Отличные от человека животные, экспрессирующие чувствительные к pн последовательности иммуноглобулинов

Отличные от человека животные, экспрессирующие чувствительные к pн последовательности иммуноглобулинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Генетически модифицированное отличное от человека животное, которое экспрессирует антитела, способные связываться с антигеном зависимым от pH образом. Генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержат локусы иммуноглобулинов, которые модифицированы для включения по меньшей мере одной замены или вставки кодона, кодирующего способную к протонированию аминокислоту. Генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержит локусы иммуноглобулинов, которые модифицированы для включения по меньшей мере одной замены гистидина и/или по меньшей мере одной вставки гистидина в генный сегмент V, D или J тяжелой цепи иммуноглобулина или в сегмент V или J легкой цепи, или их реаранжированную область VDJ тяжелой цепи, или реаранжированную область VJ легкой цепи. Генетически модифицированные отличные от человека животные, которые экспрессируют иммуноглобулины, которые проявляют чувствительность к pH в связывании антигена. Генетически модифицированные животные, которые содержат популяции В-клеток, которые обогащены по отношению к вариабельным доменам иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере один гистидин. Генетически модифицированные отличные от человека животные, которые содержат кластеры двух или более гистидинов, присутствующих в виде вставок и/или замен в генном сегменте V, D или J тяжелой цепи иммуноглобулина и/или генном сегменте V и/или J легкой цепи, и/или их реаранжированных последовательностях VDJ тяжелой цепи, или реаранжированных последовательностях VJ легкой цепи.

Генетически модифицированные локусы иммуноглобулина отличных от человека животных, содержащих нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека, причем нереаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека содержит добавление по меньшей мере одного гистидинового кодона или замену по меньшей мере одного эндогенного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Отличные от человека животные, включающие в себя грызунов, например, мышей и крыс, содержащие генетически модифицированный локус иммуноглобулина в своем геноме нереаранжированной нуклеотидной последовательности вариабельной области тяжелой цепи человека, причем нереаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человека содержит добавление по меньшей мере одного гистидинового кодона или замену по меньшей мере одного эндогенного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Подвергнутые генной инженерии отличные от человека животные, способные к экспрессии антигенсвязывающего белка, который характеризуется зависимым от pH связыванием антигена, улучшенной способностью к рециркулированию и/или повышенным периодом полужизни в сыворотке.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Связывающие домены иммуноглобулинов находят терапевтическое применение в самых разнообразных форматах, включающих в себя традиционный формат антитела в виде гомодимерной тяжелой цепи иммуноглобулина, связанной с родственной легкой цепью. Многие из этих форматов, включающих в себя традиционный формат, проявляют фармакокинетические особенности in vivo, которые представляют собой субоптимальные в связи с широким спектром факторов. В последние десятилетия были попытки несопоставимыми подходами улучшить фармакокинетику. Эти подходы включают в себя, например, увеличение гидродинамического радиуса для снижения почечного клиренса путем конъюгации с полимерами (например, ПЭГ; рассмотренным, например, в Duncan, R. (2006) Polymer conjugates as anticancer nanomedicines, Nat. Rev. Cancer 6:688-701); сиалирование N-гликанов (рассмотренное, например, в Stork, R. et al. N-glycosylation as novel strategy to improve pharmacokinetic properties of bispecific single-chain diabodies, J. Biol. Chem. 283(12): 7804-7812); модификации Fc для способствования связывания Fc-FcRn при нейтральном pH, при этом способствуя высвобождению при эндосомальном pH и ассоциации с сывороточным альбумином (смотрите, например, Chuang et al. (2002) Pharmaceutical Strategies Utilizing Recombinant Serum Albumin, Pharm. Res. 19(5): 569-577). В соответствующих приложениях и для соответствующих форматов каждый из этих подходов может предложить некоторые преимущества.

Однако, в настоящей области техники существует потребность для улучшения терапевтических эффектов и способа воздействия биофармацевтических препаратов, включающих в себя без ограничения для манипулирования структурами вариабельного домена иммуноглобулина для того, чтобы проектировать вариабельные домены, которые проявляют зависимое от pH связывание. Существует потребность в вариабельных доменах для использования в антигенсвязьгвающих белках различных форматов, причем вариабельные домены (или их антигенсвязывающие фрагменты) придают антигенсвязывающему белку чувствительность к pH в отношении связывания антигена-мишени или рецептора. Также в настоящей области техники существует потребность в системах и способах для производства зависимых от pH вариабельных доменов иммуноглобулина и их антигенсвязывающих фрагментов. Существует потребность в биологических системах, которые могут производить широкое разнообразие вариабельных доменов иммуноглобулина, причем широкое разнообразие обогащается относительно титруемых аминокислот, которые могут придавать чувствительность к pH вариабельному домену, например, способность связывать антиген-мишень или эпитоп-мишень при одном значении pH (например, нейтральном или высоком значении pH), при этом высвобождая антиген-мишень или эпитоп-мишень при втором значении pH (например, низком или эндосомальном значении pH).

Легкие цепи иммуноглобулина в определенных форматах представляют собой уникальные сенсибилизаторы. Антитела, как правило, содержат гомодимерный компонент тяжелой цепи, причем каждый мономер тяжелой цепи связан с идентичным легкой цепи. Антитела, содержащие гетеродимерный компонент тяжелой цепи (например, биспецифические антитела) желательны в качестве терапевтических антител. Но получение биспецифических антител, содержащих соответствующий компонент легкой цепи, который может удовлетворительно ассоциировать с каждой из тяжелых цепей, биспецифического антитела оказалось проблематичным.

Согласно одному подходу легкая цепь может быть выбрана с помощью обзора статистики использования всех вариабельных доменов легкой цепи, идентифицирующего наиболее часто используемую легкую цепь в антителах человека и образующего пару этой легкой цепи in vitro с двумя тяжелыми цепями различной специфичности.

Согласно другому подходу легкая цепь может быть выбрана путем наблюдения последовательностей легкой цепи в библиотеке фагового дисплея (например, библиотека фагового дисплея, содержащая последовательности вариабельной области легкой цепи человека, например, библиотека scFv человека) и выбора наиболее широко используемой вариабельной области легкой цепи из библиотеки. Легкая цепь может быть исследована на двух разных представляющих интерес тяжелых цепях.

Согласно другому подходу легкая цепь может быть выбрана путем анализа библиотеки фагового дисплея вариабельных последовательностей легкой цепи с использованием вариабельных последовательностей тяжелой цепи обеих представляющих интерес тяжелых цепей в качестве зондов. Легкая цепь, которая ассоциирует с обеими вариабельными последовательностями тяжелой цепи, может быть выбрана в качестве легкой цепи для тяжелых цепей.

Согласно другому подходу кандидатная легкая цепь может быть выравнена с родственными тяжелым цепям легкими цепями, и модификации в легкой цепи получают для более близкого соответствия характеристик последовательностей, общих для родственных легких цепей обеих тяжелых цепей. Если шансы иммуногенности должны быть сведены к минимуму, модификации предпочтительно приводят к последовательностям, которые присутствуют в известных последовательностях легкой цепи человека, таким образом, что протеолитический процессинг вряд ли будет производить эпитоп Т-клеток, основанный на параметрах и способах, известных в настоящей области техники для оценки вероятности иммуногенности (т.е., in silico, а также в мокрых анализах).

Все вышеперечисленные подходы основываются на способах in vitro, которые включают в себя ряд априорных ограничений, например, идентичность последовательности, способность ассоциировать со специфичными предварительно выбранными тяжелыми цепями и т.д. Существует необходимость в настоящей области техники в композициях и способах, которые не основываются на манипулировании условиями in vitro, но которые вместо этого применяют более биологически чувствительные подходы к созданию эпитопсвязывающих белков человека, которые включают общую легкую цепь.

Кроме того, терапевтические антитела, например, биспецифические терапевтические антитела, характеризуются некоторыми ограничениями в том, что они часто требуют высоких доз для достижения желаемой эффективности. Отчасти это связано с тем фактом, что комплексы антитело-антиген поглощаются в эндосомы, и нацеливаются на лизосомальную деградацию в процессе, называемом мишень-опосредованный клиренс. Таким образом, существует необходимость в настоящей области техники в способах и композициях, которые приводят к более эффективной рециркуляции антител, например, рециркуляции биспецифических антител, и предупреждают деградацию антител путем способствования диссоциации комплексов антитело-антиген в эндосомальном компартменте без снижения специфичности и аффинности антитела к антигену.

На вводимые в организм лекарственные средства, включающие в себя терапевтические моноклональные антитела, можно воздействовать с помощью различных механизмов элиминации, включающих в себя клубочковую фильтрацию (например, в мочу), секрецию (например, в желчь) и катаболизм клетками. В то время как низкомолекулярные молекулы выводятся из организма через почечную фильтрацию, большинство секретируемых антител (например, IgG, которые слишком большие для того, чтобы фильтроваться через клубочки) в первую очередь выводятся из организма через опосредованный клетками катаболизм, например, пиноцитоз (фагоцитоз) или рецепторно-опосредованный эндоцитоз. Например, растворимые молекулы с несколькими повторными эпитопами связаны посредством множества циркулирующих антител, и полученные крупные комплексы антиген-антитело быстро фагоцитируют в клетки для деградации. С другой стороны, рецепторы-мишени клеточной поверхности, которые связаны с антителами (т.е. комплексы рецептор-антитело), подвергаются мишень-опосредованному эндоцитозу зависимым от дозы образом, что приводит к образованию эндосом, предназначенных для лизосомальной деградации внутри клеток. В некоторых случаях, эндоцитированные комплексы рецептор-антитело связываются с неонатальными рецепторы Fc (FcRn) внутри эндосом зависимым от pH образом и направляются обратно на поверхность клеток для высвобождения в плазму или интерстициальные жидкости после воздействия нейтральным внеклеточным значением pH (например, pH 7,0-7,4).

В настоящей области техники существует потребность в системах, например, отличных от человека животных, клетках и геномных локусах, которые производят антигенсвязывающие белки с титруемыми остатками, например, генетически модифицированные локусы, которые реаранжируют генные сегменты иммуноглобулина для производства вариабельных доменов тяжелой цепи, которые отвечают на изменения pH, например, которые выступают в качестве доноров или акцепторов протонов, и, например, чьи характеристики связывания отличаются в зависимости от состояния протонирования.

В настоящей области техники существует потребность в способах и композициях, которые могут дополнительно увеличивать рециркулирующую эффективность эндоцитированных антигенсвязывающих белков, способствуя диссоциации антигенсвязывающих белков от комплексов рецептор-антигенсвязывающий белок или путем увеличения аффинности антигенсвязывающих белков по отношению к FcRn в кислом эндосомальном компартменте без ущерба специфичности и аффинности антигенсвязывающего белка по отношению к представляющему интерес антигену.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрены композиции и способы для создания генетически модифицированных животных, которые производят вариабельные домены иммуноглобулина, которые содержат по меньшей мере один остаток гистидина, кодируемый с помощью модификации зародышевой линии отличного от человека животного, причем модификация зародышевой линии содержит по меньшей мере одну вставку гистидинового кодона в сегмента V, D или J тяжелой цепи, вставку гистидинового кодона в сегмент V или J легкой цепи, вставку гистидинового кодона в реаранжированный ген VJ легкой цепи, замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон в сегменте V, D или J тяжелой цепи, замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон в сегменте V или J легкой цепи, замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон в реаранжированной последовательности VJ.

Также предусмотрены композиции и способы для введения кластеров гистидиновых кодонов в зародышевую линию последовательностей иммуноглобулина отличных от человека животных.

Также предусмотрены композиции и способы для введения гистидиновых вставок или замен негистидиновых кодонов на гистидиновые кодоны в N-концевых кодирующих областях генов иммуноглобулинов, кодирующих областях петли 4 генов иммуноглобулинов, кодирующих CDR областях генов иммуноглобулинов (например, реаранжированные последовательности V(D)J или генные сегменты V, (D), J).

Композиции и способы получения потомства отличного от человека животного, которое содержит вставки гистидиновых кодонов и/или замены негистидиновых кодонов на гистидиновые кодоны, как в локусах тяжелой цепи иммуноглобулина, так и локусах легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному аспекту генетически модифицированное отличное от человека животное, содержащее в своей зародышевой линии локус иммуноглобулина, содержащий замену или вставку в вариабельный локус иммуноглобулина по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Согласно одному варианту осуществления вариабельный локус (например, нереаранжированный локус сегментов V(D)J) содержит по меньшей мере часть вариабельного локуса (сегментов (V(D)J) человека).

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное отличное от человека животное содержит в своей зародышевой линии первый вариабельный локус (например, нереаранжированный локус сегментов V(D)J тяжелой цепи иммуноглобулина) и второй вариабельный локус (например, нереаранжированный локус сегментов V, J легкой цепи иммуноглобулина или реаранжированную последовательность VJ легкой цепи иммуноглобулина).

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное содержит первый и второй вариабельный локус, причем по меньшей мере первый или второй вариабельный локус содержит вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона или замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон.

Согласно одному варианту осуществления, как первый, так и второй вариабельный локус содержит замену или вставку по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон.

Согласно одному варианту осуществления первый вариабельный локус содержит по меньшей мере функциональную часть переаранжированного вариабельного локуса тяжелой цепи (нереаранжированные сегменты V, D, J).

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный вариабельный локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере часть локуса человека (нереаранжированные сегменты V, D, J).

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный локус тяжелой цепи представляет собой локус человека, содержащий нереаранжированные сегменты V, синтетический сегмент D, который содержит линкер, и сегмент J человека. Согласно одному варианту осуществления синтетический сегмент D содержит по меньшей мере один кодон гистидина.

Согласно одному варианту осуществления второй вариабельный локус содержит по меньшей мере функциональную часть нереаранжированного локуса легкой цепи (нереаранжированные сегменты V, J).

Согласно одному варианту осуществления второй вариабельный локус содержит реаранжированную последовательность вариабельного гена легкой цепи иммуноглобулина (реаранжированная последовательность VJ).

Согласно одному варианту осуществления замена негистидинового кодона на гистидиновый кодон и/или вставка гистидинового кодона находится в последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельный домен, и гистидин находится в области, выбранной из N-концевой области цепи иммуноглобулина, области петли 4 цепи иммуноглобулина, CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи, CDR3 легкой цепи и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один из первого вариабельного локуса или второго вариабельного локуса функционально связан с эндогенной отличной от человеческой последовательностью нуклеиновой кислоты константной области в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления первый вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, D, J человека) функционально связан с эндогенной отличной от человеческой последовательностью нуклеиновой кислоты константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления первый вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, D, J человека) функционально связан с эндогенной отличной от человеческой последовательностью нуклеиновой кислоты константной области тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления второй вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, J) функционально связан с эндогенной отличной от человеческой последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления эндогенная отличная от человеческой последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина находится в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельной области содержит кластер из 2, 3, 4 или 5 гистидинов, которые представляют собой замены негистидиновых кодонов на гистидиновые кодоны и/или вставки кодонов гистидина.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированный локус тяжелой цепи содержит генные сегменты D, которые инвертированы по отношению к направлению ориентации локуса тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления инвертированные сегменты D находятся в гидрофильной рамке считывания.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное, содержащее по меньшей мере часть нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (нереаранжированные сегменты V, D, J), функционально связанную с генной последовательностью константной области, причем один или несколько генных сегментов V, D и J содержат по меньшей мере одну замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон или по меньшей мере одну вставку гистидинового кодона; по меньшей мере часть нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (нереаранжированные сегменты V, J), функционально связанную с генной последовательностью константной области, причем один или несколько генных сегментов V и J содержат по меньшей мере одну замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон или одну вставку гистидинового кодона; причем отличное от человека животное экспрессирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, который содержит гистидин, полученный из замены или вставки гистидина в зародышевую линию мыши.

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированная последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связана с отличной от человеческой последовательностью константной области.

Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой последовательность нуклеиновой кислоты константной области, функционально связанная с нереаранжированной последовательностью нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, находится в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина в зародышевой линии отличного от человека животного.

Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой последовательность нуклеиновой кислоты константной области, функционально связанная с нереаранжированной последовательностью нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, находится в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина в зародышевой линии отличного от человека животного.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное, содержащее по меньшей мере часть нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (нереаранжированные сегменты V, D, J), функционально связанную с генной последовательностью константной области, причем один или несколько нереаранжированных генных сегментов V, D и J содержат по меньшей мере одну замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон или по меньшей мере одну вставку гистидинового кодона; реаранжированную последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (реаранжированная последовательность VJ), функционально связанную с генной последовательностью константной области легкой цепи, причем реаранжированная последовательность VJ содержит по меньшей мере одну замену негистидинового кодона на гистидиновый кодон или одну вставку гистидинового кодона; причем отличное от человека животное экспрессирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, который содержит гистидин, полученный из замены или вставки гистидина в зародышевую линию мыши.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному варианту осуществления нереаранжированная последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связана с отличной от человеческой последовательностью константной области. Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой последовательность константной области, функционально связанная с нереаранжированной последовательностью нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, находится в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина в зародышевой линии отличного от человека животного. Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой последовательность константной области, функционально связанная с реаранжированной последовательностью нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, находится в эндогенном отличном от человеческого локусе иммуноглобулина в зародышевой линии отличного от человека животного.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное, причем животное содержит популяцию В-клеток, которая характеризуется повышенным наличием остатков гистидина в тяжелых и легких цепях иммуноглобулина популяции В клеток, по сравнению с отличным от человека животным дикого типа. Согласно одному варианту осуществления повышение представляет собой повышение приблизительно в 2-4 раза. Согласно одному варианту осуществления повышение представляет собой повышение приблизительно в 2-10 раз.

Согласно одному аспекту предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное, которое экспрессирует легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина, которые содержат гистидины, кодируемые заменами и/или вставками в последовательности иммуноглобулина зародышевой линии отличного от человека животного.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения отличного от человека животного, которое производит вариабельные домены антител с гистидинами, кодируемыми гистидиновыми кодонами зародышевой линии, предусматривающий: модификацию отличного от человека животного в его зародышевой линии для включения по меньшей мере одной замены гистидиновым кодоном негистидинового кодона или вставки гистидинового кодона в нереаранжированный вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, D, J) тяжелой цепи иммуноглобулина; и модификацию отличного от человека животного в его зародышевой линии для включения по меньшей мере одной замены гистидиновым кодоном негистидинового кодона или вставки гистидинового кодона в нереаранжированный вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, J) легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает генетическую модификацию зародышевой линии мыши для включения по меньшей мере части нереаранжированного вариабельного локуса (сегменты V, D, J) тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и получение замены или вставки гистидина в нереаранжированном вариабельном локусе (нереаранжированных сегментах V, D, J) тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает генетическую модификацию зародышевой линии мыши для включения по меньшей мере части нереаранжированного вариабельного локуса (нереаранжированных сегментов V, J) легкой цепи иммуноглобулина человека, и получение замены или вставки гистидина в нереаранжированном локусе легкой цепи иммуноглобулина человека.

Согласно одному варианту осуществления способа отличное от человека животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ для получения отличного от человека животного, которое производит вариабельные домены антител с гистидинами, кодируемыми гистидиновыми ко донами зародышевой линии, предусматривающий: модификацию отличного от человека животного для включения по меньшей мере одной замены гистидиновым кодоном негистидинового кодона или вставки гистидинового кодона в нереаранжированный вариабельный локус (нереаранжированные сегменты V, D, J) тяжелой цепи иммуноглобулина; и модификацию отличного от человека животного для включения по меньшей мере одной замены гистидиновым кодоном негистидинового кодона или вставки гистидинового кодона в нереаранжированную вариабельную последовательность (реаранжированная последовательность VJ) легкой цепи иммуноглобулина в зародышевую линию.

Согласно одному варианту осуществления способа отличное от человека животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка.

Согласно различным аспектам и вариантам осуществления отличные от человека животные представляют собой генетически модифицированные с помощью генетической модификации плюрипотентных или тотипотентных клеток (например, эмбриональных стволовых (ES) клеток), а также использования генетически модифицированных клеток в качестве донорских клеток с эмбрионом-хозяином в суррогатной матери для вынашивания животного, полученного из генетически модифицированных донорских клеток. Согласно различным аспектам и вариантам осуществления отличные от человека животные представляют собой генетически модифицированные любым другим известным в настоящей области техники способом.

Предусмотрены способы и композиции для получения вариабельных доменов антител, которые проявляют зависимое от pH связывание антигена. Предусмотрены модифицированные антигенсвязывающие белки, а также композиции и способы для их получения, которые связывают антиген-мишень с низкой аффинностью при низком (например, эндосомальном) значении pH и которые связывают тот же антиген-мишень с высокой аффинностью при более высоком (например, внеклеточном) или нейтральном значении pH.

Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения антитела, которое проявляет зависимое от pH связывание, предусматривающий модификацию последовательности вариабельного домена антитела для добавления остатка гистидина или замены существующего остатка на остаток гистидина с образованием вариабельного домена с модифицированным гистидином. Согласно одному варианту осуществления замена представляет собой замену остатка, который не критичен для связывания антигена (например, при нейтральном или внеклеточном значении pH).

Согласно одному варианту осуществления два, три, четыре, пять или шесть или более остатков заменяют на гистидины. Согласно одному варианту осуществления два, три, четыре, пять, шесть или более замененных на гистидины остатков находятся в кластере. Согласно одному варианту осуществления кластер содержит две или более последовательных замен гистидина. Согласно одному варианту осуществления кластер содержит две или более гистидиновые замены, разделенные одним или несколькими негистидиновыми остатками. Согласно одному варианту осуществления кластер составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков в длину, и все остатки не критичные для связывания антигена (например, при нейтральном или внеклеточном значении pH), модифицированы на гистидин.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи (например, κ или λ). Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен находится в вариабельном домене тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи модифицирована.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена представляет собой последовательность CDR. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR тяжелой цепи и последовательность CDR легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR3. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR2. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR3.

Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность CDR представляет собой последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена антитела представляет собой последовательность петли 4. Согласно одному варианту осуществления последовательность петли 4 представляет собой последовательность петли 4 тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления последовательность петли 4 представляет собой последовательность петли 4 легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена антитела представляет собой N-концевую последовательность. Согласно одному варианту осуществления N-концевая последовательность представляет собой N-концевую последовательность тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления N-концевая последовательность представляет собой N-концевую последовательность легкой цепи.

Согласно одному варианту осуществления последовательность вариабельного домена антитела выбирают из последовательности CDR тяжелой цепи, последовательности CDR легкой цепи, последовательности петли 4 тяжелой цепи, последовательности петли 4 легкой цепи, N-концевой последовательности тяжелой цепи, N-концевой последовательности легкой цепи и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен происходит из тяжелой цепи, и последовательность вариабельного домена содержит первую последовательность CDR и последовательность, выбранную из N-концевой последовательности, последовательности петли 4, второй последовательности CDR, третьей последовательности CDR и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления первая последовательность CDR представляет собой CDR3, и последовательность вариабельного домена дополнительно содержит последовательность, выбранную из N-концевой последовательности, последовательности петли 4, последовательности CDR2, последовательности CDR1 и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен с модификацией гистидина происходит из тяжелой цепи, и модификация гистидина находится в последовательности петли 4 и последовательности, выбранной из последовательности CDR1 или CDR2 или CDR3, N-концевой, а также их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления модификация гистидина находится в последовательности петли 4 и последовательности CDR3. Согласно конкретному варианту осуществления модификация гистидина находится в последовательности петли 4 и последовательности CDR3 и N-концевой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления модификация гистидина находится в последовательности петли 4 и N-концевой последовательности.

Согласно одному аспекту предусмотрен описанный в настоящем документе вариабельный домен иммуноглобулина с модифицированным гистидином, причем вариабельный домен иммуноглобулина с модифицированным гистидином, который не связывается с представляющим интерес антигеном или который связывается с представляющим интерес антигеном с первой аффинностью при значении pH менее 6; и связывается с тем же представляющим интерес антигеном со второй аффинностью при значении pH приблизительно 7 или более. Согласно одному варианту осуществления первое значение pH меньше 5,5 или меньше, чем 5. Согласно одному варианту осуществления первое значение pH равно 5,75. Согласно одному варианту осуществления второе значение pH равно приблизительно 7 или выше. Согласно одному варианту осуществления второе значение pH представляет собой значение внеклеточного pH человека. Согласно одному варианту осуществления второе значение pH от 7,2 до 7,4. Согласно конкретному варианту осуществления второе значение pH составляет 7,2.

Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен с модифицированным гистидином содержит один, два, три, четыре, пять или шесть или больше гистидиновых замен в последовательности, выбранной из CDR, N-концевой, петли 4 и их комбинации. Согласно конкретному варианту осуществления вариабельный домен с модифицированным гистидином содержит модификацию в CDR3. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен с модифицированным гистидином содержит модификацию, выбранную из модификации CDR3 в тяжелой цепи, модификации CDR3 в легкой цепи и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления вариабельный домен с моди