Способ специфической идентификации последовательностей днк

Способ специфической идентификации последовательностей днк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицине, и может быть использовано в клинической диагностике для детекции ДНК-мишеней.

Уровень техники

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time) за счет возможности проведения количественных оценок, высокой специфичности и чувствительности является одной из широко используемых технологий для решения различных генодиагностических задач. Распространенные схемы детекции на основе Real-Time ПЦР, такие как TaqMan, Molecular Beacon, имеют существенные ограничения по степени мультиплексирования: один канал детектирующего амплификатора - одна мишень, т.е., как правило, одновременно может быть определено не более шести искомых последовательностей (по числу каналов амплификатора). Перспективным направлением развития технологии ПЦР является разработка подходов, позволяющих повысить степень мультиплексирования диагностического теста.

Существует ряд способов для специфического определения искомой последовательности ДНК с использованием зондов, имеющих некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент и комплементарный последовательности 3'-сегмент, обеспечивающий специфичность.

Например, в патенте US 5691142 описывается способ, в котором используется зонд с 5'-сегментом, некомплементарным последовательности-мишени и примыкающий к нему праймер со стороны 5'-сегмента вплотную к 3'-сегменту, в результате чего образуется структура, расщепляемая Taq-полимеразой. После отщепления высвободившийся 5'-сегмент гибридизуется с олигонуклеотидом (также входит в состав реакционной смеси), имеющим шпилечную структуру, с образованием структуры, расщепляемой за счет экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. По накоплению расщепленного шпилечного олигонуклеотида определяется положительный сигнал. Недостатком способа является низкая эффективность амплификации сигнала.

В патенте US 7381532 описывается способ, в котором также образуется расщепляемая структура в результате взаимодействия праймера и зонда с 5'-сегментом, некомплементарным последовательности-мишени. По наличию сигнала от высвободившегося 5'-сегмента судят о наличии искомой последовательности, при этом детекцию осуществляют за счет системы FRET с двумя метками или же за счет дальнейшей амплификации.

В патенте US 6893819 описывается способ, в котором осуществляется расщепление зонда(-ов) в процессе полимеризации ДНК с высвобождением некомплементарного последовательности-мишени 5'-сегмента. Недостатком способа является линейное нарастание сигнала, что может в ряде случаев затруднить дифференциацию сигнала от фона.

В случае использования зондов даже с одной флуоресцентной меткой можно добиться дифференциации множества мишеней за счет анализа кривой плавления, тогда как классические схемы детекции, такие как TaqMan™, позволяют определить с использованием одной флуоресцентной метки лишь одну мишень.

В заявке US 2008241838 описан способ, в котором осуществляется расщепление зонда в процессе полимеризации ДНК с высвобождением некомплементарного последовательности-мишени 5'-сегмента, несущего флуоресцентную метку. Высвобожденный 5'-сегмент затем гибридизуется с "захватывающим" зондом. Для данного способа требуется, чтобы "захватывающий" зонд имел меньшую длину по сравнению с расщепляемым зондом и был иммобилизован на твердой фазе. Перечисленные ограничения необходимы для снижения вероятности гибридизации нерасщепленного исходного зонда с "захватывающим". Недостатками способа являются необходимость детекции на твердой фазе, что делает невозможным его использование в однофазных системах, таких как ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

В патенте RU 2566562 описан способ (прототип), для которого реакционная ПЦР смесь в качестве специфических компонентов на одну мишень содержит:

- расщепляемый мишень-специфичный зонд, включающий, помимо специфичного 3'-сегмента, некомплементарный последовательности-мишени 5'-сегмент без флуоресцентных меток;

- сигнальный зонд, имеющий комплементарный участок с 5'-сегментом расщепляемого мишень-специфичного зонда, несущий гаситель на 5'-конце и флуорофор во внутреннем положении;

- пару праймеров.

В процессе прохождения ПЦР происходит расщепление мишень-специфичного зонда с высвобождением 5'-сегмента, который гибридизуется на сигнальный зонд, а затем удлиняется на нем за счет полимеразы с образованием дуплекса. При образовании дуплекса одноцепочечный сигнальный зонд расправляется, что приводит к повышению флуоресценции в результате пространственного удаления флуорофора и гасителя, входящих в его состав.

Описан и другой вариант реализации способа, наиболее близкий к заявляемому изобретению, заключающийся в ином расположении меток при том же составе олигонуклеотидов: расщепляемый мишень-специфичный зонд на 5'-конце несет флуорофор, сигнальный зонд несет на 3'-конце гаситель флуоресценции. В процессе прохождения ПЦР происходит расщепление мишень-специфичного зонда с высвобождением 5'-сегмента, несущего флуорофор, который гибридизуется на сигнальный зонд, а затем удлиняется на нем за счет полимеразы с образованием дуплекса, обладающего большей температурой плавления по сравнению с дуплексом мишень-специфичный зонд/сигнальный зонд, что исключает возможность появления ложноположительных результатов. При образовании дуплекса флуорофор высвобожденного 5'-сегмента и гаситель флуоресценции, входящий в состав сигнального зонда, сближаются, что приводит к понижению флуоресценции, регистрируемому детектирующим амплификатором.

После ПЦР проводится плавление продуктов реакции. По наличию дуплекса с определенной температурой плавления можно судить о присутствии соответствующей мишени. Температура плавления соответствующего дуплекса задается размером сигнального зонда, последовательность которого подбирается разработчиком для каждой мишени индивидуально. Степень мультиплексирования (количество детектируемых мишеней в одной пробирке) зависит от количества каналов амплификатора и от количества дуплексов, различающихся по температуре плавления, на каждый канал.

Недостатком способа является энзиматический этап образования дуплекса, так как ограничивает диапазон допустимых температур плавления дуплексов и усложняет в целом систему за счет необходимости оптимизации реакции образования дуплекса в рамках основного протокола ПЦР. Однако, данный способ коммерциализирован компанией Seegene, Южная Корея и на его основе разработана линейка мультиплексных тестов для выявления ряда инфекционных заболеваний человека.

На основе ПЦР в реальном времени разработано и реализуется на рынке множество тестов в мультиплексном формате.

Интерес к мультиплексному анализу обусловлен несколькими факторами - это снижение трудозатрат, увеличение скорости выполнения анализа, экономия реактивов, экономия биоматериала, экономия приборного времени.

Рост интереса к мультиплексному формату можно наблюдать по растущему числу публикаций на тему мультиплексной ПЦР и по увеличению количества выпускаемых тестов в мультиплексном формате на основе ПЦР в реальном времени в линейках производителей тест-систем.

Степень мультиплексирования диагностического теста на основе ПЦР в реальном времени может быть повышена за счет увеличения числа каналов детекции амплификатора, однако эта технология достигла потолка; так, современные амплификаторы имеют не более 7 каналов и существенного увеличения их числа не ожидается.

Таким образом, перспективным направлением развития технологии ПЦР является разработка подходов, позволяющих повысить степень мультиплексирования диагностического теста в рамках ограниченного числа каналов детекции, то есть позволяющих определять в одном канале две мишени и более.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа специфической идентификации последовательностей ДНК, в том числе для определения нуклеотидных полиморфизмов, на основе ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени, позволяющего идентифицировать более одной мишени в одном канале амплификатора с флуоресцентной детекцией. Разрабатываемый способ представляет собой мультиплексный дуплекс-опосредованный анализ на основе расщепляемых зондов (МДА).

Другой задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка набора на основе МДА для выявления одной или нескольких искомых последовательностей ДНК.

Поставленная задача решается за счет реализации МДА, заключающегося в использовании мишень-специфичного зонда, который расщепляется в процессе ПЦР в присутствии искомой последовательности ДНК (мишени) с высвобождением 5'-сегмента, образующего детектируемые дуплексы на этапе плавления с сигнальным зондом. Каждой мишени соответствует дуплекс с определенной температурой плавления, детектируемый в определенном канале амплификатора, за счет чего и осуществляется дифференциация мишеней. В МДА сокращается количество этапов генерации сигнала по сравнению с прототипной технологией РТОСЕ, что позволяет упростить оптимизацию системы и достичь более высокой степени мультиплексирования за счет расширения диапазона температур плавления для дуплексов.

Более конкретно, решение поставленной задачи осуществляется за счет разработки способа специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК, включающего следующие этапы:

а) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для которой реакционная смесь включает

термостабильный фермент, обладающий 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью,

а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК, т.е. в качестве специфических компонентов на одну мишень (в качественном отношении), включает, по меньшей мере,

одну пару праймеров,

один олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий

3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку ДНК и содержащий метку, и

5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,

один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;

при этом в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;

б) проведение плавления реакционной смеси в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, подразумевающее пошаговое изменение температуры реакционной смеси со считыванием флуоресцентного сигнала на каждом шаге, при этом сигнал при плавлении дуплекса генерируется за счет разобщения меток, имеющих перекрывающиеся спектры поглощения и испускания, входящих в состав отщепленного 5'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнального зонда, а нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания; при этом дифференциация дуплексов, соответствующих идентифицируемым различающимся участкам последовательностей ДНК, осуществляется по двум параметрам - канал детекции и/или температура плавления;

при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:

1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывается со спектром поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,

2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения осуществляют определение от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале амплификатора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом от 0,01 до 1°С.

В некоторых частных вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом 0,5°С.

В частных вариантах воплощения изобретения проведение плавления реакционной смеси осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 100°С.

В некоторых вариантах воплощения изобретения температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, входящих в реакционную смесь.

В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве флуорофора или репортерного флуорофора используют, по меньшей мере, один из красителей карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G), карбокси-Х-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (6-JOE), тиадикарбоцианин, Су5™.

В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве гасителя флуоресценции используют гаситель флуоресценции серии BHQ и/или RTQ.

В частных вариантах воплощения изобретения в качестве термостабильного фермента, обладающего 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, используют Taq ДНК полимеразу.

В некоторых частных вариантах воплощения изобретения сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере, два различающихся мишень-специфичных зонда,

3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и

5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,

два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов мишень-специфичных зондов,

при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК реакционная смесь включает, по меньшей мере,

два различающихся мишень-специфичных зонда,

3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры, и

5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,

два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;

при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.

В частных вариантах воплощения изобретения осуществляют специфическую идентификацию, по меньшей мере, одного полиморфизма в последовательности ДНК; в таких вариантах воплощения 3'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из

аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и

3'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,

соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1-10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов,

при этом по длине 3'-сегмент совпадает с участком гибридизации указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма,

при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его 3'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;

напротив, в случае неполной комплементарности 3'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется указанным ферментом по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,

при этом возможны следующие варианты сочетания меток:

1) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,

2) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, реакционная смесь включает, по меньшей мере,

два различающихся мишень-специфичных зонда,

5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации, но содержат одинаковые флуорофоры, и

5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,

два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) 3'-сегментов мишень-специфичных зондов,

при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере, двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, реакционная смесь включает, по меньшей мере,

два различающихся мишень-специфичных зонда,

5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации и содержат при этом разные флуорофоры, и

5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,

два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) 3'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;

при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере,

два различающихся мишень-специфичных зонда,

5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом одинаковые флуорофоры, а 3'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и

5'-сегменты различаются температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, при этом дифференциацию аллельных вариантов осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, при осуществлении идентификации, по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, реакционная смесь включает, по меньшей мере,

два различающихся мишень-специфичных зонда,

5'-фрагменты (S) 3'-сегменты каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом разные флуорофоры, а 3'-фрагменты (D) - идентичны по последовательности, и

5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда, при этом по температурам плавления дуплексов осуществляют дифференциацию аллельных вариантов в одном канале амплификатора.

В частных вариантах воплощения линкер L в составе мишень-специфичного зонда состоит из 4-10 инозинмонофосфатов.

Решение поставленной задачи также осуществляется за счет разработки оригинальных зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого предложена пара зондов, состоящая из

олигонуклеотидного мишень-специфичного зонда, имеющего

3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и

5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку, и

олигонуклеотидного сигнального зонда, комплементарного 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащего метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;

выполненных таким образом, что

в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется термостабильным ферментом, обладающим 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;

при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:

1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, соответственно, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,

2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.

В некоторых вариантах воплощения изобретения пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР характеризуется тем, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере, для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, используемых для проведения ПЦР.

В некоторых частных вариантах воплощения сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.

В частных вариантах воплощения, когда пара зондов применяется для идентификации одного или более полиморфизмов в последовательности ДНК, зонды характеризуются тем, что

3'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из

аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт, и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и

3'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,

соединенных линкером, состоящим из, по меньшей мере, 1-10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов,

при этом по длине 3'-сегмент совпадает с участком гибридизации на идентифицируемой указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма,

при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, в случае полной комплементарности его 3'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется ферментом, обладающим 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;

напротив, в случае неполной комплементарности 3'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется ферментом, обладающим 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,

при этом возможны следующие варианты сочетания меток:

1) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, соответственно, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,

2) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.

Решение поставленной задачи также осуществляется за счет разработки набора для специфической идентификации, по меньшей мере, одной последовательности ДНК в образце способом, описанным выше; при этом набор включает, по меньшей мере, термостабильный фермент, обладающий 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью,

а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК, по меньшей мере,

одну пару праймеров,

один мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, имеющий

3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и

5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,

один олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;

при этом зонды выполнены таким образом, что в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, способен расщепляться указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизующегося с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;

при этом возможны следующие варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК:

1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,

2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.

Предложенный набор характеризуется тем, что при плавлении реакционной смеси, получаемой в результате смешивания компонентов набора, без предварительного проведения ПЦР, дуплексы не детектируются. В частных случаях, эта характеристика набора может быть использована для идентификации набора по изобретению.

В некоторых вариантах воплощения набор включает, по меньшей мере, два различающихся мишень-специфичных зонда,

3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и

5'-сегменты которых содержат одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, но различаются по температуре плавления так, чтобы обеспечить возможность осуществить дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по температуре плавления.

В некоторых вариантах воплощения набор включает, по меньшей мере, два различающихся мишень-специфичных зонда,

3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры так, чтобы обеспечить возможность дифференциации различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по спектрам испускания флуорофоров, и

5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда.

При осуществлении настоящего изобретения достигаются следующие технические результаты:

- МДА позволяет специфично определять последовательности ДНК, в том числе в мультиплексном формате, с возможностью определения более чем одной мишени в одном канале амплификатора;

- отсутствие необходимости в проведении стадии энзиматического образования дуплекса;

- для МДА достигается высокая степень мультиплексирования за счет широкого диапазона температур плавления для дуплексов, образуемых сигнальными зондами и отщепляемыми 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, что обеспечивает более высокую степень мультиплексирования по сравнению с прототипной технологией; такое существенное расширение диапазона температур плавления возможно благодаря тому, что при проведении МДА можно использовать дуплексы с температурой плавления существенно ниже температуры плавления праймеров, с достижением высокой чувствительности и специфичности метода;

- МДА позволяет определять различные полиморфизмы в ДНК, в том числе однонуклеотидные полиморфизмы, делеции и инсерции, при этом для проведения такого анализа не требуется введение в систему дополнительного зонда (в отличие от способа-протитипа);

- возможность реализации способа в двух форматах: без иммобилизации сигнального зонда или с его иммобилизацией на твердую фазу;

- разработан набор для проведения специфической идентификации последовательностей ДНК, в том числе для определения нуклеотидных полиморфизмов.

Подробное раскрытие изобретения

Настоящее изобретение является новым способом специфического определения нуклеотидных последовательностей ДНК, в том числе в мультиплексном формате с последующей реализацией в виде набора.

ДНК, пригодной для проведения анализа с помощью МДА, является образец ДНК, полученный путем экстракции из разнообразного биологического материала, в том числе, но не ограничиваясь, из мазков, слюны, мочи, сыворотки крови, плазмы крови, тканей органов. Для экстракции ДНК могут быть использованы различные методы, в том числе, но не ограничиваясь, на основе спиртового осаждения, на основе сорбции, на основе температурного лизиса, позволяющие получить матрицу, пригодную для ПЦР, кроме того матрица ДНК для проведения анализа может быть получена в результате реакции обратной транскрипции с матрицы РНК, которая может быть также экстрагирована из разнообразного биологического материала, в том числе перечисленными выше методами; или ДНК для анализа может быть получена любыми другими доступными методами.

Краткое описание рисунков

Рис. 1. - Принцип мультиплексного дуплекс-опосредованного анализа на основе расщепляемых зондов (МДА) на примере одного из вариантов сочетания меток.

А - Состав системы МДА:

(1) - расщепляемый мишень-специфичный зонд, включающий, помимо специфичного 3'-сегмента (α), несущего гаситель (Q), некомплементарный ДНК-мишени 5'-сегмент (β), несущий флуорофор (F),

(2) - сигнальный зонд, комплементарный β и несущий в своем составе гаситель Q,

(3) - пара праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, в рамках которого гибридизуется мишень-специфичный зонд.

Б - Расщепление мишень-с