Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ang и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования

Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ang и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Ангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов в уже существующей сосудистой системе. Он играет важную роль в развитии и нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (развитие плаценты и желтого тела, овуляции), и вовлечен в патогенез различных заболеваний.

Процесс неоангиогенеза является необходимым для длительной адаптации тканей в условиях повреждения. При этом происходит частичное поступление факторов роста в кровь, что имеет диагностическое значение. Факторы роста, как правило, продуцируются неспециализированными клетками, находящимися во всех тканях, и обладают эндокринным, паракринным и аутокринным действием.

Одним из факторов ангиогенеза является белок ангиогенин, который принадлежит к суперсемейству Рибонуклеаз А. Он обладает и специфическим биологическим действием, и ферментативной РНКазной активностью, в отличие от других факторов ангиогенеза. Ангиогенин является гомологом бычьей панкреатической рибонуклеазы А (РНКазы А). Биологическая активность ангиогенина зависит от РНКазной активности, которая при этом у него в 10⁴-10⁶ ниже, чем у РНКазы A (Biochemistry 2002, 41, р. 1343). Мутации критических для ферментативной активности ангиогенина аминокислот приводят к потере ангиогенной активности.

Эндогенный ангиогенин необходим для пролиферации клеток, индуцируемой другими белками, как, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Как и в случае с VEGF, экспрессия ангиогенина может индуцироваться состоянием гипоксии. Белок, кодируемый геном ANG, является мощным медиатором образования новых кровеносных сосудов. Зрелый пептид обладает противомикробной активностью против некоторых бактерий и грибов, в том числе S. pneumoniae, и C. Albicans. Ангиогенин - один из ключевых белков, вовлеченных в процесс ангиогенеза в нормальных и опухолевых тканях. Ангиогенин взаимодействует с актином на поверхности эндотелиальных клеток, и путем эндоцитоза транспортируется в клеточное ядро, что в дальнейшем приводит к стимуляции процессов клеточной миграции, инвазии и пролиферации. Ангиогенин также способен связывать фоллистатин. Его активность in vivo регулируется взаимодействием с RNH1 (ribonuclease/angiogenin inhibitor 1).

Ангиогенин продуцируется различными типами клеток и присутствует в нормальной человеческой плазме, способствует миграции эндотелиальных клеток, связывается с ними, опосредует клеточное сцепление, способствует формированию трубчатых структур и может влиять на созревание сосудов, индуцируя пролиферацию гладкомышечных клеток и фибробластов. Преимущественно он экспрессируется в печени, а также детектируется в нейронах спинного мозга. Высокий уровень экспрессии ANG был обнаружен во внеклеточном матриксе и интерстициальной ткани, также ангиогенин был локализован в спинном мозге, эндотелиальных клетках, например, в сосудистом эндотелии, что свидетельствует о его роли в ангиогенезе. Известно также, что ANG экспрессируют такие клетки, как клетки сосудистого эндотелия, гладкомышечные клетки, фибробласты, цилиндрический эпителий толстой кишки, лимфоциты и клетки первичной аденокарциномы, а также селективные линии клеток опухоли человека.

У ангиогенина была открыта нейротрофическая функция (Greenway M.J. et al., ANG mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis, Nat. Genet., 2006; №38, c. 411-413 - Мутации в гене ангиогенина выделяют при семейной и "спорадической" формах бокового амиотрофического склероза - БАС), а также - у фактора роста эндотелия сосудов (Lambrechts D. et al., Nat. Genet., 2003, Ns 34, c. 383-394 - Фактор роста эндотелия сосудов является модификатором бокового амиотрофического склероза (БАС) у мыши и человека и защищает мотонейроны от ишемической смерти.), что позволяет рассматривать нейротрофические факторы в числе наиболее перспективных соединений для лечения БАС. Важность ангиогенина при патогенезе БАС подтверждена в экспериментах на мышах линии B6SJL- ₃ Tg(SOD1*G93A)dI1Gur/J с мутацией G93A в гене СОД1 (Gurney М.Е. et al., Science, 1994, №264, С. 1772). Было показано увеличение продолжительности жизни при введении им рекомбинантного ангиогенина.

В заявке на патент США N2008/0045456 показаны фармацевтические композиции на основе ангиогенина человека, в том числе рекомбинантного происхождения (полученного в E.coli), и методы их использования для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности БАС, позволяющие снизить проявления нейродегенеративных процессов у подопытных мышей и удлинить продолжительность их жизни. При такой терапии необходимо ежедневно вводить рекомбинантный ангиогенин.

Известны ряд лекарственных препаратов (гели «Ангиофарм», «Cosmo-Genium», «Ангиосиб», «Фармаген») содержащие рекомбинантный человеческий ангиогенин, на который получен патенты RU 2512527, RU 2221043. Согласно данным исследований препараты обладают высокими репаративными свойствами за счет ускоренной реконструкции локальной капиллярной сети и образования грануляционной ткани, снижают отечные и воспалительные явления, повышают местный иммунитет в зоне повреждения, снижают вероятность образования келоидных рубцов. Однако подобная терапия за счет местного применения может быть недостаточно эффективной и не учитывает индивидуальных характеристик пациента.

В заявке WO 2009146178 А1 описан способ терапевтического лечения нейродегенеративного расстройства у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полипептид ангиогенина; способ позволяет изолированному ангиогенину проходить через один или оба барьера - гематоэнцефалического барьера и барьера крови спинного мозга; при этом уменьшая один или более симптомов нейродегенеративного нарушения у субъекта.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, частое его введение (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Кроме того, внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.

За прототип авторами было принято техническое решение по заявке WO 2013122502 А1, в которой описана фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза (БАС). Композиция содержит нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированных в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер. Способ терапии бокового амиотрофического склероза заключается во введении человеку терапевтически эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированных в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер.

Недостатком данного подхода является то, что при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении использован аденоассоциированный вирус, который может интегрироваться в хромосому клетки-хозяина, а также - не учитываются индивидуальные характеристики пациента, в связи с которыми может понадобиться группа вариаций для данного средства.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание высокоэффективного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, на основе генно-терапевтических субстанций с геном ANG, представляющих собой группу генно-терапевтических субстанций, при использовании которых с учетом индивидуальных особенностей пациента, происходит повышение уровня экспрессии гена ANG и/или повышение количества и/или активности белка ангиогенина, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма

Указанная задача решается за счет того, что создано средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с кДНК гена ANG, представляющее собой, по крайней мере, одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена ANG, с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и 3'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии гена ANG в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека, и способную увеличить количество и/или активность белка ангиогенина в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности в спинном мозге, кровеносных сосудах, сердце, кишечнике, желудке, печени, желчном пузыре, легких, органах выделительной и половой систем (мочевом пузыре, мочеточниках, матке, яичниках), гладких и скелетных мышцах, интерстициальной, эндотелиальной, эпителиальной, нервной, мышечной тканях, плацентарной ткани, в дерме (коже), гепатоцитах, нейронах, клетках сосудистого эндотелия, мышечных клетках, фибробластах, клетках эпителия, лимфоцитах в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом каждая генетическая конструкция с модифицированной кДНК гена ANG содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена ANG, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка ангиогенина, а именно: нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.

Способ получения средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, заключается в получении каждой генно-терапевтической субстанции из группы созданных генно-терапевтических субстанций, при этом получают кДНК гена ANG, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена ANG с кодирующей последовательностью белка ангиогенина, с делециями 5' и 3'-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена ANG SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена ANG, при этом в качестве модифицированной кДНК гена ANG используют, или SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций.

Способ использования средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ANG и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина, заключается в трансфекции генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей пациента и/или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций, и/или во введении в органы и ткани пациента генно-терапевтической субстанции или нескольких субстанций, выбранной/ выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций, или сочетанием обозначенных способов.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена ANG длиной 444 н.п. SEQ ID No: 1, которая имеет высокую гомологию с приводимой в базе данных GenBank под номером NM_001145 и кодирует белок ангиогенин (GenBank NP_001136.1.)

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID No: 2, которая содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 663, не приводящую к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID No: 3, которая содержит 2 нуклеотидные замены: 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 663, и одну нуклеотидную замену A→G в позиции 921, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID No: 4, которая содержит 4 нуклеотидные замены: 1 нуклеотидную замену G→С в позиции 663, 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 879, 921; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 885, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID NO: 5, которая содержит 6 нуклеотидных замен: 2 нуклеотидных замены G→C в позиции 663, 966; 3 нуклеотидных замены A→G в позициях 879, 921, 957; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 885, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID NO: 6, которая содержит 8 нуклеотидных замен: 2 нуклеотидных замены G→C в позицииях 663, 966; 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 879, 921, 957, 1005; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 885, 1 нуклеотидную замену Т→С в позиции 1003; не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 7

Представлена укороченная нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена ANG, SEQ ID No: 7, которая содержит 10 нуклеотидных замен: 2 нуклеотидных замены G→C в позиции 663, 966; 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 879, 921, 957, 1005; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 885, 1 нуклеотидную замену Т→С в позиции 1003; и 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 1035 и 1038, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка ангиогенина.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG проводили анализ эндогенной экспрессии гена ANG в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена ANG, фибробласты со сниженной экспрессией гена ANG,

2 - кДНК гена ANG, фибробласты с нормальной экспрессией гена ANG,

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена ANG,

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена ANG.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG с генетической конструкцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена ANG в фибробластах с нормальной экспрессией гена ANG,

2 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG до трансфекции ГТС с кДНК гена ANG,

3 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции ГТС с кДНК гена ANG,

4 - кДНК гена ANG в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции вектором без кДНК гена ANG,

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена ANG,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG до трансфекции ГТС с кДНК гена ANG,

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции ГТС с кДНК гена ANG,

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена ANG после трансфекции вектором без кДНК гена ANG.

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена ANG уровень кДНК гена ANG в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК гена ANG - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена ANG многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена ANG в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена ANG при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена ANG представлен график изменения количества белка ангиогенина, нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК гена ANG (культура В) и трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCDNA 3.1-ANG SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG происходит увеличение количества белка ангиогенина, в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной генно-терапевтической субстанцией, представлен анализ изменения количества белка ангиогенина, в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные генно-терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количество белка ангиогенина, в интактной коже. Показано повышение количества белка ангиогенина, в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией кДНК гена ANG (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток генно-терапевтическими субстанциями с участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG и модифицированных кДНК гена ANG, представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 26 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No:4, части (E) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией рСМV6-ANG SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-ANG SEQ ID No:7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена ANG.

По итогам анализа уровня количества белка ангиогенина, выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка ангиогенина, и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-ANG SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-ANG SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции рСМV6-ANG SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-ANG SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-ANG SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции рСМV6-ANG SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальное количество белка ангиогенина, наблюдалась при трансфекции pCMV6-ANG SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка ангиогенина присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена ANG.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена ANG.

Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка ангиогенина, в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно-терапевтические субстанции.

Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС ANG SEQ ID No: 7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью одтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре эпителиальных клеток глаза человека при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG в генетической конструкции pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No: 2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена ANG, эпителий роговицы до трансфекции

2 - кДНК гена ANG, эпителий роговицы после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена ANG в культуре клеток эпителия роговицы человека многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клеточной культуре эпителия слизистой оболочки полости рта при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена ANG приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена ANG, до трансфекции

2 - кДНК гена ANG, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена ANG вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в коже человека при введении в кожу генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в коже. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG pCMV6-ANG SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка ангиогенина, в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина в слизистой оболочке полости рта человека при введении в слизистую оболочку полости рта генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина, в слизистой оболочке полости рта. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG pCDNA 3.1 ANG SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку полости рта.

Показано увеличение количества белка ангиогенина, в лизате биоптата слизистой оболочки полости рта пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина, в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка ангиогенина в мышечной ткани. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена ANG - pCMV6-Kan/Neo ANG SEQ ID No: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена ANG с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка ангиогенина, в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена ANG, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка ангиогенина до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов генно-терапевтических субстанций с модифицированными кДНК гена ANG и участком нативной немодифицированной кДНК гена ANG анализировали уровень количества белка ангиогенина в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG.

Каждому из 31-го пациента, которые были отобраны в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No: 1, pCMV6- SEQ ID No: 2, pCMV6- SEQ ID No: 3, pCMV6- SEQ ID No: 4, pCMV6- SEQ ID No: 5, pCMV6- SEQ ID No: 6, pCMV6- SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа уровня количества белка ангиогенина, в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни количества белка ангиогенина, и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении рСМV6-ANG SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальная активность белка ангиогенина, наблюдалась при введении pCMV6-ANG SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка ангиогенина, присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные кДНК гена ANG и участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка ангиогенина, в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена ANG, входящих в генно-терапевтические субстанции.

Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 2 (В)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 3 (С)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 4 (D)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 5 (Е)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 6 (F)

биоптаты пациентов после введения ГТС ANG SEQ ID No: 7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка ангиогенина, в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или модифицированные кДНК гена ANG.

По итогам анализа количества белка ангиогенина, в культуре фибробластов пациента выделили вариант генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка ангиогенина. В данном эксперименте максимальная концентрация белка ангиогенина в лизате наблюдается при трансфекции генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 ANG SEQ ID No: 1, содержащей участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG, что показано на фигуре 19.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.

Обозначения:

1 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)

2 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 2 (В)

3 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 3 (С)

4 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 4 (D)

5 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 5 (Е)

6 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 6 (F)

7 - клеточный лизат после трансфекции ГТС ANG SEQ ID No: 7 (G)

8 - клеточный лизат после трансфекции плацебо (Н)

На фиг. 20

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка ангиогенина в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему генно-терапевтических субстанций, содержащих участок нативной немодифицированной кДНК гена ANG или участки модифицированных кДНК гена ANG.

По итогам анализа количества белка ангиогенина, в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка ангиогенина. В данном эксперименте максимальная концентрация белка ангиогенина отмечена при введении генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6 ANG SEQ ID No: 7, содержащей модифицированную кДНК гена, что показано на фигуре 20.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.

Обозначения:

1 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 1 (А)

2 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 2 (В)

3 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 3 (С)

4 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 4 (D)

5 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 5 (Е)

6 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 6 (F)

7 - лизат биоптата после введения ГТС ANG SEQ ID No: 7 (G)

8 - лизат биоптата после введения плацебо (Н)

Реализация изобретения.

При снижении экспрессии генов, кодирующих белки ангиогенеза, например, гена ANG, происходит снижение количества белка ангиогенина или снижение его активности в организме, что приводит к патологическим состояниям.

Так у гомозиготных мышей, нокаутных по гену ANG, наблюдали аномальную реакцию на испуг (http://www.mouse phenotype.org/data/genes/MGI:88022).

Преимущества использования генетической конструкции с геном ANG для коррекции экспрессии гена ANG и количества и/или активности белка ангиогенина в клетках органов и тканей человека, по сравнению с использованием