Разработка иммуногена на основе в-клеточной линии дифференцировки с использованием гуманизированных животных

Разработка иммуногена на основе в-клеточной линии дифференцировки с использованием гуманизированных животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/761419, зарегистрированной 6 февраля 2013 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Способы и композиции для разработки иммуногена при помощи разработки В-клеточной линии дифференцировки в гуманизированных иммуноглобулиновых локусах не относящихся к человеку животных. Способы и композиции для разработки иммуногенов для создания вакцин, в которых используются не относящиеся к человеку животные с гуманизированными иммуноглобулиновыми локусами. Итеративные процессы первичных и повторных иммунизаций не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы, для определения кандидатных иммуногенов для применения в качестве вакцин и для создания нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов и патогенов. Разработка человеческих вакцин в животных, содержащих гуманизированный иммуноглобулин.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОМ ФИНАНСИРОВАНИИ

[0003] Данное изобретение было сделано при государственной поддержке по Гранту № UM1-AI100645, присужденному Национальным институтом здоровья (НИЗ) и национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (НИАИЗ). Государство обладает определенными правами на данное изобретение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Вакцины против человеческих патогенов очень нужны, но их трудно получить. Существует в лучшем случае несколько подходящих способов или систем, позволяющих подвергать человеческую иммунную систему воздействию человеческого инфекционного агента или патогенна и получать полезную информацию, которую можно использовать для разработки подходящей вакцины, которая индуцирует у субъекта-человека иммунитет к представляющему интерес инфекционному агенту или патогену. Зачастую это не этично и не практично подвергать субъектов-людей воздействию иммуногенов, полученных из патогена или инфекционного агента, в процессе разработки вакцины, а системы, в которых используются не относящиеся к человеку животные, как правило, не подходят для получения полезной информации по человеческой иммуногенности.

[0005] Хотя люди могут вырабатывать нейтрализующие антитела широкого спектра действия против инфекционных агентов, а эпитопы, связываемые этими антителами, можно определить, эпитопы парадоксальным образом являются относительно неэффективными как иммуногены при их применении в качестве кандидатных вакцин. Это происходит потому, что эпитопы, распознаваемые нейтрализующими антителами широкого спектра действия, не являются теми эпитопами, которые связывают антитела на ранней стадии, такие как те, которые присутствуют на рецепторах ранних В-клеток (BCR) из исходного набора человеческих иммуноглобулинов. Таким образом, вакцинирование субъекта-человека иммуногеном, который содержит эпитоп нейтрализующего антитела широкого спектра действия, только в редких случаях может, если вообще может, привести к появлению у человека-субъекта какого-либо существенного иммунитета к инфекционному агенту. Что означает, что определение важного эпитопа, который реагирует с нейтрализующим антителом широкого спектра действия, часто является бесполезным в отношении потенциальной вакцины. Это существенное наблюдение приводит к выводу, что клональное развитие В-клеток до зрелых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия, стимулируется иммуногенами, которые не идентичны эпитопу, связываемому нейтрализующим антителом широкого спектра действия. Проблема, как кажется, является комплексной и связана с развитием ранних В-клеток.

[0006] Чтобы разработать рациональный процесс создания эффективных вакцин на основе того, что называется развитием В-клеток и человеческим иммунным ответом на человеческие инфекционные агенты, необходима подходящая система для разработки кандидатных вакцин - система, которая позволяет оценить, каким образом человеческий иммунный ответ взаимодействует с иммуногенами и их вариантами, чтобы в конечном итоге получить В-клеточную линию, которая вырабатывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия к эпитопу человеческого инфекционного агента или патогена, и в ходе этого процесса выявить вариант иммуногена, который может служить вакциной, способной индуцировать выработку нейтрализующих антител широкого спектра действия у человеческой популяции в целом. Этот процесс включает поиск ключевого иммуногена, который может примировать исходный набор человеческих иммуноглобулинов, и при помощи тщательно отобранных бустерных иммуногенов осуществить процесс клональной селекции В-клеток для получения зрелой В-клетки, которая экспрессирует нейтрализующие антитела широкого спектра действия.

[0007] В данной области техники существует потребность в композициях и способах создания вакцин, которые подходят для иммунизации людей против человеческих инфекционных агентов. В данной области техники существует потребность в рациональных способах разработки иммуногенов, для применения их в качестве вакцин для людей. В данной области техники существует потребность в гуманизированных системах, например, гуманизированных животных, которых можно использовать в указанных способах для создания вакцин и кандидатных вакцин для иммунизации людей против человеческих инфекционных агентов. Существует потребность в платформе нечеловеческого происхождения, которая может воспроизводить ответ человеческих В-клеток, для создания вакцин к инфекционным агентам при помощи стимуляции развития необходимых В-клеток посредством применения вариантов иммуногенов, что в конечном итоге приведет к развитию необходимых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия против представляющих интерес инфекционных агентов. Также существует потребность в использовании гуманизированных животных для дополнительной разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия к эпитопам инфекционных агентов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Предложены композиции и способы для разработки вакцин, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные последовательности иммуноглобулина, включающие итеративные процессы, которые включают применение выбранных иммуногенов для получения В-клеточных клонов из исходного набора (например, незрелых В-клеток, содержащих рецепторы ранних В-клеток), которые после созревания превращаются в В-клетки, вырабатывающие необходимые антитела, которые избирательно связывают конкретные иммуногены, при этом один или более из выбранных иммуногенов применяются в качестве вакцин. Описаны композиции и способы создания иммунных клеток (в генетически модифицированных не относящихся к человеку животных), которые связывают конкретные, представляющие интерес иммуногены, включая развитие иммунных клеток от исходного или немутированного состояний до зрелого или гипермутированного состояний, которые специфически связывают представляющий интерес инфекционный агент, и применение одного или более из представляющих интерес иммуногенов, которые достигли этих состояний, в приготовлении вакцин, чтобы вызвать у нуждающегося в этом субъекта иммунный ответ на представляющий интерес инфекционный агент, например, чтобы индуцировать у представляющего интерес субъекта иммунитет к представляющему интерес инфекционному агенту и появление популяций иммунных клеток, которые экспрессируют последовательности иммуноглобулина, которые связывают представляющие интерес антигены. Предложены способы создания вакцин, в которых используются грызуны с гуманизированными последовательностями иммуноглобулина.

[0009] Предложены композиции и способы для упрощения разработки иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные иммуноглобулиновые локусы. Предложены композиции и способы использования не относящихся к человеку животных для выявления при помощи промежуточных предшественников В-клеток и В-клеток, содержащих немутированные рецепторы (например, исходного набора В-клеток или набора В-клеток, характеризуемого перестройками в зародышевой линии, которые не были мутированы или не были соматически гипермутированы), иммуногенов для разработки вакцин против инфекционных агентов, которые вызовут выработку из человеческого набора иммуноглобулинов зрелых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия. Предложены композиции и способы для проведения циклов первичных и повторных иммунизаций с применением вариантов иммуногенов и, необязательно, адъювантов, которые генерируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия, чтобы таким образом выявить варианты иммуногенов, способные стимулировать набор ранних или исходных В-клеток (например, набор, отображающий перестройки в зародышевой линии), при этом варианты иммуногенов индуцируют выработку нейтрализующего антитела широкого спектра действия против инфекционного иммуногена.

[00010] Предложены общие способы создания вакцин против человеческих инфекционных агентов и патогенов в не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы.

[00011] Также предложены композиции и способы использования не относящихся к человеку животных, имеющих ограниченный набор иммуноглобулинов (например, ограниченный набор человеческой тяжелой цепи).

[00012] В одном аспекте предложены способы и композиции, в которых применяется иммуноген, разработанный на основе В-клеточной линии дифференцировки в не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированная мышь VELOCIMMUNE®), для итеративной разработки иммуногенов для вакцин против инфекционных заболеваний.

[00013] В одном варианте реализации изобретения компоненты агента инфекционного заболевания применяют в качестве антиген-специфических меток для определения предшественников защитных антител в неиммунизированных или неинфицированных гуманизированных мышах VELOCIMMUNE® или применяют такие же реагенты и сходные стратегии для определения иммуноген-индуцированньгх клональных линий дифференцировки антител против инфекционного агента, которые развиваются в необходимом направлении. Затем эти антитела используют в качестве матриц для итеративной разработки вакцины, во время которой определяют группу новых иммуногенов и, необязательно, адъювантов для того, чтобы сделать субдоминатный или непредпочтительный в ином случае путь созревания В-клеток доминантным. В одном варианте реализации изобретения в условиях вакцинации получают достаточные для защиты уровни антител в плазме крови и тканях.

[00014] В одном аспекте не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированные мыши VELOCIMMUNE®), используются для разработки иммуногенов для вакцин, включая: применение костного мозга преиммунной невакцинированной мыши для выделения антиген-специфических исходных В-клеток, которые связываются с антиген-специфическими реагентами инфекционного агента, содержащего нейтрализующие эпитопы широкого спектра действия; выделяют антитела, соответствующие рецепторам исходных В-клеток (BCR), и получают их рекомбинантным путем; а иммуногены выбирают на основании их высокой аффинности связывания с этими BCR для определения иммуногенов, которые будут стимулировать созревание нейтрализующих линий дифференцировки В-клеток широкого спектра действия в периферических лимфатических узлах и селезенке.

[00015] В одном аспекте не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированных мышей VELOCIMMUNE®), вакцинируют существующими иммуногенами, которые сами по себе являются антигенными по отношению к нейтрализующим антителам широкого спектра действия, которые необходимо индуцировать; затем индуцированные антитела выделяют путем получения моноклональных антител из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных мышей; получают антитела рекомбинантным способом; а затем большинство зрелых антител необходимой линии дифференцировки используют в качестве матрицы для дополнительного стимулирования необходимой линии дифференцировки до полной экспрессии необходимой функции, например, защитной эффекторной функции против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения защитная функция включает нейтрализацию вируса, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность против инфицированных инфекционным агентом клеток, предотвращение проникновения инфекционного агента через мукозальный барьер и блокирование попадания инфекционного агента в клетки-мишени.

[00016] В одном аспекте предложен способ получения иммуногена, который приводит к выработке в не относящемся к человеку животном, содержащем гуманизированный Ig-локус, нейтрализующего антитела широкого спектра действия против инфекционного агента, включающий итерирование и скрининг кандидатных иммуногенов для разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки, при этом итерирование и скрининг включают:

[00017] (a) определение первого эпитопа инфекционного агента, который связывается с нейтрализующим антителом широкого спектра действия;

[00018] (b) получение второго эпитопа, который специфически связывает первое промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом второй эпитоп не идентичен первому эпитопу;

[00019] (c) получение третьего эпитопа, который специфически связывает второе промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом третий эпитоп не идентичен второму эпитопу; и

[00020] (d) применение третьего эпитопа в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00021] В одном варианте реализации изобретения указанный способ дополнительно включает получение четвертого эпитопа, который специфически связывает третье промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом четвертый эпитоп применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00022] В одном варианте реализации изобретения указанный способ дополнительно включает получение пятого эпитопа, который специфически связывает четвертое промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом пятый эпитоп применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00023] В одном варианте реализации изобретения первый, второй, третий, четвертый или пятый эпитоп связывает немутированное антитело-предшественник. В одном варианте реализации изобретения первый, второй, третий, четвертый или пятый эпитоп, который связывает немутированное антитело-предшественник, применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00024] В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник представляет собой антитело исходной В-клетки. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник презентируется на ранней В-клетке как антитело IgM. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник претерпевает перестройку генных сегментов зародышевой линии перед сменой класса.

[00025] В одном аспекте предложен способ создания вакцины против инфекционного агента в не относящемся к человеку животном, которое содержит гуманизированный иммуноглобулиновый локус, включающий проведение первичной и повторной иммунизации вариантами эпитопа инфекционного агента, при этом эпитоп инфекционного агента связывается с нейтрализующим антителом широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения первичные и повторные иммунизации вариантами эпитопа инфекционного агента проводят до тех пор, пока не обнаружится вариант, который после иммунизации исходного не относящегося к человеку животного с гуманизированным Ig-локусом приводит к выработке нейтрализующего антитела широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения вариант, который приводит к выработке нейтрализующего антитела широкого спектра действия, применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00026] В одном аспекте предложен способ разработки нейтрализующего антитела широкого спектра действия (BNAb) в не относящемся к человеку животном, содержащем гуманизированный иммуноглобулиновый локус, включающий обработку животного первым структурным вариантом эпитопа иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, создание возможности развития у животного первого иммунного ответа на первый структурный вариант и исследование антител животного для получения нейтрализующего антитела широкого спектра действия против иммуногена. В одном варианте реализации изобретения указанный способ включает обработку животного вторым структурным вариантом эпитопа иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, создание возможности развития у животного второго иммунного ответа и исследование антител животного для получения нейтрализующего антитела широкого спектра действия против иммуногена, при этом иммуноген, первый структурный вариант и второй структурный вариант не являются идентичными.

[00027] В одном аспекте предложен способ использования не относящегося к человеку животного, содержащего гуманизированный иммуноглобулиновый локус, в алгоритме определения немутированного антитела-предшественника, включающий введение не относящемуся к человеку животному первого варианта иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения в указанном алгоритме применяется количественный анализ на основании числа разных VDJ-комбинаций (приблизительно 10⁹) по сравнению с числом возможных нуклеотидных последовательностей сопоставимой длины (приблизительно 4³⁵⁰). Указанный алгоритм на основании обратного анализа последовательности нейтрализующего антитела широкого спектра действия подбирает наиболее правдоподобного предшественника или предшественников.

[00028] В одном варианте реализации изобретения немутированные предшествующие VDJ определяют путем моделирования скорости соматических мутаций, вероятности того, что заданный нуклеотид будет находиться в мутированных состояниях, и числа пассажей, необходимых для соматической гипермутации. Смотрите, например, Haynes et al. (2012) B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study, Nature Biotech. 30(5): 423-433 (включенную в данный документ посредством ссылки, в частности, смотрите, например, Box 4).

[00029] В одном аспекте предложен способ использования не относящегося к человеку животного с гуманизированным иммуноглобулиновым локусом для оптимизации и валидации иммуногенов для разработки вакцины против инфекционного агента, включающий проведение первичной и повторной иммунизаций представляющим интерес иммуногеном не относящегося к человеку животного для разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки. В одном варианте реализации изобретения проводят первичную и повторную иммунизацию не относящегося к человеку животного первым предварительно выбранным иммуногеном, вторым предварительно выбранным иммуногеном и n-ным предварительно выбранным иммуногеном до тех пор, пока не относящееся к человеку животное не будет экспрессировать антитело широкого спектра действия против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения первый предварительно выбранный иммуноген, второй предварительно выбранный иммуноген и n-ный предварительно выбранный иммуноген является эффективной вакциной против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения n-ный означает третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый или десятый.

[00030] В одном аспекте предложен способ создания вакцины, которая вызывает у субъекта-человека выработку нейтрализующего антитела широкого спектра действия против представляющего интерес инфекционного агента, включающий проведение первичной и повторной иммунизации не относящегося к человеку животного, содержащего Ig-локус, вариантами эпитопа инфекционного агента, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, при этом в процессе первичной и повторной иммунизации применяются варианты эпитопа инфекционного агента, которые не связывают нейтрализующее антитело широкого спектра действия, но приводят к выработке у не относящегося к человеку животного нейтрализующего антитела широкого спектра действия, которое связывает представляющий интерес инфекционный агент.

[00031] В одном аспекте предложен способ создания вакцины, которая вызывает у субъекта-человека выработку антитела широкого спектра действия против представляющего интерес инфекционного агента, включающий определение антитела широкого спектра действия, которое нейтрализует представляющий интерес инфекционный агент, создание вариантов эпитопа, связываемых нейтрализующим антителом широкого спектра действия, до тех пор, пока эффективный вариант не приведет к выработке антитела широкого спектра действия, которое нейтрализует представляющий интерес инфекционный агент, и применение эффективного варианта в качестве вакцины против представляющего интерес инфекционного агента.

[00032] В одном аспекте предложен способ разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки, включающий: (а) иммунизацию не относящегося к человеку животного, которое содержит гуманизированный иммуноглобулиновый локус, представляющим интерес первым иммуногеном, при этом первый представляющий интерес иммуноген содержит множество эпитопов; (b) создание возможности развития у не относящегося к человеку животного иммунного ответа на первый представляющий интерес иммуноген, при этом иммунный ответ включает создание нечеловеческих В-клеток, которые экспрессируют человеческие VDJ тяжелой цепи иммуноглобулина и человеческие VJ-домены легкой цепи иммуноглобулина; (с) выделение из не относящегося к человеку животного клонально родственных В-клеток памяти, которые специфически связывают первый представляющий интерес эпитоп первого представляющего интерес иммуногена; (d) определение данных по VDJ и VJ последовательностям для VDJ и VJ последовательностей В-клеток памяти; (е) применение определенных данных по VDJ и VJ последовательностям для определения VDJ и VJ последовательностей немутированного рецептора В-клеток (BCR) и, необязательно, VDJ и VJ последовательностей одного или более промежуточных предшественников между BCR и В-клеткой памяти; и, (f) создание второго иммуногена с повышенной аффинностью (по сравнению с первым иммуногеном) к BCR и/или промежуточному антителу-предсшественнику, при этом второй иммуноген можно применять в качестве вакцины против представляющего интерес первого иммуногена для субъектов-людей.

[00033] В одном варианте реализации изобретения первый представляющий интерес иммуноген представляет собой или получен из инфекционного агента или патогена. В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент или патоген представляет собой вирус, бактерию, грибок или паразита. В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент выбран из ВИЧ-1, гепатита С, вируса лихорадки Денге и ВПЧ.

[00034] В одном варианте реализации изобретения первый представляющий интерес иммуноген представляет собой белок или пептид, а второй представляющий интерес иммуноген представляет собой структурный вариант первого представляющего интерес иммуногена. В одном варианте реализации изобретения структурный вариант содержит замещение одной или более аминокислот белка или пептида. В одном варианте реализации изобретения первый иммуноген представляет собой белок с посттрансляционной модификацией (например, гликозилированием или наличием небелковой группы, например, липида), а второй представляющий интерес иммуноген представляет собой вариант посттрансляционной модификации.

[00035] В одном варианте реализации изобретения VDJ получены из человеческого генного сегмента V_H1-69 и человеческого D- и человеческого J-сегмента.

[00036] В одном аспекте предложен способ разработки вакцины против инфекционного агента или патогена, включающий использование не относящегося к человеку животного, которое содержит гуманизированный локус иммуноглобулина, в качестве

[00037] В одном аспекте применяемые в данном тексте нейтрализующие антитела широкого спектра действия представляют собой антитела, которые существуют у субъектов-людей, инфицированных представляющим интерес инфекционным агентом, при этом антитела способны нейтрализовать инфекционный агент в культуре. В одном варианте реализации изобретения антитела способны предотвращать инфицирование клетки, которую указанные инфекционные агенты, как правило, могут инфицировать в отсутствие антител.

[00038] В различных аспектах инфекционный агент или патоген выбран из вируса (например, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), например, ВИЧ-1, штамма вируса гриппа, вируса папилломы человека (ВПЧ), гепатита С, гепатита В, гепатита А, Денге), бактерии, грибка, паразита (например, штамма или вида малярии) и т.д.

[00039] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, содержащее гуманизированный локус иммуноглобулина, при этом животное иммунизировано вариантом эпитопа инфекционного агента, с которым связывается первое нейтрализующее антитело широкого спектра действия, и при этом животное в результате иммунизации вариантом эпитопа содержит второе нейтрализующее антитело широкого спектра действия, которое нейтрализует тот же самый эпитоп того же самого инфекционного агента, причем второе нейтрализующее антитело широкого спектра действия не является идентичным с первым нейтрализующим антителом широкого спектра действия.

[00040] Предложены композиции и способы для определения иммуногенов для применения в качестве вакцин против инфекционных агентов и для разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, который экспрессирует популяцию В-клеток, полученную из полного набора человеческих вариабельных генов тяжелой цепи, функционально связанных с множеством человеческих D-сегментов и с множеством человеческих J-сегментов; при этом вариабельные сегменты функционально связаны с константной областью, например, человеческой или нечеловеческой константной областью в трансгене, или эндогенной нечеловеческой константной областью, функционально связанной в эндогенном нечеловеческом локусе с набором человеческой тяжелой цепи. В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит полный неперестроенный вариабельный набор человеческой к и/или λ легкой цепи в трансгене, связанном с геном константной области человека или грызуна (например, мыши или крысы), или в эндогенном нечеловеческом локусе легкой цепи, функционально связанном с геном константной области грызуна (например, мыши или крысы).

[00041] Предложены композиции и способы определения иммуногенов для применения в качестве вакцин против инфекционных агентов и для разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, который экспрессирует популяцию В-клеток, полученную из не более чем одного или не более чем двух представителей семейства вариабельных областей тяжелой цепи (например, V_H1-69 и/или ее полиморфов; V_H1-2 и/или ее полиморфов), функционально связанных с множеством человеческих D-сегментов и с множеством человеческих J-сегментов; при этом вариабельные сегменты функционально связаны с константной областью, например, человеческой или нечеловеческой константной областью в трансгене, или эндогенной нечеловеческой константной областью, функционально связанной в эндогенном нечеловеческом локусе с ограниченным набором человеческой V_H. В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит полный неперестроенный вариабельный набор человеческой к и/или к легкой цепи в трансгене, связанном с геном константной области человека или грызуна (например, мыши или крысы), или в эндогенном нечеловеческом локусе легкой цепи, функционально связанном с геном константной области грызуна (например, мыши или крысы).

[00042] Предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, иммунизированные человеческими инфекционными агентами, при этом не относящиеся к человеку животные содержат неперестроенные сегменты гена вариабельной области человеческого иммуноглобулина, которые способны перестраиваться и образовывать гены, которые кодируют последовательности вариабельной области, функционально связанные с эндогенными нечеловеческими константными областями, а кодируемые последовательностями вариабельные домены специфически связывают инфекционный агент. В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное иммунизировано иммуногеном, который представляет собой вариант иммуногена, который связывает человеческое нейтрализующее антитело широкого спектра действия, например, нейтрализующее антитело широкого спектра действия, выделенное из пациента, инфицированного инфекционным агентом. В одном варианте реализации изобретения иммуноген, которым иммунизировано не относящееся к человеку животное, не является идентичным иммуногену, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

[00043] В одном аспекте не относящееся к человеку животное с гуманизированным генным локусом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и гуманизированным генным локусом вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина используют для исследования (или использования в циклах первичных и повторных иммунизаций) иммуногенов для применения в качестве вакцин против человеческих инфекционных агентов или патогенов. В одном варианте реализации изобретения иммуногены получены из, но не идентичны иммуногенам, которые связывают нейтрализующие антитела широкого спектра действия против инфекционного агента или патогена. В одном варианте реализации изобретения идентичность исследуемого иммуногена составляет около 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% или 60% по отношению к иммуногену, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

[00044] В различных аспектах не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, содержат, например, вставку одного или более неперестроенных генных V-, D- и J-сегментов человеческой тяжелой цепи и/или неперестроенных генных V- и J-сегментов человеческой легкой цепи, как в трансгене (полностью человеческом или состоящем из человеческой вариабельной и нечеловеческой константной областей), так и функционально связанных с нечеловеческой константной областью в эндогенном нечеловеческом локусе.

[00045] В различных вариантах реализации изобретения генетически модифицированный локус тяжелой цепи содержит эндогенный ген Adam6a, ген Adam6b или их оба, а генетическая модификация не влияет на экспрессию и/или функцию эндогенного гена Adam6a, гена Adam6b или их обоих.

[00046] В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит эктопически присутствующий ген Adam6a, ген Adam6b или их оба. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой нечеловеческий ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой мышиный ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой человеческий ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой нечеловеческий ген Adam6b. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой мышиный ген Adam6b. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой человеческий ген Adam6b.

[00047] В различных вариантах реализации изобретения один или более из неперестроенных генных V-, D- и J-сегментов человеческой тяжелой цепи и/или неперестроенных генных V- и J-сегментов человеческой легкой цепи присутствуют в ограниченном наборе, например, количество человеческих тяжелых и/или легких генных сегментов, присутствующих у не относящегося к человеку животного, меньше, чем полный человеческий набор соответствующих генных сегментов. В различных аспектах человеческие генные сегменты вставлены в эндогенный локус (непосредственным образом или при помощи кассеты, содержащей рекомбиназу), а эндогенные неперестроенные генные сегменты остаются в геноме не относящегося к человеку животного. В конкретном варианте реализации изобретения человеческие генные сегменты вставлены между крайним 3' нечеловеческим генным сегментом и первым нечеловеческим константным геном. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых присутствуют эндогенные нечеловеческие вариабельные генные сегменты, их инактивируют, например, путем инверсии или частичного удаления.

[00048] В одном аспекте не относящееся к человеку животное является грызуном, например, мышью или крысой.

[00049] В одном аспекте не относящееся к человеку животное содержит множество неперестроенных человеческих генных V- и J-сегментов легкой цепи, функционально связанных с константной областью (например, человеческой или нечеловеческой константной областью в эндогенном Ig-локусе или в трансгене), а неперестроенный локус человеческой тяжелой цепи ограничен не более чем одной, или не более чем двумя или не более чем тремя генными сегментами V_H, функционально связанными с одним или более человеческими D-сегментами или с одним или более человеческими J-сегментами в эндогенном Ig-локусе или в трансгене.

[00050] В одном аспекте не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу, которая содержит модификацию в зародышевой линии, которая приводит к тому, что не более чем один, или не более чем два, или не более чем три человеческих генных сегмента V_H являются функционально связанными с множеством человеческих генных D-сегментов и с множеством человеческих генных J-сегментов, при этом мышь или крыса содержит множество неперестроенных человеческих Vκ и Jκ и/или человеческих Vλ, и Jλ, генных сегментов, функционально связанных с человеческим или нечеловеческим геном константной области. В одном варианте реализации изобретения множество неперестроенных человеческих Vκ и Jκ и/или человеческих Vλ, и Jλ генных сегментов функционально связано с эндогенными генами константной области в эндогенном локусе нечеловеческой легкой цепи.

[00051] В одном аспекте предложен способ получения антитела широкого спектра действия против представляющего интерес иммуногена, включающий:

[00052] (а) примирование не относящегося к человеку животного путем введения первого иммуногена, полученного из представляющего интерес антигена, при этом не относящееся к человеку животное содержит:

[00053] (i) генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных сегментов V_H, множество человеческих генных сегментов D_H и множество человеческих J-сегментов, при этом генные сегменты V_H, D_H и J_H функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи,

[00054] (ii) генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных Vκ-сегментов и один или более человеческих генных Jκ-сегментов, при этом генные сегменты Vκ и Jκ функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи, и

[00055] при этом первый иммуноген содержи