Векторы, кодирующие фактор жизнеспособности колбочек, полученный из палочек

Векторы, кодирующие фактор жизнеспособности колбочек, полученный из палочек

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Информация о грантах

Изобретение осуществлено при правительственной поддержке грант SBIR Grant No. EY016262, полученного от Department of Health and Human Services of the United States of America, National Institutes of Health. Правительство может иметь определенные права на настоящее изобретение.

Уровень техники

RdCVF представляет собой тиоредоксин-подобный белок, специфически экспрессируемый палочковидными фоторецепторными зрительными клетками в сетчатке (Léveillard et al. (2004) Nature Genetics 36:755-759 и вспомогательная информация). У людей обнаружено два различных гена RdCVF, и они обозначаются RdCVF1 и RdCVF2. Оба гена RdCVF кодируют два продукта посредством альтернативного сплайсинга: полноразмерный белок и C-концевой посттранскрипционно усеченный белок, известные как RdCVF-длинный и RdCVF-короткий, соответственно.

RdCVF-короткий описывают как секретируемый трофический фактор, способствующий выживаемости колбочек, а RdCVF-длинный - как окислительно-восстановительно-активный фермент, который взаимодействует с внутриклеточными белками (Léveillard et al. (2010) Sci Transl Med. 2(26): 26psl6). Например, тау-белок описывается как партнер по связыванию для RdCVF-L, и тау-белок является исключительно внутриклеточным (Fridlich et al. (2009) Molecular & Cellular Proteomics 8(6): 1206-18).

Индивидуумы, страдающие некоторыми видами дистрофии сетчатки, как обнаружено, имеют более низкие уровни белка RdCVF в их глазах, чем у индивидуумов, у которых нет дистрофии сетчатки (публикация PCT WO 02/081513).

Продемонстрировано, что различные формы белка RdCVF могут способствовать выживаемости колбочковидных фоторецепторных зрительных клеток in vitro и in vivo. Например, внутриглазные инъекции короткой формы белка RdCVF1 человека (RdCVF1S) не только спасают колбочковидные зрительные клетки от дегенерации, но также сохраняют их функцию на животных моделях наследственной дегенерации сетчатки (Yang et al. (2009) Mol Therapy 17: 787-795). Однако демонстрация защитного воздействия этого белка на колбочковидные зрительные клетки in vivo требует использования множества внутриглазных инъекций.

Экспрессирование значительных уровней RdCVF в масштабе и из векторов для генной терапии является проблемой; см., например, публикацию патента США № 20110034546, абзац [0004].

Цитирование или обсуждение ссылки в настоящем документе не должно рассматриваться как признание того, что она представляет собой предыдущий уровень техники для настоящего изобретения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, частично, к нуклеиновым кислотам, кодирующим RdCVF, к конструктам экспрессирования RdCVF, к векторам RdCVF, к способам экспрессирования RdCVF, к способам замедления, предотвращения или ингибирования гибели фоторецепторных клеток (например, колбочковидных и/или палочковидных зрительных клеток), к лечению глазных заболеваний, таких как дистрофия сетчатки, и к лечению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона или заболевания органов обоняния.

Настоящее изобретение предлагает композиции, способы экспрессирования белков RdCVF из клетки (клеток) и способы лечения.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предлагают нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеотидов, которая кодирует кодирующую последовательность для белка RdCVF, где кодирующая последовательность RdCVF содержит перекодированную последовательность нуклеотидов.

Настоящее изобретение также включает вирусные векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует кодирующую последовательность для белка RdCVF, где кодирующая последовательность RdCVF содержит перекодированную последовательность нуклеотидов.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к изолированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к белку RdCVF, продуцируемому клеткой по настоящему изобретению или из нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления белок RdCVF представляет собой не встречающуюся в природе последовательность аминокислот RdCVF.

Включенными в настоящее изобретение также являются фармацевтические средства, содержащие (i) фармацевтически приемлемый носитель и (ii) нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, вирусный вектор по настоящему изобретению, белок RdCVF по настоящему изобретению или их сочетание.

Также предлагаются способы получения белка RdCVF, включающие культивирование клетки по настоящему изобретению при условиях, которые дают возможность для экспрессирования и секретирования белка RdCVF и выделения белка RdCVF из культуры клеток.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам сохранения палочковидных зрительных клеток, включающим введение в глаз млекопитающего нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вирусного вектора по настоящему изобретению, белка RdCVF по настоящему изобретению или их сочетания.

Настоящее изобретение также предлагает способы лечения таких заболеваний, как дистрофия сетчатки, дегенерация желтого пятна Штаргардта, пигментная дистрофия сетчатки, сухая возрастная макулярная дегенерация (сухая AMD), географическая атрофия сетчатки (поздняя стадия сухой AMD), влажная возрастная макулярная дегенерация (влажная AMD), глаукома с внутриглазной гипертонией или без нее, диабетическая ретинопатия, синдром Барде-Бидля, синдром Бессена-Корнцвейга, болезнь Беста, хороидеремия, гиратная атрофия, врожденный амавроз, синдром Рефсума, синдром Уше, глазное заболевание, связанное со щитовидной железой, Базедова болезнь, заболевание, связанное с пигментированными эпителиальными клетками сетчатки, заболевание переднего сегмента, заболевание/катаракта хрусталика, расстройство глазной чаши, увеит, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона или заболевание органов обоняния.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам сохранения палочковидных зрительных клеток, включающим введение в глаз млекопитающего нуклеиновой кислоты и/или вирусного вектора по настоящему изобретению, где нуклеиновая кислота и/или вирусный вектор вводятся посредством субретинальной инъекции и палочковидные зрительные клетки сохраняются в области, отличной от области субретинальной инъекции.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам сохранения колбочковидных зрительных клеток, включающим введение в глаз млекопитающего нуклеиновой кислоты и/или вирусного вектора по настоящему изобретению, где нуклеиновая кислота и/или вирусный вектор вводятся посредством субретинальной инъекции и колбочковидные зрительные клетки сохраняют в области, отличной от области субретинальной инъекции.

Настоящее изобретение также предлагает способы секретирования белка RdCVF из клетки, включающие введение в клетку нуклеиновой кислоты или вирусного вектора по настоящему изобретению.

Белок RdCVF может представлять собой RdCVF1 или белок RdCVF2, или длинную или короткую версию.

Предполагается, что любой способ или композиция, описанные в настоящем документе, могут осуществляться по отношению к любому другому способу или композиции, описанным в настоящем документе. Использование терминов, обозначающих единственное число, когда они используются в сочетании с термином "включающий" в формуле изобретения и/или в описании, может обозначать "один", но также согласуется с обозначением "один или несколько", "по меньшей мере один" и "один или больше одного". Использование термина/фразы "и/или", когда ее используют при перечислении, означает, что можно использовать один или несколько перечисленных объектов, например, что это использование не ограничивается одним или всеми элементами.

Настоящее описание сущности изобретения необязательно описывает все признаки или необходимые признаки настоящего изобретения. Настоящее изобретение может также состоять в некотором выборочном сочетании описываемых признаков.

Краткое описание фигур

Для цели иллюстрации настоящего изобретения на чертежах изображены определенные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается именно теми системами и инструментариями вариантов осуществления изобретения, которые изображены на чертежах.

Фиг. 1 показывает SDS-PAGE анализ очищенных частиц рекомбинантного вектора AAV-RdCVF1L и AAV-GFP. Белки препарата rAAV-GFP (полоса 1) и двух препаратов rAAV-RdCVF1L (полоса 2 и 3) разделяются с помощью SDS-PAGE и визуализируются с помощью анализа с окрашиванием серебром.

Фиг. 2 показывает Вестерн-блот анализ экспрессирования RdCVF1L в клетках ARPE-19, трансдуцированных вектором rAAV-RdCVF1L. Лизат клеток (Фиг. 2A) и супернатант (Фиг. 2B) клеток ARPE-19, трансдуцированных rAAV, разделяют с помощью SDS-PAGE и осуществляют Вестерн-блот по отношению к белку RdCVF1L. Полоса 1 показывает лизат нетрансдуцированных клеток ARPE-19 (Фиг. 2A) и супернатант для контроля (Фиг. 2B), полоса 2 и полоса 3 показывают лизаты клеток (Фиг. 2A) и супернатант (Фиг. 2B) клеток ARPE-19, трансдуцированных rAAV-GFP и rAAV-RdCVF1L, соответственно.

Фиг. 3 показывает подтверждение повышенного экспрессирования RdCVF в глазах после инъекции rAAV-RdCVF1L по сравнению с rAAV-GFP и нелечеными глазами нормальных мышей Balb/C с помощью Вестерн-блот через шесть недель после инъекции векторов. Экстракты белков из клеток ARPE-19, трансдуцированных rAAV-RdCVF1L, используют в качестве положительного контроля (полоса 14 и 17), в то время как экстракт нетрансдуцированных клеток используют в качестве отрицательного контроля (полоса 15). Белок RdCVF детектируют в глазах после инъекции rAAV-RdCVF1L (полоса 6, 8, 10 и 12), в то время как в нелеченых контралатеральных глазах тех же животных, а также в глазах после инъекции rAAV-GFP (полоса 2-5), наблюдают отсутствие или только слабое присутствие зон, соответствующих RdCVF (полоса 7, 9, 11 и 13). Полоса 1 представляет собой стандартный белковый маркер. Полоса 16 представляет собой экстракт белков из нормального глаза мыши дикого типа.

Фиг. 4 показывает иммуногистохимическое окрашивание RdCVF в клетках RPE RPE-хориоидно-склеральных препаратов на плоской поверхности. Устойчивое экспрессирование RdCVF наблюдают в глазу после инъекции rAAV-RdCVF1L у нормальных мышей Balb/C через шесть недель после инъекции вектора (Фиг. 4A), но не в контралатеральном глазу без инъекции (Фиг. 4B). Не наблюдается иммунной реакции в образце, обработанном без первичного антитела (Фиг. 4C). Препараты на плоской поверхности контрастно окрашивают с помощью DAPI, чтобы показать ядра клеток в голубом цвете.

Фиг. 5 показывает иммуногистохимическое окрашивание RdCVF1L нейроретинальных препаратов на плоской поверхности. Наблюдают устойчивое экспрессирование RdCVF1L фоторецепторных клеток в глазу после инъекции rAAV-RdCVF1L для нормальных мышей Balb/C через шесть недель после инъекции вектора (Фиг. 5A). Большая часть окрашивания находится на наружных сегментах фоторецепторных клеток. В противоположность этому, в фоторецепторных клетках контралатерального глаза без инъекции видно только фоновое окрашивание (Фиг. 5B). Не наблюдается иммунной реакции в образцах, обработанных без первичного антитела (Фиг. 5C).

Фиг. 6 показывает результаты исследований, которые демонстрируют экспрессирование RdCVF1L в клетках RPE и фоторецепторных клетках через 5 недель после субретинальной инъекции AAV-RdCVF1L на мышах rd10. Клетки RPE, экспрессирующие RdCVF, видны приблизительно для половины RPE-хориоидно-склеральных препаратов на плоской поверхности с вектором rAAV-RdCVF1L для глаза после инъекции (A), но не для контралатерального глаза (B) без инъекции. Фоторецепторные клетки (C) также трансдуцируются как сегменты, экспрессирующие RdCVF, они наблюдаются на препарате на плоской поверхности сетчатки для того же глаза. В противоположность этому, экспрессирования RdCVF в контралатеральном глазу (D) без инъекции не наблюдается. Темно-зеленые клетки в (D) вероятно представляют собой аутофлуоресцентные макрофаги, прилипшие к сетчатке. При большом увеличении видны трансдуцированные клетки RPE (E), сохраняющие типичную гексагональную морфологию, и фоторецепторные сегменты (F), экспрессирующие RdCVF.

Фиг. 7 показывает спасение фоторецепторов посредством субретинальной инъекции AAV-RdCVF1L на мышах rd10. Фотографии, сделанные под оптическим микроскопом, репрезентативных ретинальных срезов от 2 мышей, у которых правые глаза принимали rAAV-RdCVF1L в день 3 после рождения (A и C), а левые глаза (B и D) служили в качестве нелеченых контролей. Мышей rd10 умерщвляли в возрасте 5 недель. Нужно отметить разницу в толщине наружного ядерного слоя (ONL) между лечеными (двусторонние стрелки) и нелечеными глазами (односторонние стрелки). Имеются 2-4 ряда в глазах, леченых AAV-RdCVF (A и C), по сравнению с 1 рядом в нелеченых глазах (B и D). Фоторецепторные внутренние и наружные сегменты остаются в некоторых областях защищенной сетчатки (E). IS, внутренние сегменты; OS, наружные сегменты; ONL, наружный ядерный слой.

Фиг. 8 показывает фотографию, сделанную под оптическим микроскопом глазной чаши от репрезентативной мыши rd10 в возрасте 5 недель, которая принимала субретинальную инъекцию rAAV-RdCVF1L в одном глазу (Панель A, Фиг. 8), и никакого лечения в контралатеральном глазу (Панель B, Фиг. 8). Как показано, больше фоторецепторных клеток сохраняется в леченом глазу.

Фиг. 9 показывает аннотированную последовательность нуклеотидов rAAV-RdCVF1L.

Фиг. 10A: Доставка rAAV-RdCVF1L улучшает ретинальную функцию у мышей rd10. ERG осуществляют приблизительно через 5 недель после инъекции rAAV-RdCVF1L. Измерения реакций ERG у всех 8 мышей, которых исследовали авторы, показывает, что средние амплитуды b-волны от леченых глаз примерно в 3 раз больше амплитуд от нелеченых вторых глаз, что является статистически значимым (p=0,025).

Фиг. 10B: Доставка rAAV-RdCVF1L улучшает ретинальные функции у мышей rd10. ERG осуществляют приблизительно через 5 недель после инъекции rAAV-RdCVF1L. Правая панель: это средние значения по восьми сигналам от леченого глаза (черная линия, n=8) и от нелеченого второго глаза (красная линия, n=8), которые регистрируют при интенсивности одиночных световых вспышек на темном фоне 25 кд⋅с/м². Очевидно, что леченые глаза имеют гораздо более высокий отклик, чем вторые глаза. Левая панель: измерение реакций ERG от всех 8 мышей, которые исследуют авторы, показывают, что средние амплитуды b-волны от леченых глаз примерно в 3 раз больше амплитуды от нелеченых вторых глаз, что является статистически значимым (p=0,025).

Фиг. 11A и 11B: Сохранение фоторецепторов с помощью субретинальной инъекции rAAV-RdCVF1L у мышей rd10. Фотографии, сделанные под оптическим микроскопом, ретинальных сечений от мышей, у которых правый глаз принимает rAAV-RdCVF1L в день 3 после рождения (A), а левый глаз (B) служит в качестве нелеченых контролей. Нужно отметить разницу в толщине ONL между леченым и нелеченым глазом. Имеется примерно 4 ряда в леченом глазу (A) по сравнению с 1 рядом в нелеченых глазах (B). Наружные сегменты фоторецепторов остаются в некоторых областях защищенной сетчатки; ONL, наружный ядерный слой.

Фиг. 12: Сравнение толщины наружного ядерного слоя (ONL) в глазах мышей rd10, леченых rAAV-RdCVF1L, и для нелеченых глаз. Средняя толщина ONL в леченых глазах (красный столбик) значимо больше (P=0,006), чем для нелеченых глаз (черный столбик). Числа представляют собой среднее значение + SD (среднеквадратичное отклонение).

Подробное описание

Как используется в настоящем документе, переходной термин "включающий" является открытым. Пункт формулы изобретения, использующий этот термин, может содержать элементы в дополнение к тем, которые упоминаются в таком пункте. Таким образом, например, пункты формулы изобретения могут читаться относительно способов, которые также включают другие стадии, не упоминаемые в них конкретно, постольку поскольку присутствуют их упоминаемые элементы или эквивалент.

Термины "идентичность" и "идентичный", когда используются в контексте сравнения двух последовательностей, таких как последовательности нуклеотидов или аминокислот, относятся к проценту последовательности, который совпадает для двух последовательностей. Процент идентичности может определяться с помощью алгоритмов, обычно используемых специалистами в данной области. Например, процент идентичности может быть определен с использованием инструментов и программ, доступных от National Center for Biotechnology Information (NCBI), как доступно на их веб-сайте. Процент идентичности двух последовательностей нуклеотидов может быть определен, например, с использованием набора NCBI/BLAST/blastn. Blastn может использоваться с параметрами, установленными при: expect threshold=10; word size=28; max matches in a query range=0; match/mismatch scores=1,-2; gap costs= existence:5 extension:2.

Публикации PCT WO 2002/081513, WO 2008/148860 и WO 2009/146183 описывают разнообразные композиции и способы, относящиеся к RdCVF. В некоторых случаях композиции и способы, относящиеся к RdCVF, описанные в публикациях PCT WO 2002/081513, WO 2008/148860 и WO 2009/146183, могут использоваться, например, для замены нуклеиновой кислоты, кодирующей RdCVF, вектора или белка, нуклеиновой кислотой, вектором или белком по настоящему изобретению, например, нуклеиновыми кислотами и векторами, содержащими кодирующую последовательность RdCVF дикого типа.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предлагают последовательности аминокислот пробелков RdCVF, такие как SEQ ID NO:2 и 4. Настоящее изобретение также предлагает последовательности нуклеотидов, кодирующие пробелки RdCVF, такие как SEQ ID NO:1, 3 и 11.

Настоящее изобретение также предлагает способы лечения заболевания у субъекта, где заболевание опосредуется изменением экспрессирования гена RdCVF1 или RdCVF2 или связано с ним (например, уменьшения присутствия полипептида RDCVF1 или RDCVF2 в глазу), посредством введения терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты или вектора, кодирующего белок RDCVF1 или RdCVF2, или родственный белок, или его фрагмент или часть, субъекту.

В другом аспекте белок RdCVF, нуклеиновая кислота, вектор или композиция по настоящему изобретению могут использоваться при приготовлении лекарственного средства, например, для лечения заболеваний, перечисленных в настоящем документе.

Продукты, композиции, процессы и способы по настоящему изобретению могут использоваться, среди прочего, для исследовательских, биологических, клинических или терапевтических целей.

RdCVF

Продемонстрировано, что белок RdCVF может способствовать выживаемости колбочковидных фоторецепторных зрительных клеток in vitro и in vivo. Например, внутриглазные инъекции короткой формы белка RdCVF1 (RdCVF1S) человека не только спасают колбочковидные зрительная клетки от дегенерации, но также сохраняют их функцию на животных моделях с наследственной дегенерацией сетчатки. (Yang et al. (Mol Therapy (2009) 17: 787-795 и дополнительный материал). RdCVF экспрессируется несколькими типами клеток, включая палочковидные фоторецепторные зрительные клетки в сетчатке (Léveillard et al. (2004) Nature Genetics 36: 755-759).

Два различных гена RdCVF обнаружены у людей и других млекопитающих, и они обозначаются RdCVF1 и RdCVF2. Оба гена RdCVF кодируют два продукта посредством альтернативного сплайсинга: полноразмерный белок и C-концевой усеченный белок, известные как длинный RdCVF и короткий RdCVF соответственно.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает перекодированную кодирующую последовательность RdCVF. Перекодированная кодирующая последовательность RdCVF может кодировать любой белок RdCVF, включая любой белок из тех, которые описаны в настоящем документе. Последовательности для разнообразных белков RdCVF можно найти в публикациях PCT №№ WO 2002081513 и WO 2010029130; Chalmel et al. (BMC Molecular Biology (2007) 8: 74 pp 1-12 и вспомогательная информация); Léveillard et al. (Nature Genetics (2004) 36: 755-759 и вспомогательная информация); Yang et al. (Mol Therapy (2009) 17: 787-795 и дополнительный материал) и GenBank Accession No. NP_612463, AAH14127, Q96CM4, EAW84608, CAD67528, Q5VZ03, NP_001155097, NP_660326, CAM24748, CAM14247, AAH22521 и CAD67531. (Для ясности, все эти последовательности GenBank, а также все другие патентные и непатентные публикации, обсуждаемые в настоящем документе, включаются в качестве ссылок во всей их полноте.)

В некоторых вариантах осуществления белок RdCVF представляет собой фрагмент или аналог белка RdCVF, который сохраняет активность выживаемости или защитное воздействие колбочковидной зрительной клетки и/или палочковидной зрительной клетки. Способы измерения этих активностей или воздействий известны в данной области. Например, Léveillard et al. (Nature Genetics (2004) 36: 755-759 и вспомогательная информация) описывают соответствующие модели мышей и способы in vitro детектирования активности RdCVF. Белок RdCVF или RdCVF, кодируемый нуклеиновой кислотой, может иметь последовательность аминокислот иную, чем встречающаяся в природе последовательность аминокислот. Например, белок RdCVF, который не встречается в природе, может содержать аминокислоты в дополнение к тем, Которые находятся в белке RdCVF, встречающемся в природе (например, на амино- или карбокси-конце), и/или может содержать одно или множество замещений аминокислот (например, консервативные или неконсервативные замещения аминокислот) по сравнению с последовательностью аминокислот RdCVF, встречающейся в природе. Консервативное замещение аминокислоты, как правило, не изменяет заметно структурных характеристик исходной последовательности (например, аминокислота замещения не должна иметь тенденцию к разрыву спирали, которая существует в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, которые характеризуют исходную последовательность). Примеры наблюдаемых в данной области вторичных и третичных структурах полипептидов описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et al. Nature 354: 105 (1991). Консервативные замещения включают, но не ограничиваясь этим, замещения из следующих групп: кислотные остатки Asp (D) и Glu (E); основные остатки Lys (K), Arg (R) и His (H); гидрофильные незаряженные остатки Ser (S), Thr (T), Asn (N) и Gln (Q); алифатические незаряженные остатки Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L) и Ile (I); неполярные незаряженные остатки Cys (C), Met (M) и Pro (P); ароматические остатки Phe (F), Tyr (Y) и Trp (W); остатки, содержащие группу спирта, S и T; алифатические остатки I, L, V и M; циклоалкенил-ассоциированные остатки F, H, W и Y; гидрофобные остатки A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W и Y; отрицательно заряженные остатки D и E; полярные остатки C, D, E, H, K, N, Q, R, S и T; положительно заряженные остатки H, K и R; малые остатки A, C, D, G, N, P, S, T и V; очень малые остатки A, G и S; остатки, вовлеченные в образование петель, A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P и T; и гибкие остатки Q, T, K, S, G, P, D, E и R. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, не встречающийся в природе белок RdCVF имеет дополнительные аминокислоты на амино-конце, например, дополнительные аминокислоты от гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах осуществления белок RdCVF по настоящему изобретению сначала транслируется с кодирующей последовательности нуклеотидов с помощью сигнального пептида, и в некоторых случаях все аминокислоты сигнального пептида или их часть сохраняются на экспрессируемом и/или секретируемом белке RdCVF по настоящему изобретению.

Перекодированные последовательности, кодирующие RdCVF

Термин "перекодированный" или "перекодированная последовательность нуклеотидов" означает, что по меньшей мере один нативный кодон заменен на отличный кодон, который кодирует такую же аминокислоту, как и нативный кодон. В некоторых вариантах осуществления перекодированная область, кодирующая RdCVF, имеет по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% перекодированных кодонов. В некоторых вариантах осуществления примерно 20-50%, 35-45%, 38-42% или 39-41% кодонов являются перекодированными. В некоторых вариантах осуществления перекодированный кодон заменяется кодоном, который с большим преобладанием используется у людей. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% кодонов заменяются кодоном, который с большим преобладанием используется у людей.

В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность имеет в пределах примерно 70-90%, примерно 75-85%, примерно 80-85% или примерно 82-85% идентичность с соответствующей нативной кодирующей последовательностью. В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность нуклеотидов имеет по меньшей мере 15% нуклеотидов, отличающихся от нуклеотидов, по сравнению с соответствующей нативной последовательностью нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность нуклеотидов является менее чем на 90% идентичной с соответствующей нативной последовательностью нуклеотидов.

Перекодирование может также использоваться для изменения химического восполнения кодирующей последовательности ДНК и/или РНК, например, процентного содержания гуанина/цитозина (GC). В некоторых вариантах осуществления перекодирование области, кодирующей RdCVF, повышает содержание GC по меньшей мере до 60%. В некоторых вариантах осуществления перекодированная область, кодирующая RdCVF, имеет процентное отношение GC в пределах 60-64% или 60,4%-63,5%.

Перекодирование может использоваться для изменения вторичной структуры мРНК. Перекодирование может также использоваться для удаления или добавления конкретных мотивов или сайтов в кодирующую последовательность или молекулу нуклеиновой кислоты, таких как ингибиторные мотивы прокариотов, консенсусные сайты доноров сплайсированного фрагмента, сайты скрытых доноров сплайсированного фрагмента или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность, кодирующая RdCVF, имеет меньше ингибиторных мотивов прокариотов, консенсусных сайтов доноров сплайсированного фрагмента, сайтов скрытых доноров сплайсированного фрагмента или их сочетаний, чем нативная последовательность. В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность, кодирующая RdCVF, не содержит ингибиторных мотивов прокариотов, консенсусных сайтов доноров сплайсированного фрагмента и/или сайтов скрытых доноров сплайсированного фрагмента.

Hoover et al. (Nucleic Acids Res. (2002) 30:e43, pp 1-7); Fath et al. (PLoS ONE (2011) 6:e17596 pp 1-14); Graf et al. (J Virol (2000) 74: 10822-10826; Raab et al. Syst Synth Biol (2010) 4: 215-225; и заявка на патент США 20070141557 описывают перекодированные кодирующие области.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, перекодированная последовательность, кодирующая RdCVF, не содержит начального ATG кодона RdCVF и/или стоп-кодона RdCVF (например, TAG). Например, перекодированная последовательность, кодирующая RdCVF, может функционально связываться через 5' или 3' с другой кодирующей последовательностью, с получением в результате белка, содержащего гетерологичную последовательность аминокислот, N-концевую и/или C-концевую, с последовательностью аминокислот RdCVF, соответственно. В некоторых из этих вариантов осуществления, начальный кодон ATG RdCVF и/или стоп-кодон RdCVF может подвергаться делеции или присутствовать в области кодирования RdCVF. Например, см. SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3. Если другая кодирующая последовательность сливается на рамке на 3'-конце области кодирования RdCVF, тогда нативный стоп-кодон RdCVF, как правило, не будет присутствовать на конце последовательности, кодирующей RdCVF.

В некоторых вариантах осуществления перекодированная область, кодирующая RdCVF, содержит нуклеотиды 106-741 из SEQ ID NO:1, нуклеотиды 106-429 из SEQ ID NO:1, нуклеотиды 106-432 из SEQ ID NO:3 или нуклеотиды 106-744 из SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах осуществления перекодированная последовательность, кодирующая RdCVF, представляет собой перекодированную последовательность, которая кодирует аминокислоты 36-246 из SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность по настоящему изобретению кодирует белок, содержащий сигнальную последовательность.

Сигнальные пептиды/сигналы секретирования

Сигнальные последовательности транслируются на рамке как присоединенный пептид, как правило, на амино-концевом конце выбранного полипептида. Секреторная сигнальная последовательность вызовет секретирование полипептида из клетки посредством взаимодействия с механизмами клетки хозяина. В качестве части процесса секретирования, эта секреторная сигнальная последовательность, как правило, будет отщепляться или по меньшей мере частично отщепляться. Термин "сигнальная последовательность" также относится к последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность является гетерологичной по сравнению с конкретным RdCVF.

Структура типичного сигнального пептида может включать три различных области: (i) N-концевую область, которая содержит ряд положительно заряженных аминокислот (например, лизинов и аргининов); (ii) центральную гидрофобную сердцевинную область (h-область); (iii) область гидрофильного расщепления (c-область), которая содержит мотив последовательности, распознаваемый сигнальной пептидазой, (например, см. von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem., 133: 17-21; von Heijne, G. (1985) J. Mol. Biol, 184: 99-105; von Heijne, G. (1997) Protein Engineering (10): 1-6). Примеры белков с сигнальными пептидами, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь этим, гормон роста человека (HGH), костный морфогенетический белок 7 (BMP7), костный морфогенетический белок 2 (BMP2), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор, полученный из головного мозга (BDNF), инсулиновый фактор роста 1 (IGF-1), β-глюкоронидазу (GUSB), нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ингибиторный фактор лейкемии (LIF), белки иммуноглобулины, бычий гормон роста, бычий проальбумин, проинсулин человека, интерферон-гамма человека, альфа-фибриноген человека, тяжелую цепь IgG человека, амилазу крысы, альфа-фетопротеин мыши, куриный лизозим, плацентальную щелочную фосфатазу человека и белок кукурузы реин 22.1. Эти сигнальные пептиды можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид, используемый в соответствии с настоящим изобретением, выбирают из группы, состоящей из HGH, BDNF, IGF-1 и GUSB. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид состоит из иммуноглобулина, такого как IgK.

Сигнальная последовательность может представлять собой сигнальную последовательность млекопитающего, мыши или человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или вектор по настоящему изобретению содержит нуклеотиды 1-105 из SEQ ID NO:1 или 4-105 из SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность кодирует последовательность аминокислот, содержащую аминокислоты 2-34 из SEQ ID NO:2, или содержит SEQ ID NO:15. Последовательность нуклеотидов, кодирующая сигнальный пептид, может представлять собой последовательность дикого типа или она может представлять собой перекодированную последовательность.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность пептида кодируется для N-конца или C-конца RdCVF. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид направляет перенос белка в секреторные пути, например, в эндоплазматический ретикулум (ER). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид облегчает перенос белка из цитоплазмы в области вне клетки. Сигнальные последовательности пептида могут выбираться из встречающихся в природе сигнальных последовательностей пептидов, их производных или из синтетически сконструированной последовательности. В некоторых вариантах осуществления неограничивающие параметры для сконструированных сигнальных последовательностей пептидов включают последовательность из 3-40 остатков, содержащую гидрофобную сердцевину из 3-20 остатков, фланкированную несколькими относительно гидрофильными остатками.

В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность пептидов не имеет гидрофобной сердцевины. Неограничивающие примеры секреторных белков млекопитающих, которые не имеют типичной гидрофобной сигнальной последовательности и которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь этим, IL-1α, IL1β, bFGF, aFGF, PDEGF человека, антикоагулянтный белок, лектин L-14, фактор, получаемый из ATL, фактор XIIIa, Anchorin CII, липокортин I, паратимозин, α-протимозин и трансглутаминазу грызунов, паратимозин и MDGI.

Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеотидов, кодирующую RdCVF, и включает векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты.

Для обеспечения локального и/или долговременного экспрессирования нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предполагают трансдуцирование клетки нуклеиновой кислотой или вектором, кодирующим RdCVF. Настоящее изобретение не должно рассматриваться как ограниченное каким-либо одним конкретным способом доставки нуклеиновой кислоты, и любой доступный носитель для доставки нуклеиновой кислоты со стратегией доставки нуклеиновой кислоты либо in vivo, либо in vitro, или использование манипулирования клетками (такое как технология Neurotech, Lincoln, RI, например, см. патенты США №№ 6231879; 6262034; 6264941; 6303136; 6322804; 6436427; 6878544), а также нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, кодирующие RdCVF сам по себе (например, "голая ДНК"), могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения. Различные носители для доставки, такие как векторы, могут использоваться в настоящем изобретении. Например, вирусные векторы, амфитропные липиды, катионные полимеры, такие как полиэтиленимин (PEI) и полилизин, дендримеры, такие как гребенчатые молекулы и звездообразные молекулы, неионные липиды, анионные липиды, везикулы, липосомы и другие синтетические средства доставки нуклеиновых кислот (например, см. патенты США №№ 6958325 и 7098030; Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in "Liposomes" in "The Тherapy of Infectious Disease and Cancer"; and Lopez-Berestein & Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317-327 and 353-365 (1989); "голые" нуклеиновые кислоты и тому подобное, могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления используют молекулу нуклеиновой кислоты, в которой последовательности, кодирующие RdCVF, и любые другие желаемые последовательности фланкированы областями, которые облегчают гомологичную рекомбинацию на желаемом сайте в геноме, обеспечивая, таким образом, внутрихромосомное экспрессирование нуклеиновой кислоты RdCVF (Koller et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al. (1989) Nature 342: 435-438). Доставка нуклеиновой кислоты пациенту может быть либо непосредственной, в этом случае пациент непосредственно экспонируется для нуклеиновой кислоты или вектора, несущего нуклеиновую кислоту, или опосредованным, в этом случае клетки сначала трансформируются с помощью нуклеиновой кислоты in vitro, а затем трансплантируются пациенту.

Вектор представляет собой средство, с помощью которого нуклеиновая кислота, представляющая интерес (например, терапевтическая нуклеиновая кислота, которая может кодировать терапевтический белок), вводится в целевую клетку, представляющую интерес. Способы получения или конструирования вектора, представляющего интерес, включают, но не ограничиваясь этим, стандартные методики манипулирования генами, реакции секвенирования, переваривание с помощью ферментов рестрикции, реакции полимеразы, ПЦР, ПЦР SOEing, лигации, реакции рекомбиназы (например, технология Invitrogen GATEWAY®), другие ферменты, активные на нуклеиновых кислотах, материалы и методы размножения бактерий и вирусов, химикалии и реагенты, протоколы сайт-направленного мутагенеза, и так далее, как известно в данной области, см., например, текст Maniatis et al., "Molecular Cloning".

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, как правило, будут содержать промоторную последовательность, функционально связанную с последовательностью, кодирующей RdCVF. Промотор может представлять собой, например, ткане-специфичный промотор, клетка-специфичный промотор, индуцир