Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro
Патент 2666920
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. Изобретение позволяет получить адвентивные корни вздутоплодника сибирского в условиях in vitro с отсутствием сезонной зависимости их получения. 1 табл.
Реферат
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию корней растения вздутоплодника сибирского, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений – пиранокумаринов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.
Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Его корневища и корни обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами. Используется при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор».
При этом известно, что вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка растения в природе может привести к уничтожению природных популяций.
Кроме того, корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, несет большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов. – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).
Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, в моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Также существуют отдельные очаги произрастания растения в Красноярском крае, Читинской и Иркутской области, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.
Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).
Авторами не установлены данные о получении адвентивных корней in vitro вздутоплодника сибирского.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.
Поставленная задача решена тем, что получен штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro.
Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.
Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты растения in vitro вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду соответствующего гормонального состава в качестве экспланта. В результате был получен штамм адвентивных корней.
Причем, для получения растения in vitro в качестве эксплантов используют зрелые семена вздутоплодника. Семена стерилизуют перекисью водорода (H2O2) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем трехкратно отмывают в течение 5 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду без гормонов.
Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:
| NH4NO3 | 1650,000 ±2,0000 мг |
| KNO3 | 1900,000 ±2,0000 мг |
| MgSO4x7H2O | 370,000 ±1,0000 мг |
| KH2PO4 | 170,000 ±0,1000 мг |
| CaCl2x2H2O | 440,000 ±0,5000 мг |
| H3BO3 | 6,200 ±0,0100 мг |
| MnSO4x4H2O | 22,300 ±0,0200 мг |
| ZnSO4x7H2O | 8,600 ±0,0100 мг |
| KI | 0,830 ±0,0010 мг |
| Na2MoO4x2H2O | 0,250 ±0,0010 мг |
| CuSO4x5H2O | 0,025 ±0,0001 мг |
| CoCl2x6H2O | 0,025 ±0,0001 мг |
| FeSO4x7H2O | 2,785 ± 0,001 мг |
| Na-ЭДТА | 3,725 ±0,001 мг |
| Тиамин | 0,100 ±0,0010 мг |
| Пиридоксин | 0,100 ±0,0010 мг |
| Сахароза | 30000,000 ±100,0000 мг |
| Вода | 1000 мл |
| Агар | 5000 мг |
Полученную в результате растение in vitro помещают в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина.
Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 адвентивных корней.
Полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют морфологические характеристики.
Штамм (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) ВС-1 идентифицирован и депонирован в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, И-276, ул. Ботаническая, 35.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки: корни имеют одинаковые ответвления, темно-оранжевой окраски.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы корней отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу корней получают после лиофильной сушки.
При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 25 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.
Таким образом, выявлен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) из семян через растения in vitro, обладающие стабильными ростовыми параметрами и морфологическими характеристиками, причем, получение соединений может быть выполнено вне сезонной зависимости производства.
Таблица
Ростовые параметры адвентивных корней вздутоплодника сибирского
| Показатели | Значения |
| Индексы роста по:весу сухой биомассывесу сырой биомассы | 5±0,55±0,5 |
| Удельная скорость роста, сут-1 | 0,12 ±0,05 |
| Время удвоения, сут. | 12 ±2 |
Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:
| NH4NO3 | 1650,000±2,0000 мг, |
| KNO3 | 1900,000±2,0000 мг, |
| MgSO4×7H2O | 370,000±1,0000 мг, |
| KH2PO4 | 170,000±0,1000 мг, |
| CaCl2×2H2O | 440,000±0,5000 мг, |
| Н3ВО3 | 6,200±0,0100 мг, |
| MnSO4×4H2O | 22,300±0,0200 мг, |
| ZnSO4×7H2O | 8,600±0,0100 мг, |
| KI | 0,830±0,0010 мг, |
| Na2MoO4×2H2O | 0,250±0,0010 мг, |
| CuSO4×5H2O | 0,025±0,0001 мг, |
| CoCl2×6H2O | 0,025±0,0001 мг, |
| FeSO4×7H2O | 2,785±0,001 мг, |
| Na-ЭДТА | 3,725±0,001 мг, |
| тиамин | 0,100±0,0010 мг, |
| пиридоксин | 0,100±0,0010 мг, |
| сахароза | 30000,000±100,0000 мг, |
| вода | 1000 мл, |
| агар | 5000 мг, |
дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.