Мыши с гуманизированной универсальной легкой цепью

Мыши с гуманизированной универсальной легкой цепью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Генетически модифицированные мыши, клетки, эмбрионы, ткани и выделенные нуклеиновые кислоты для получения антител и последовательностей, кодирующих вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина человека, включая биспецифические антитела и включая биспецифические антитела, которые содержат универсальные легкие цепи. Композиции и способы включают генетически модифицированных мышей с зародышевыми замещениями на эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи мыши, которые содержат модифицированные локусы легкой цепи, которые экспрессируют легкие цепи, происходящие не более чем из одного или двух различных генных сегментов V легкой цепи, причем мыши дополнительно генетически модифицированы в их зародышевой линии так, чтобы несущие эти модификации самцы мышей являлись фертильными. Предусматриваются генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют универсальные легкие цепи и гуманизированные вариабельные домены тяжелой цепи, причем мыши содержат активность ADAM6, который является функциональным у самца мыши.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Разработка антител для применения в качестве терапевтических средств для людей имеет длинную и сложную историю. Значительным успехом стала способность создавать по существу полные последовательности антитела человека для применения в разработке эффективных терапевтических средств для людей со сниженным потенциалом в отношении иммуногенности. В настоящее время существуют мыши, модифицированные в их зародышевой линии для создания последовательностей антитела человека, происходящих из переаранжированных генных сегментов (тяжелых и легких) или в виде трансгенов, или в виде замещений на эндогенных локусах иммуноглобулина мыши. Замещение вариабельных последовательностей мыши вариабельными последовательностями человека на эндогенных локусах у мышей, как в случае гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®, позволяет иммунной системе мыши функционировать, по существу, нормально. В результате этого, воздействие на таких мышей определенным антигеном создает удивительно разнообразную, богатую популяцию клонально-селективных В-клеток, которые экспрессируют соматически мутированные вариабельные домены человека с высокой аффинностью, которые могут использоваться в создании полностью человеческих антител, направленных против определенного антигена.

Вариабельные домены человека, произведенные у гуманизированных мышей, могут быть использованы для разработки полностью человеческих биспецифических антител, т.е., связывающих белков, которые являются гетеродимерами тяжелых цепей, где идентичности и специфичности связывания вариабельных доменов тяжелой цепи являются различными. Однако решение о выборе легких цепей, которые могут эффективно связываться и экспрессироваться с гетеродимерами тяжелой цепи, не является легким. Разработка вариабельных доменов легкой цепи человека для применения в терапевтических средствах для людей безусловно возможна в гуманизированных мышах, но в этом случае отсутствуют простые решения в отношении выбора того, какие легкие цепи будут эффективно связываться и экспрессироваться с тяжелыми цепями, характеризующимися необходимыми характеристиками связывания, где легкие цепи не являются неблагоприятными в отношении экспрессии или характера связывания обеих тяжелых цепей.

Таким образом, в настоящей области техники сохраняется необходимость в композициях и способах разработки вариабельных областей иммуноглобулина человека для применения в терапевтических средствах для людей, предусматривающих вариабельные области иммуноглобулина человека, образованные из последовательностей нуклеиновых кислот на эндогенных локусах иммуноглобулина мыши.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Описаны мыши, которые экспрессируют вариабельные домены иммуноглобулина человека, являющиеся подходящими для применения в биспецифических связывающих белках, включающих биспецифические антитела, причем мыши содержат гуманизированный эндогенный вариабельный локус тяжелой цепи мыши, причем содержащие гуманизированный локус самцы мышей являются фертильными, и при этом мыши дополнительно содержат гуманизированный эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина, который дает в результате мышь, экспрессирующую репертуар легкой цепи иммуноглобулина, который происходит не более чем из одного или не более чем из двух, Х и/или к генных сегментов V.

Предлагаются подвергнутые генной инженерии мыши, которые выбирают подходящие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина человека созревшей аффинности, происходящие из репертуара переаранжированных сегментов V, D, и J тяжелой цепи человека, причем вариабельные домены тяжелой цепи человека созревшей аффинности связываются и экспрессируются с гуманизированной универсальной легкой цепью. Гуманизированная универсальная легкая цепь экспрессируется из локуса, который содержит либо не более чем один, либо не более чем два сегмента V легкой цепи человека и сегмент J легкой цепи человека, функционально связанный с геном константной области легкой цепи, или не более чем с одной или не более чем с двумя реаранжированными (Vλ/Jλ, Vκ/jκ, Vλ/Jκ или Vλ/Jκ) последовательностями нуклеиновых кислот человека, кодирующими вариабельный домен легкой цепи, функционально связанный с геном константной области легкой цепи. Согласно различным вариантам осуществления универсальный гуманизированный домен легкой цепи образует пару с многочисленными вариабельными доменами тяжелой цепи человека созревшей аффинности, причем многочисленные вариабельные домены тяжелой цепи специфически связывают различные эпитопы или антигены.

Согласно одному аспекту предусматриваются конструкции нуклеиновых кислот, клетки, эмбрионы, мыши и способы получения мышей, которые содержат гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и гуманизированный вариабельный локус легкой цепи иммуноглобулина, причем мышь экспрессирует одну из не более чем двух универсальных легких цепей, и самцы мышей проявляют характерную для мышей дикого типа фертильность.

Согласно одному аспекту предусматривается модифицированная мышь, которая содержит в ее зародышевой линии гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина на эндогенном локусе тяжелой цепи мыши и гуманизированный вариабельный локус легкой цепи иммуноглобулина, причем мышь экспрессирует универсальную легкую цепь, и при этом мышь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно различным вариантам осуществления гуманизированный вариабельный локус легкой цепи иммуноглобулина находится на эндогенном локусе легкой цепи мыши.

Согласно одному варианту осуществления гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит замещение на эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи мыши всех или, по сути, всех функциональных генных сегментов V, D, и J тяжелой цепи иммуноглобулина мыши одним или несколькими генными сегментами V человека, сегментами D человека и сегментами J человека, причем один или несколько сегментов V, D и J человека функционально связаны и способны к реаранжировке для образования реаранжированного гена V/D/J, который функционально связан с последовательностью константной области тяжелой цепи.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит локус легкой цепи, который конструируют для получения универсальной легкой цепи, причем универсальная легкая цепь представляет собой легкую цепь, которая происходит из локуса легкой цепи, который содержит не более чем один сегмент V легкой цепи и не более чем один сегмент J легкой цепи, или локуса легкой цепи, который содержит единственную реаранжированную последовательность V/J легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственный сегмент V легкой цепи иммуноглобулина человека, который способен к реаранжировке с генным сегментом J легкой цепи человека (выбранным из одного или множества сегментов J) и кодированию вариабельного домена легкой цепи человека. Согласно другому варианту осуществления мышь содержит не более чем два сегмента V легкой цепи человека на локусе легкой цепи, каждый сегмент V которого способен к реаранжировке с генным сегментом J человека (выбранным из одного или множества сегментов J легкой цепи) и кодированию реаранжированного вариабельного домена легкой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления единственный сегмент V легкой цепи человека функционально связан с сегментом J легкой цепи человека, выбранным из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, и Jκ5, причем единственный сегмент V легкой цепи человека способен к реаранжировке для образования последовательности, кодирующей ген вариабельной области легкой цепи с любым из одного или нескольких сегментов J легкой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит эндогенный локус легкой цепи, который содержит замещение всех или, по сути, всех генных сегментов V и J мыши не более чем одной или не более чем двумя реаранжированными (V/J) последовательностями нуклеиновых кислот.Согласно одному варианту осуществления не более чем одна или не более чем две реаранжированных (V/J) последовательности нуклеиновых кислот выбраны из Vκ1-39Jκ5, Vκ3-20Jκ1 человека и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления мышь не содержит функциональный эндогенный локус легкой цепи, который способен к экспрессии вариабельного домена легкой цепи мыши. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный домен универсальной легкой цепи на локусе κ. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельные домен универсальной легкой цепи на локусе λ.

Согласно одному варианту осуществления сегмент V человека (или реаранжированная V/J последовательность) функционально связан с лидерной последовательностью человека или мыши. Согласно одному варианту осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность мыши. Согласно конкретному варианту осуществления лидерная последовательность мыши представляет собой лидерную последовательность Vκ3-7 мыши.

Согласно одному варианту осуществления сегмент V человека (или реаранжированная V/J последовательность) функционально связан с промоторной последовательностью иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления промоторная последовательность представляет собой промоторную последовательность человека. Согласно конкретному варианту осуществления промотор иммуноглобулина человека представляет собой промотор Vκ3-15 человека.

Согласно одному варианту осуществления переаранжированные сегменты V и J или реаранжированная (V/J) последовательность функционально связана с геном константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления ген константной области представляет собой Сκ ген мыши.

Согласно одному варианту осуществления переаранжированные сегменты V и J или реаранжированная (V/J) последовательность присутствуют на локусе к легкой цепи, и локус κ легкой цепи содержит κ интронный энхансер мыши, κ 3' энхансер мыши или как интронный энхансер, так и 3' энхансер. Согласно конкретному варианту осуществления к локус представляет собой эндогенный локус κ.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит локус κ, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный домен универсальной легкой цепи, и мышь содержит нефункциональный локус лямбда (λ) легкой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления локус λ легкой цепи содержит делецию одного или нескольких последовательностей локуса, причем одна или несколько делеций делает локус λ легкой цепи неспособным к реаранжировке для образования гена легкой цепи. Согласно другому варианту осуществления все или, по сути, все сегменты V локуса λ. легкой цепи подвергаются делеций. Согласно другому варианту осуществления мышь содержит делецию всего или, по сути, всего эндогенного вариабельного локуса легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления мышь дополнительно содержит в ее зародышевой линии последовательность, выбранную из к интро иного энхансера мыши 5' по отношению к реаранжированной последовательности легкой цепи иммуноглобулина или переаранжированным генным сегментам, к 3' энхансер мыши и их комбинацию.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена универсальной легкой цепи мыши содержит одну или несколько соматических гипермутаций; согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена содержит многочисленные соматические гипермутации.

Согласно одному варианту осуществления мышь производит универсальную легкую цепь, которая содержит соматически мутированный вариабельный домен человека. Согласно одному варианту осуществления легкая цепь содержит соматически мутированный вариабельный домен человека, происходящий из сегмента V человека, сегмента J человека и Ск гена мыши. Согласно одному варианту осуществления мышь не экспрессирует Х легкую цепь.

Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность человека представляет собой реаранжированную последовательность Vκ1-391κ5 человека, и мышь экспрессирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) вариабельный домен, происходящий из Vκ1-39Jκ5 и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) C_H мыши и (ii) соматически мутированный вариабельные домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления мышь экспрессирует легкую цепь, которая является соматически мутированной. Согласно одному варианту осуществления C_L представляет собой Сκ мыши.

Согласно одному варианту осуществления вариабельная последовательность человека представляет собой реаранжированную последовательность Vκ3-20Jκ1 человека, и мышь экспрессирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) вариабельный домен, происходящий из Vκ3-20Jκ1, и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) C_H мыши и (И) соматически мутированный вариабельный домен тяжелой цепи человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит как реаранжированную последовательность Vκ1-391κ5 человека, так и реаранжированную последовательность Vκ3-20Jκ1 человека, и мышь экспресс ирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) легкую цепь, содержащую вариабельные домен, происходящий из последовательности Vκ1-39Jκ5 или последовательности Vκ3-201κ1, и (ii) C_L мыши; причем легкая цепь связана с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) C_H мыши и (ii) соматически мутированный вариабельный домен тяжелой цепи человека. Согласно одному варианту осуществления мышь экспрессирует легкую цепь, которая является соматически мутированной. Согласно одному варианту осуществления C_L представляет собой Сκ мыши.

Согласно одному варианту осуществления мышь экспрессирует обратное химерное антитело, содержащее легкую цепь, которая содержит Сκ мыши и соматически мутированный вариабельный домен человека, происходящий из реаранжированной последовательности Vκ1-39Jκ5 человека или реаранжированной последовательности Vκ3-20Jκ1 человека, и тяжелую цепь, которая содержит C_H мыши и соматически мутированный вариабельный домен тяжелой цепи человека, причем мышь не экспрессирует полностью мышиное антитело и не экспрессирует полностью человеческое антитело. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит локус к легкой цепи, который содержит замещение эндогенных генных сегментов мыши к легкой цепи реаранжированной последовательностью Vκ1-39Jκ5 человека или реаранжированной последовательностью Vκ3-201κ1 человека, и содержит замещение всех или, по сути, всех эндогенных генных сегментов V, D и J тяжелой цепи мыши полным или, по сути, полным репертуаром генных сегментов V, D и J тяжелой цепи человека.

Согласно одному аспекту генетически предусмотрена модифицированная мышь, которая экспрессирует единственную к легкую цепь, происходящую не более чем из одной или не более чем из двух реаранжированных последовательностей к легкой цепи, причем мышь при иммунизации антигеном проявляет титр в сыворотке, который сопоставим с таковым у мыши дикого типа, иммунизированной таким же антигеном. Согласно конкретному варианту осуществления мышь экспрессирует единственную последовательность к легкой цепи, причем единственная последовательность к легкой цепи происходит не более чем из одной реаранжированной последовательности к легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления титр в сыворотке характеризуется как общий иммуноглобулин. Согласно конкретному варианту осуществления титр в сыворотке характеризуется как специфический титр IgM. Согласно конкретному варианту осуществления титр в сыворотке характеризуется как специфический титр IgG. Согласно более конкретному варианту осуществления реаранжированная последовательность к легкой цепи выбрана из последовательности Vκ1-39Jκ5 и Vκ3-20Jκ1. Согласно одному варианту осуществления реаранжированная последовательность к легкой цепи представляет собой последовательность Vκ1-39Jκ5. Согласно одному варианту осуществления реаранжированная последовательность к легкой цепи представляет собой последовательность Vκ3-20Jκ1.

Согласно одному аспекту предусматривается генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует множество тяжелых цепей иммуноглобулина, связанных с единственной последовательностью легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления тяжелая цепь содержит последовательность человека. Согласно различным вариантам осуществления последовательность человека выбрана из вариабельной последовательности, С_Н1, шарнира, С_Н2, СН3 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления единственная легкая цепь содержит последовательность человека. Согласно различным вариантам осуществления последовательность человека выбрана из последовательности вариабельной области, последовательности константной области и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит недееспособный эндогенный локус иммуноглобулина и экспрессирует тяжелую цепь и/или легкую цепь из трансгена или внехромосомной эписомы. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит замещение на эндогенном мышином локусе некоторых или всех эндогенных генных сегментов тяжелой цепи мыши (т.е., V, D, J), и/или некоторых или всех эндогенных последовательностей константной области тяжелой цепи мыши (например, CH₁, шарнира, С_Н2, СН3 или их комбинации), и/или некоторых или всех эндогенных последовательностей легкой цепи мыши (например, V, J, последовательности константной области или их комбинации) одной или несколькими последовательностями иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления мышь после реаранжировки одного или нескольких генных сегментов V, D и J, или одного или нескольких генных сегментов V и J, мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент.Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере две последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления после реаранжировки мышь содержит в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления мышь содержит ген ADAM6 или его гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в В-клетке.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат единственный немодифицированный эндогенный аллель ADAM6 или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент на эндогенном локусе ADAM6.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент в положении в геноме мыши, которое приблизительно соответствует положению эндогенного аллеля ADAM6 мыши, например, 3' по отношению к последовательности последнего генного сегмента V и 5' по отношению к первому генному сегменту D.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей содержат последовательность ADAM6 или ее гомолог или ортолог или функциональный фрагмент, фланкированный выше, ниже или выше и ниже (относительно направления транскрипции последовательности ADAM6) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей генный сегмент вариабельной области иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту осуществления генный сегмент вариабельной области иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека. Согласно одному варианту осуществления генный сегмент вариабельной области иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека, и последовательность, кодирующая ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или фрагмент, функциональный у мыши, находится между генными сегментами V человека; согласно одному варианту осуществления мышь содержит два или более генных сегментов V человека, и последовательность находится в положении между последним генным сегментом V и предпоследним генным сегментом V; согласно одному варианту осуществления последовательность находится в положении после последнего генного сегмента V и первого генного сегмента D.

Согласно одному варианту осуществления гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина не содержит эндогенный мышиный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит ген ADAM6, который является функциональным у самца мыши. Согласно конкретному варианту осуществления ген ADAM6, являющийся функциональным у самца мыши, представляет собой ген ADAM6 мыши, и ген ADAM6 мыши расположен в пределах или непосредственно прилегает к гуманизированному вариабельному локусу тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина не содержит эндогенный ген ADAM6 мыши, и мышь содержит эктопическую последовательность ADAM6, которая является функциональной у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопический ген ADAM6, который является функциональным у самца мыши, представляет собой ген ADAM6 мыши. Согласно одному варианту осуществления ген ADAM6 мыши находится на той же хромосоме, что и гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления ген ADAM6 мыши находится на другой хромосоме, чем гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления ген ADAM6 мыши находится на эписоме.

Согласно одному варианту осуществления мышь содержит первый эндогенный аллель тяжелой цепи и второй эндогенный аллель тяжелой цепи, и первый эндогенный аллель тяжелой цепи содержит делецию локуса ADAM6 мыши, и первый эндогенный аллель тяжелой цепи содержит замещение всех или, по сути, всех функциональных сегментов V, D и J мыши одним или несколькими сегментами V, D и J человека. Согласно одному варианту осуществления каждый из первого и второго эндогенных аллелей тяжелой цепи содержат делецию эндогенного локуса ADAM6 мыши, и первый и второй эндогенные аллели тяжелой цепи содержат замещение всех или, по сути, всех функциональных сегментов V, D и J мыши одним или несколькими сегментами V, D и J человека. Согласно одному варианту осуществления первый и/или второй аллель содержит эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ADAM6 мыши или его ортолог или гомолог или функциональный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты расположена 3' (по отношению к транскрипционной направленности вариабельного локуса тяжелой цепи) относительно последнего генного сегмента V мыши и расположена 5' (по отношению к транскрипционной направленности последовательности константной области) относительно мышиного (или химерного человеческого/мышиного) гена константной области тяжелой цепи или его фрагмента (например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий и/или мышиный: C_H1 и/или шарнир и/или C_H2 и/или C_H3). Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (относительно направления транскрипции локуса сегмента V) сегмента V и выше сегмента D. Согласно одному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты расположена между предпоследним наиболее 3' сегментом V и последним наиболее 3' сегментом V. Согласно конкретному варианту осуществления эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты расположена между V сегментом V_H1-2 человека и V сегментом V_H6-1 человека. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность между двумя генными сегментами V человека расположена в противоположной ориентации транскрипции по отношению к генным сегментам V человека. Согласно конкретному варианту осуществления нуклеотидная последовательность кодирует, от 5' к 3' относительно направления транскрипции генов ADAM6, и за последовательностью ADAM6a следует последовательность ADAM6b. Согласно конкретному варианту осуществления ген(ы) ADAM6 ориентирован(ы) в противоположной ориентации транскрипции по сравнению с вышележащими и нижележащими фланкирующими сегментами V.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую ADAM6a мыши или его функциональный фрагмент, и/или последовательность, кодирующую ADAM6b мыши или его функциональный фрагмент, причем ADAM6a и/или ADAM6b или их функциональный(е) фрагмент(ы) функционально связан(ы) с промотором. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор человека. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор ADAM6 мыши. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 содержит последовательность, расположенную между первым кодоном первого гена ADAM6, ближайшего к наиболее 5' генному сегменту D_H мыши и сигнальной последовательностью рекомбинации наиболее 5' генного сегмента D_H, причем 5' обозначается относительно направления транскрипции генов иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой вирусный промотор. Согласно конкретному варианту осуществления вирусный промотор представляет собой промотор цитомегаловируса (CMV). Согласно одному варианту осуществления промотор представляет собой промотор убиквитина.

Согласно одному варианту осуществления ADAM6a и/или ADAM6b мыши выбраны из ADAM6a SEQ ID NO:1 и/или ADAM6b последовательности SEQ ID NO:2. Согласно одному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши представляет собой промотор SEQ ID NO:3. Согласно конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 мыши содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3 непосредственно перед (относительно направления транскрипции ADAM6a) первым кодоном ADAM6a и продолжающуюся до конца SEQ ID NO:3 выше кодирующей области ADAM6. Согласно другому конкретному варианту осуществления промотор ADAM6 представляет собой фрагмент, простирающийся от в пределах приблизительно 5 - приблизительно 20 нуклеотидов выше стартового кодона ADAM6a до приблизительно 0,5 т.п.о., 1 т.п.о., 2 т.п.о. или 3 т.п.о. или более выше стартового кодона ADAM6a.

Согласно одному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, который, будучи помещен в мышь, которая является нефертильной или которая характеризуется низкой фертильностью вследствие отсутствия ADAM6, улучшает фертильность или восстанавливает фертильность приблизительно до фертильности дикого типа. Согласно одному варианту осуществления SEQ ID NO:3 или ее фрагмент предоставляет самцу мыши способность производить сперматозоид, способный пройти яйцевод самки мыши для того, чтобы оплодотворить яйцеклетку мыши.

Согласно одному варианту осуществления мыши содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, являющийся функциональным у самца мыши. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится в пределах или прилегает к последовательности нуклеиновой кислоты человека, которая содержит один или несколько генных сегментов вариабельной области иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генных сегментов вариабельной области иммуноглобулина находятся на модифицированном эндогенном вариабельном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления модификация содержит замещение всех или, по сути, всех функциональных вариабельных генных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина мыши множеством переаранжированных генных сегментов тяжелой цепи человека, которые являются функционально связанными с эндогенным геном константной области мыши. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится между двумя сегментами V человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится между сегментом V человека и сегментом D человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится между сегментом D человека и сегментом J человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится выше расположенного наиболее 5' (относительно направления транскрипции V сегмента) сегмента V человека. Согласно конкретному варианту осуществления последовательность нуклеиновой кислоты находится между сегментом J человека и эндогенной мыши генной последовательностью константной области тяжелой цепи.

Согласно одному варианту осуществления самцы мышей способны к созданию потомства путем спаривания, с частотой, которая является приблизительно такой же, как и у мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления самцы мышей производят сперматозоиды, которые могут проходить от матки мыши через мышиный яйцевод для оплодотворения яйцеклетки мыши; согласно конкретному варианту осуществления сперматозоиды мышей проходят через яйцевод приблизительно настолько же результативно, как и сперматозоиды мыши дикого типа. Согласно одному варианту осуществления приблизительно 50% или более сперматозоидов, произведенных мышью, проявляют способность поступать в яйцевод и/или проходить его для оплодотворения яйцеклетки мыши.

Согласно одному варианту осуществления у мыши отсутствует функциональный эндогенный локус ADAM6, причем мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, которая дополняет потерю функции ADAM6 мыши у самца мыши. Согласно одному варианту осуществления эктопическая нуклеотидная последовательность предоставляет самцу мыши способность производить потомство, которая сопоставима с соответствующим самцом мыши дикого типа, который содержит функциональный эндогенный ген ADAM6. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет мыши способность формировать комплекс ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности сперматозоида мыши. Согласно одному варианту осуществления последовательность предоставляет сперматозоиду мыши способность проходить от матки мыши через яйцевод мыши к яйцеклетке мыши для оплодотворения яйцеклетки.

Согласно одному варианту осуществления у мыши отсутствует функциональный эндогенный локус ADAM6 и мышь содержит эктопическую нуклеотидную последовательность, кодирующую ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, являющийся функциональным у самца мыши, и при этом самец мыши производит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от числа пометов, которые производит мышь дикого типа мышь того же возраста и разновидности за шестимесячный период времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз или приблизительно в 10 раз или более потомства при разведении в течение шестимесячного периода времени, чем мышь того же возраста и аналогичной разновидности, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и отсутствует эктопическая нуклеотидная последовательность, которую разводят в течение, по сути, такого же периода времени и, по сути, при таких же условиях.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит в среднем по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 3 раза или в 4 раза большее число детенышей на помет за 4- или 6-месячный период разведения, чем мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и у которой отсутствует эктопическая нуклеотидная последовательность, и которую разводят в течение такого же периода времени.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, представляет собой самца мыши, и самец мыши производит сперму, которая будучи извлеченной из яйцеводов приблизительно через 5-6 часов после копуляции, демонстрирует перемещение в яйцеводе, которое является больше по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, в 100 раз, в 110 раз или в 120 раз или выше, чем сперма мыши, которая не содержит функциональный эндогенный ген ADAM6 и которая не содержит эктопическую нуклеотидную последовательность.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, при копуляции с самкой мыши образует сперму, которая способна к перемещению в матке и попаданию и перемещению в яйцеводе в течение приблизительно 6 часов при результативности, которая приблизительно равна сперме мыши дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления мышь, не содержащая функциональный эндогенный ген ADAM6 и содержащая эктопическую нуклеотидную последовательность, производит больше приблизительно в 1,5 раз, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза или приблизительно в 4 раза или более пометов за сопоставимый период времени, чем мышь, у которой отсутствует функциональный ген ADAM6 и эктопическая нуклеотидная последовательность.

Согласно одному аспекту предлагается мышь, которая содержит гуманизированный эндогенный локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши и модификацию локуса легкой цепи иммуноглобулина мыши, причем мышь экспрессирует В-клетку, которая содержит реаранжированную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с генной последовательностью константной области тяжелой цепи человека или мыши, и В-клетка содержит в своем геноме (например, на хромосоме В-клетки) ген, кодирующий ADAM6 или его ортолог или гомолог или фрагмент, являющийся функциональным у самца мыши (например, ген ADAM6 мыши, например, ADAM6a и/или мышиный ADAM6b мыши), причем вариабельные домены Х или к легких цепей иммуноглобулина мышей пр