Способ получения /-лизипа

Способ получения /-лизипа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е 266649

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскин

Социалистическими

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

Заявлено 10.1Х.1966 (№ 1100755/28-13)

Приоритет: 11.IX.1965 (№ 55376-65, Япония) Кл. 6b, 16/03

12q, 6/01

МПК С 12d

С 07f

Комитет по лелагл изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 17.III.1970. Бюллетень № 11

УДК 663.18:576.8.097.35 (088.8) Дата опубликования описания 6Х111.1970

Авторы изобретения

Иностранцы

Кацунобу Танака и Казуо Кимура (Япония) Иностранная фирма

Кийова Хакко Когио Ко, Лтд (Япония) Заявитель

Б1 .БЛ1с Д i Ф:НА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1-ЛИЗИНА

Известен способ получения 1-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, в присутствии необходимых для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением 1-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов, например при помощи ионообменных смол.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход 1-лизина.

Для этого в:качестве продуцентов используют штамм Arthrobacter paraffineus (АТСС

21003), требующий для своего развития гомосерин, а также штаммы Brevibacterium ketoglutamicum (АТСС 21004) и Corynebacterium

hydrocarboclastus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин.

Способ получения 1-лизина заключается в том, что продуцирующие его микроорганизмы, такие как Arthrobacter paraffineus (ATCC

21003), требующий для своего роста гемосерин, Brevibacterium ketoglutamicum (АТСС

21004) или Corynebacterium hydrocarboclastus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин, выращивают на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли и стимуляторы роста. Культивирование производят в аэробных условиях при температуре

5 от 20 до 40 С и рН среды, равном от 4,0 до

9,0.

В:качестве углеводородных фракций нефти используют н-парафины, содержащие от 10 до 30 атомов углерода в количестве от 1 до

30%, можно использовать единичные или смесь нескольких н-.парафинов, таких как и-додексан, н-тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гептодекан, а также смесь, последних с другими источниками углерода. В качестве углевода могут быть использованы глюкоза, меласса, в небольшом количестве гидролизат крахмала.

В качестве источника азота используют соли аммония: сульфат аммония, нитрат аммо20 ния, хлорид аммония,:карбонат аммония. Неорганические соли используют такие, как фосфат калия, сульфат магния, сульфат марганца, хлорид калия, сульфат железа. В качестве стимуляторов роста применяют мясной экс25 тракт, дрожжевой экстракт и др.

После окончания процесса ферментации

1-лизин выделяют из культуральной жидкости одним из известных способов, например экс266649

3 тракцией или центрифугированием, при помощи ионнообменных смол.

Пример. Микроорганизм, требующий гомосерин, Brevibacterium ketoglutamicus

К 2439 АТСС 15587 выращивали в двухлитровой конической колбе на питательной среде, содержащей l о/одрожжевого экстракта,,J /о мясного экстракта, 1 /о пептона и 0,2о/о NaCI в аэрооных условиях при температуре 30 С в течение 24 час. Затем выращенную таким об,разом культуру (маточную) в количестве 10о/о пересеяли в .пятилитровый ферментер, содержащий 3 л питательной среды, состоящей из

10о/р и-;парафинов, содержа щих от 12 до 18 атомов углерода, О,lо/о КН РО4, О,lо/о К НРО4, 0,1 /î MgSO4 ° 7Н О; 0,002о/о MgSO4 ° 4Н О;

0,02о/, FeSOq 7НО; 100 у/л хлоргидрата тиамина; 100 у/мл гомосерина и 2о/о (NH<)SO4 р Н ср еды р авен 6,5.

Культивирование осуществляли при тем|пературе 30 С в аэробных условиях при перемеши вании в течение 72 час. При этом в культуральной жидкости образовалось

J0 мг/мл l-лизина.

Затем из культуральной жидкости удалили клетки путем ее центрифугирования. Фугат пропустили через ионообменную смолу Амберлит IRI-50. рН раствора поддерживали на уровне 7,0 при помощи 0,5 М буферного раствора, Колонку со смолой промывали водой и 0,15 N раствором аммиака, Фракции, дающие .положительные реакции на нингидрин, собрали и посредством аэрации удалили из них аммиак. рН раствора, полученного таким образом, довели до 2,0 6 N соляной кислотой (HCI), далее при пониженном давлении раствор сконцентрировали. В полученное вещество добавили немного воды и спирта и получили 20 г сырых кристаллов гидрохлорида

/-лизин.

Характеристика штаммов, продуцирующих .1-лизин.

1. Arthrobacter paraffineus.

Выделен из почвы.

Морфология. Короткие палочки, разветвленные, изогнутые или булавовидной формы; встречаются шаровидные клетки, неподвижны, опор не образуют, грамположительные и грамотрицательные. Размером 0,5 — 0,8 (1—

3 мк (шаровидные клетки 0,6 — 0,8 мк). В кислотах не окрашиваются.

Культуральные свойства.

Минеральная среда. Агар: рост значитель1 ый; колонии круглые гладкие, сплошные, бледного желтовато-коричневого цвета, непрозрачные, блестящие. На косом агаре: рост значительный; колонии нитевидные, бугристые или .плоские, блестящие, бледного желтоватосеровато-коричневого цвета, маслянистые.

Бульон слегка мутный, с небольшим хлопьевидным осадком. Оптимальная температура развития — 20 — 30 С, рН среды 6,0 — 8,0, аэробные, факультативно анаэробные. Лакмусовое молоко остается без изменения или щелочная реакция; желатину не разжижает, 10

65 индол не выделяет, крахмал не гидролизует, нитратов не образует. Хорошо растет на средах, содержащих в качестве углерода и-парафины и вырабатывает большое количество

L-глютаминовой кислоты из и- парафинов или уксусной кислоты. Вырабатывает кислоту из фруктозы и маннита;

2. Micrococcus paraffinolyticus.

Морфология. Шаровидной формы или в виде палочек. Размером 0,8 — 1,2+0,8 — 1,4 мк.

Неподвижны, однако среди микроорганизмов, принадлежащих к этому виду, имеются некоторые культуры, обладающие небольшой способностью передвигаться. Грамположительные.

Минеральная среда. Рост ограничен плоскими культурами на агаровом бульоне. На косом агаре рост незначителен. Культуры нитевидной формы блестящие, ярко-красного или красновато-оранжевого цвета, маслянистые.

На бульоне образуется небольшая мутность и осадок. На поверхности роста нет. Оптимальная температура развития 25 — 37 С. рН среды 6,0 — 8,0. Аэробные, возможно анаэробные.

Лакмусовое молоко не изменяет, желатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол ,не выделяет, крахмал не разлагает. Соль азотной кислоты восстанавливает (существуют некоторые виды, которые не вызывают восстановления соли азотной кислоты). При .примене нии и-парафинов в качестве источника углерода рост отличный, при этом вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота, в особенности L-глютаминовая кислота и альфа-кетоглутар овая кислота.

Отношение к сахарам. Хорошо использует фруктозу, хуже глюкозу и манозу.

3. Brevibacterium ketoglutamicum.

Морфология. Короткие палочки, но иногда встречаются относительно длинные клетки.

Размеры их 0,7 — 0,9х;0,8 — 3,0 мк, неподвижны грамположительные, Минеральная среда. На агаре в чашках

Петри рост умеренный. Культуры е виде зерен, плоские и гладкие, плотные, непрозрачные, блестящие. На косом агаре рост умеренный. Культуры нитевидные, блестящие, бледно-красновато-оранжевого цвета; маслянистые. На бульоне образуется небольшая мутность и осадок, на поверхности образует пле нку. Оптимальная температура .развития 25—

37 С, при температуре 37 С рост значителен.

Оптимальная величина рН среды 6,0 — 8,0.

Аэробные, могут быть анаэробные. Лакмусовое молоко не изменяет или изменяет в щелочное, желатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол не образует, крахмал не разлагает, соль азотной кислоты восстанавливает. При использовании и-|парафинов в качестве источника углерода рост отличный с выделением альфа-кетоглутаро|вой и I -глютаминовой кислот и аланина. Отношение к сахарам. Использует глюкозу, фруктозу и сахарозу незначительно, мальтозу не использует.

266649

Предмет изобретения

Составитель Т. Полянская

Рс дактор Н. )l. Воликова Tevpep Л. Я. Левика

Корректор Л. С. Ве: енееза

Заказ 2127 7 Тираж 480 Подписное

ЦП1ЛИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, OK-35, Раушская паб., д. 4,5

Типография, пр. Сапунова, 2

4. Corynebacterium hydrocarboclastus.

Морфология. Палочки размером 0,8 3,0 мк.

Шаровидная форма и разветвления встречаются редко. Споры не образует. Неподвижны, Некислотоустойчивы. Грамположительны.

Минеральная среда. Колонии на агаре круглые, гладкие или с мелкими морщинами, выпуклые, сплошные, бледно-,розового цвета, непрозрачные, маслянистые. На косом агаре: рост умеренный, нитевидной формы, блестящие или тусклые, гладкие или морщинистые, бледно-розового цвета. На бульоне хрупкая пленка, желатину не разжижает, молоко не изменяется, молоко В. С. P. щелочное, не пентонизирует. Картофель: умеренный рост. Нитраты не восстанавливает в нитриты, индол не выделяется, ацетилметилкарбонол не выделяет, сероводород выделяет (IHeкоторые культуры не выделяют H>S). Крахмал не гидролизует, некоторые культуры крахмал гидролизуют. Из глюкозы образует кислоту, но газа не образует. Аэробная кислота получается из глюкозы спс:обом Хюга и Лейфсона (Hugh

and Leifson). Из ксилозы, сахарозы, лактозы и крахмала не образуется ни кислот, ни газа.

Глюкоза, глюконат, цитрат, соль янтарной кислоты, роксибензоат и протокатехоат используются как единственный источник углерода. Использование бензоата зависит от вида культуры. Соль салициловой кислоты, m-оксибензоат, гентисат и антралинат не используются в качестве единственного источника углерода. Керосин, н-декан, н-ундекап, н-додекан, н-тетрадекан и н-цетан используются в качестве единственного источника углерода. Оптимальная температура развития

25 — 30 С.

Спосоо получения l-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти в присутствии необходимых для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением l-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов, например при помощи понообменных смол, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода 1-лизина, в качестве продуцентов используют штамм Arthrobacter paraffineus (АТСС 21003), требующий для своего развития гомосерин, а также штаммы Brevibacteпшп ketoglutamicum (АТСС 21004) и Corynebacterium hydrocarboc1astus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионпн и треонин.