тяжелой цепи, которые являются когнатными вариабельным доменам легкой цепи иммуноглобулина человека, ассоциированными с константными доменами легкой цепи, или которые способны к созданию белков из измененных локусов иммуноглобулина, включая в себя локусы, которые содержат достаточно разнообразное собрание вариабельных генных сегментов легкой цепи человека. Остается потребность в отличные от человека животные, которые могут производить иммуноглобулиноподобные связывающие белки, причем связывающие белки содержат вариабельные домены легкой цепи иммуноглобулина человека, связанные с константными доменами тяжелой цепи.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрены генетически модифицированные отличные от человека животные, содержащие локусы иммуноглобулина, причем локусы иммуноглобулина содержат множество вариабельных генных сегментов легкой цепи (V_L) человека, функционально связанных с одной или несколькими не относящимися к человеку константными областями, например, Vκ и Jκ человека или Vλ и Jλ, человека, и согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат последовательность, которая кодирует эндогенный функциональный белок ADAM6. Отличные от человека животные включают в себя грызунов, например, мышей и крыс.

Предусмотрены локусы, которые способны к реаранжировке и образованию гена, кодирующего вариабельный домен легкой цепи, который происходит из реаранжировки, включающей в себя генный сегмент Vκ или Vκ легкой цепи человека и генный сегмент Jκ или Jλ, человека и согласно различным вариантам осуществления дополнительно генный сегмент D_H, причем согласно различным вариантам осуществления локусы не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 или его функциональный фрагмент.

Предусмотрены модифицированные локусы иммуноглобулина, которые включают в себя локусы, которые не содержат эндогенный функциональный ген ADAM6 и содержат последовательности иммуноглобулина человека, например, сегмент V_L человека, функционально связанный с относящейся человеку или (или относящейся человеку/не относящейся к человеку химерной) не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина (и в функциональной связи, например, с сегментом V и/или J). Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные генные сегменты V_L и эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его фрагмент, который является функциональным у отличного от человека животного. Предусмотрены модифицированные локусы, которые содержат множественные генные сегменты V_L, функционально связанные с одним или нескольким сегментами D_H и/или одним или несколькими сегментами J_L или J_H, функционально связанными с не относящейся к человеку константной последовательностью иммуноглобулина, например, последовательностью грызуна (например, мыши или крысы) или человека. Также предусмотрены отличные от человека животные, содержащие такие гуманизированные локусы, причем отличные от человека животные проявляют фертильность дикого типа.

Предусмотрены отличные от человека животные, которые содержат вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (например, на трансгене или в качестве вставки или замещения на эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи отличного от человека животного), который содержит множество генных сегментов V_L человека, функционально связанных с генным сегментом D человека и/или J человека. Согласно различным вариантам осуществления множеств генных сегментов V_L человека функционально связаны с одним или несколькими генными сегментами D человека и/или одним или несколькими генными сегментами J человека на эндогенном вариабельном генном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного. Согласно различным вариантам осуществления отличные от человека животные дополнительно содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ADAM6 или его гомолог или ортолог, который является функциональным у самца отличного от человека животного, который содержит модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной по меньшей мере с одним сегментом V_L человека, генным сегментом D_H или генным сегментом J_L. Согласно различным вариантам осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность является смежной с не относящейся к иммуноглобулину последовательностью в геноме отличного от человека животного. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность находится на той же хромосоме, что и модифицированный локус тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность находится на другой хромосоме, чем модифицированный локус тяжелой цепи.

Предусмотрены отличные от человека животные, которые модифицированы на их локусах вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина для делеции всех или по существу всех (например, всех функциональных сегментов или почти всех функциональных сегментов) эндогенных сегментов V_H иммуноглобулина и которые содержат множество генных сегментов V_L человека, функционально связанных с сегментом D_H и J или генным сегментом J_L на эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного. Также предусмотрены отличные от человека животные, содержащие такие локусы и которые не содержат эндогенный ген ADAM6.

Предусмотрены способы получения последовательностей иммуноглобулина человека в отличные от человека животные. Согласно различным вариантам осуществления последовательности иммуноглобулина человека происходят из репертуара последовательностей тяжелой цепи иммуноглобулина, которые содержат генные сегменты V_L человека, реаранжированные и находящиеся в функциональной связи с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, например, V_L, и один или несколько сегментов D_H и J или один или несколько сегментов J_L. Предусмотрены способы получения последовательности иммуноглобулина человека в относящихся к человеку животных, тканях и клетках, причем последовательности иммуноглобулина человека связывают представляющий интерес антиген.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновых кислот, клетки, зародыши, грызуны (например, мыши) и способы получения грызунов (например, мышей), которые содержат модификацию, которая дает в результате нефункциональный эндогенный белок ADAM6 или ген ADAM6 грызуна (например, мыши) (например, нокаут или делецию в эндогенном гене ADAM6), причем грызуны (например, мыши) содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца грызуна того же вида (например, мыши). Согласно одному варианту осуществления мыши содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAM6 грызуна или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; согласно конкретному варианту осуществления белок ADAM6 грызуна представляет собой белок ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления мыши содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или несколько белков ADAM6 грызуна, причем один или несколько белков содержат SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или ее фрагмент, который является функциональным у мыши.

Согласно различным аспектам последовательность, которая кодирует активность ADAM6, является смежной с последовательностью иммуноглобулина человека. Согласно различным аспектам последовательность, которая кодирует активность ADAM6, является смежной с не относящейся к человеку последовательностью иммуноглобулина. Согласно различным аспектам последовательность присутствует на той же хромосоме, что и эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного. Согласно различным аспектам последовательность присутствует на другой хромосоме, чем локус тяжелой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного.

Описаны генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержат модификацию, которая поддерживает активность гена ADAM6 или его гомолога или ортолога, причем модификация включает в себя вставку одного или нескольких генных сегментов легкой цепи иммуноглобулина человека выше не относящейся к человеку константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и отличные от человека животные дополнительно содержат модификации, которые позволяют им экспрессировать вариабельные области легкой цепи иммуноглобулина человека, когнатные вариабельным областям легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно различным аспектам вариабельные области легкой цепи иммуноглобулина человека экспрессируются в ассоциации с константными областями легкой и тяжелой цепи.

Согласно различным аспектам вставку одного или нескольких генных сегментов легкой цепи иммуноглобулина человека проводят 3' или ниже по ходу транскрипции гена ADAM6 отличного от человека животного. Согласно различным аспектам вставку одного или нескольких генных сегментов легкой цепи иммуноглобулина человека проводят таким способом, чтобы ген(ы) ADAM6 отличного от человека животного не был(и) разрушен(ы), удален(ы) и/или функционально выключен(ы) так, чтобы активность ADAM6 отличного от человека животного находилась на таком же или сопоставимом уровне, как у отличного от человека животного, которое не содержит такой вставки. Иллюстративные разрывы, делеции и/или модификации функционального сайленсинга включают в себя любую модификацию, которая приводит к снижению, устранению и/или потере активности белка(ов) ADAM6, кодируемого(ых) геном(ами) ADAM6 отличного от человека животного.

Согласно одному аспекту предусмотрены конструкты нуклеиновой кислоты, клетки, зародыши, мыши и способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и модификация снижает или устраняет активность ADAM6 клетки или ткани самца мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент; также предусмотрены мыши, которые содержат эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, и по меньшей мере одну генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления эндогенная нуклеотидная последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент, расположена в эктопическом положении по сравнению с эндогенным геном ADAM6 мыши дикого типа.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина, причем мыши содержат белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши. Согласно различным вариантам осуществления модификация предусматривает вставку одного или нескольких генных сегментов V_L человека в эндогенном локусе иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делецию), и самцы мышей способны производить потомство путем спаривания. Согласно одному варианту осуществления самцы мышей способны производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина и локуса легкой цепи иммуноглобулина, причем применение способов модификации локуса тяжелой цепи дает в результате самцов мышей, которые проявляют снижение фертильности, и мыши содержат генетическую модификацию, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы самцов мышей мигрировать от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется наличием спермы, которая проявляет in vivo нарушение миграции. Согласно различным вариантам осуществления генетическая модификация, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает замещение эндогенных вариабельных локусов легкой цепи иммуноглобулина вариабельными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина другого вида (например, не относящегося к мыши вида). Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку вариабельных локусов легкой цепи иммуноглобулина другого вида (например, не относящегося к мыши вида) в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем делеция приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 связана со снижением фертильности у самцов мышей.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает инактивацию эндогенного не относящегося к человеку вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем инактивация не приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Инактивация может включать в себя замещение или делецию одного или нескольких эндогенных не относящихся к человеку генных сегментов, что дает в результате эндогенный не относящийся к человеку локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который по существу является неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, которое содержит эндогенные не относящиеся к человеку генные сегменты. Инактивация может включать в себя другие модификации, которые делают эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, причем модификация не включает в себя замещение или делецию эндогенных генных сегментов. Иллюстративные модификации включают в себя хромосомные вставки и/или транслокации, опосредованные молекулярными техниками, например, с использованием точного размещения сайтов сайт-специфической рекомбинации (например, технологии Сrе-lох). Другие иллюстративные модификации включают в себя блокирование функциональной связи между не относящимися к человеку вариабельными генными сегментами иммуноглобулина и не относящимися к человеку константными областями иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку в геном отличного от человека животного фрагмента ДНК другого вида (например, не относящегося к мыши вида), содержащего один или несколько генных сегментов V_L человека и один или несколько генных сегментов J_L человека и необязательно один или несколько относящихся к человеку генных сегментов D_H, функционально связанных с одной или несколькими последовательностями константной области (например, геном IgM и/или IgG). Согласно одному варианту осуществления фрагмент ДНК способен подвергаться реаранжировке в геноме отличного от человека животного для образования последовательности, которая кодирует вариабельный домен легкой цепи, функционально связанный с константной областью тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку одного или нескольких генных сегментов легкой цепи иммуноглобулина человека ниже или 3' по отношению к эндогенному гену ADAM6 отличного от человека животного так, чтобы активность ADAM6 (например, экспрессия и/или функция кодируемого белка) являлась одинаковой или сопоставимой с не относящимся к человеку животным, которое не содержит вставку.

Согласно одному аспекту предусмотрены способы получения мышей, которые содержат генетическую модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем применение способов дает в результате самцов мышей, которые содержат модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делению), и самцы мышей проявляют снижение фертильности, и мыши содержат генетическую модификацию, которая восстанавливает полностью или частично снижение фертильности. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы самцов мышей мигрировать от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно различным вариантам осуществления снижение фертильности характеризуется наличием сперматозоидов, которые проявляют нарушение миграции in vivo. Согласно различным вариантам осуществления генетическая модификация, которая полностью или частично восстанавливает снижение фертильности, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, который является функциональным у самца мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает замещение эндогенных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина вариабельными локусами легкой цепи иммуноглобулина, например, одним или несколькими вариабельными генными сегментами легкой цепи (V_L), одним или нескольким дополнительными генными сегментами тяжелой цепи (D_H) и одним или несколькими соединительными генными сегментами (J) или одним или несколькими соединительными генными сегментами легкой цепи (J_L) другого вида (например, не относящегося к мыши вида). Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку одного ортологичного генного сегмента вариабельных локусов легкой цепи V_L иммуноглобулина, по меньшей мере одного генного сегмента D_H и по меньшей мере одного генного сегмента J или по меньшей мере одного генного сегмента J_L в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем делеция приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает инактивацию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, причем инактивация не приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Инактивация может включать в себя замещение или делецию одного или нескольких эндогенных генных сегментов, которые дают в результате эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который по существу является неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелую цепь антитела, которое содержит эндогенные генные сегменты. Инактивация может включать в себя другие модификации, которые делают эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособным к реаранжировке для кодирования тяжелой цепи антитела, причем модификация не включает в себя замещение или делецию эндогенных генных сегментов. Иллюстративные модификации включают в себя хромосомные инверсии и/или изменения, которые дают в результате локус тяжелой цепи, который не находится в функциональной связи с одной или несколькими эндогенными константными областями.

Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку в геном мыши фрагмента ДНК, содержащего один или несколько генных сегментов V_L человека, один или несколько генных сегментов J и необязательно один или несколько генных сегментов D другого вида (например, не относящегося к мыши вида), функционально связанных с одной или несколькими последовательностями константной области (например, геном IgM и/или IgG). Согласно различным вариантам осуществления генные сегменты J включают в себя генные сегменты J_H или J_L. Согласно одному варианту осуществления фрагмент ДНК способен подвергаться реаранжировке для образования последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела, причем тяжелая цепь содержит реаранжированный вариабельный генный сегмент легкой цепи человек, слитый с константной областью тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает вставку по меньшей мере шести, по меньшей мере 16, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 или больше генных сегментов V_L человека и по меньшей мере одного или по меньшей мере 5 генных сегментов J_L человека в геном мыши. Согласно конкретному варианту осуществления вид представляет собой человека, и генные сегменты представляют собой генные сегменты к легкой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления генетическая модификация предусматривает делецию эндогенного вариабельного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, чтобы сделать эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина нефункциональным, причем делеция дополнительно приводит к потере эндогенной функции ADAM6. Согласно конкретному варианту осуществления потеря эндогенной функции ADAM6 ассоциирована со снижением фертильности у самцов мышей.

Согласно одному аспекту предусмотрены мыши, которые содержат модификацию, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши из эндогенного аллеля ADAM6 так, что самец мыши с модификацией проявляет сниженную фертильность (например, сильно сниженную способность производить потомство путем спаривания), или является по существу стерильным вследствие снижения или устранения эндогенной функции ADAM6, причем мыши дополнительно содержат эктопическую последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному аспекту модификация, которая снижает или устраняет экспрессию ADAM6 мыши, представляет собой модификацию (например, вставку, делецию, замещение и т.д.) в локусе иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность или существенную неспособность мыши производить сперму, которая может проходить от матки мыши через яйцевод мыши для оплодотворения яйцеклетки мыши. Согласно конкретному варианту осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сперматозоидов, произведенных в объеме эякулята мыши, являются неспособными пройти через яйцевод in vivo после копуляции и оплодотворить яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления снижение или потеря функции ADAM6 предусматривает неспособность образования или существенную неспособность образования комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления потеря функции ADAM6 предусматривает существенную неспособность оплодотворить яйцеклетку мыши путем копуляции с самкой мыши.

Согласно одному аспекту предусмотрена мышь, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержит белок (или эктопическую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок), который предоставляет мыши функциональность ADAM6. Согласно одному варианту осуществления мышь представляет собой самца мыши, и функциональность включает в себя усиленную фертильность по сравнению с мышью, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в пределах локуса иммуноглобулина в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту осуществления локус иммуноглобулина представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_L человека и по меньшей мере один генный сегмент J_L человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один V_L человека, по меньшей мере один D_H человека и по меньшей мере один J_L человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_L человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_L человека и по меньшей мере один генный сегмент J_L человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_L человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит шесть генных сегментов Vκ человека и пять генных сегментов Jκ человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит 16 генных сегментов Vκ человека и пять генных сегментов Jκ человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит 30 генных сегментов Vκ человека и пять генных сегментов Jκ человека. Согласно другому конкретному варианту осуществления локус тяжелой цепи содержит 40 генных сегментов Vκ человека и пять генных сегментов Jκ человека.

Согласно одному варианту осуществления эктопический белок кодируется геномной посл