Ветеринарная композиция для повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц и способ повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц

Ветеринарная композиция для повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц и способ повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для иммунизации млекопитающих и птиц, предпочтительно, сельскохозяйственных животных, а также для профилактики и/или лечения широкого круга заболеваний, в том числе и инфекционных заболеваний различной этиологии у сельскохозяйственных животных.

В течение последних десятилетий, чтобы приспособиться к растущему спросу, мировая индустрия производства мяса претерпевает резкие скачкообразные изменения, при этом научный интерес к органическому производству мяса птицы и млекопитающих существенно возрос.

Чтобы повысить общую продуктивность и иммунный статус, в производстве мяса птицы и млекопитающих используется большое количество непитательных кормовых добавок, преимущественно антибиотиков. Некоторые из них рекомендованы для химиотерапевтических и профилактических целей, другие предназначены для стимуляции роста. Продолжительное использование суб-терапевтических доз таких кормовых добавок в составе корма может привести к накоплению их остаточных количеств в продуктах животного происхождения и развитию устойчивых к препаратам микроорганизмов у человека. В последние годы антибиотики больше не являются основной частью программ большинства компаний-производителей мяса птицы и млекопитающих. Европейский Союз рекомендовал отказаться от использования антибиотиков, в том числе хлортетрациклина, в качестве стимуляторов роста, для увеличения продуктивности и снижения смертности (Perreten V. 2003. Use of antimicrobials in food-producing animals in Switzerland and the European Union (EU). Mitt. Lebensm. Hyg. 94:155-163). Это необходимо, поскольку устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и их фрагментам в мясных продуктах может вредить здоровью потребителей. Запрет на использование синтетических кормовых добавок привел к запуску широкомасштабных исследований с целью поиска и разработки альтернативных способов поддержания здоровья и продуктивности для развивающейся системы производства мясной продукции. Основные усилия селекции направлены на активацию роста, однако подобные изменения негативно коррелируют с иммунологическими параметрами птицы и животных. В настоящее время большинство исследований направлено на создание препаратов, которые были бы способны как стимулировать рост птицы и млекопитающих, так и играть роль в увеличении продуктивности и укреплении иммунитета к различным заболеваниям. В качестве альтернативы антибиотикам-стимуляторам роста, разработаны такие стимуляторы роста, как пробиотики, пребиотики и иммуномодуляторы, при этом птицы и млекопитающие, генотипы которых определяют большую массу тела, развивают более слабый гуморальный иммунный ответ (Miller L.L., Siegel Р.В., and Dunnington E.A. 1992. Inheritance of antibody response to sheep erythrocytes in lines of chickens divergently selected for fifty-six-day body weight and their crosses. Poult. Sci., 71: 47-52).

Из уровня техники известно использование ветеринарных композиций для профилактики и/или лечения различных, в том числе и инфекционных, заболеваний (RU 20059408 C1, А61K 9/08, 1996; RU 2440121 С1, А61K 31/7016, 2011).

Из уровня техники также известно использование различных биодобавок растительного происхождения, в том числе и включающих различные микроэлементы, ферменты и синтетические препараты (RU 2007456 C1, А23K 1/65, 1994; RU 2105496 C1, А23K 1/16, 1998; RU 2340204 C1, А23K 1/00, 2008; RU 2420089 C1, А23K 1/00, 2011; RU 2450532 С1, А23K 1/00, 2012), которые в значительном количестве вводят в рацион при кормлении животных.

Также известно использование различных стимуляторов роста для повышения прироста живой массы животных (RU 2102063 C1, А23K 1/00, 1998; RU 2268043 С2, А23K 31/41, 2006; КЛЕНОВА И.Ф., ЯРЕМЕНКО Н.А. Ветеринарные препараты в России. Справочник. М., Сельхозиздат, 2001, с. 171-174; ДЕМИДОВ Н.В. Антгельминтики в ветеринарии. М., Колос, 1982, с. 250-298).

Однако вышеуказанные препараты, как правило, многокомпонентные, имеют ограниченный диапазон эффективного воздействия и могут обладать побочным влиянием.

Изобретение направлено на создание эффективного и безопасного средства в виде ветеринарной композиции, обеспечивающей эффективную иммунизации млекопитающих и птиц, преимущественно, сельскохозяйственных животных, а также профилактику и/или лечение широкого круга заболеваний, в том числе и инфекционных, различной этиологии у сельскохозяйственных животных.

Решение поставленной задачи и достижение заявленного технического результата обеспечивается тем, что ветеринарная композиция для повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц, преимущественно, у сельскохозяйственных животных согласно изобретению, содержит активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

Предпочтительно, ветеринарная композиция содержит активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору, или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

Предпочтительно, ветеринарная композиция содержит активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

При этом активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору, или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору используют в виде активированного - потенцированного водного или водно - спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно - спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения.

Ветеринарная композиция может быть выполнена в твердой лекарственной форме в виде комплексного препарата и содержит технологически необходимое количество нейтрального носителя, насыщенного активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированной - потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека или активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированной - потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека и активированной - потенцированной формой антител к CD4 рецептору, или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору, и фармацевтически приемлемые добавки.

При этом фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Как вариант, фармацевтически приемлемые добавки включают изомальт, цикламат натрия, сахарин натрия, лимонную кислоту безводную и магния стеарат.

Причем водный или водно - спиртовой раствор активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированной - потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека или активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированной - потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека и активированной - потенцированной формой антител к CD4 рецептору, или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору, предпочтительно, получен путем многократного последовательного разведения матричного раствора антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или матричного раствора антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и матричного раствора антител к гамма-интерферону человека или матричного раствора антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и матричного раствора антител к гамма-интерферону человека и матричного раствора антител к CD4 рецептору или матричного раствора антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и матричного раствора антител к CD4 рецептору в сочетании с внешним воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

Кроме того, используют смесь различных разведений антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к гамма-интерферону человека или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к CD4 рецептору, приготовленных по гомеопатической технологии.

Решение поставленной задачи и достижение заявленного технического результата обеспечивается также тем, что в способе повышения эффективности иммунизации и профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц, согласно изобретению, в организм вводят ветеринарную композицию, содержащую активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или активированную - потенцированную форму антител к рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

Предпочтительно, в организм вводят активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или активированную - потенцированную форму антител к β-субъединице рецептору инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

Предпочтительно, в организм вводят активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору, или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

При этом активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору используют в виде активированного - потенцированного водного или водно - спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 или активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к CD4 рецептору в водном или водно - спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения.

При этом в организм вводят смесь различных разведений антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к гамма-интерферону человека или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептор или антител к С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина и антител к CD4 рецептору, приготовленных по гомеопатической технологии.

Согласно изобретению, для профилактики инфекционных заболеваний у сельскохозяйственных животных и повышения эффективности иммунизации ветеринарную композицию, предпочтительно, применяют 3-4 раза курсом в течение 4-7 дней.

В соответствии с изобретением заявленные водные или водно - спиртовые растворы обладают выраженной активностью, приобретенной в процессе технологической обработки в виде многократного последовательного уменьшения концентрации исходного вещества - антител к β-субъединице рецептора инсулина (С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина), антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору, которая обусловлена тем, что активированная - потенцированная форма антител к β-субъединице рецептора инсулина (С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина) активизирует метаболические процессы в клетках, оказывая влияние на углеводный обмен, при этом активированная - потенцированная форма антител к гамма-интерферону человека, воздействуя на различные звенья иммунитета, стимулирует основные параметры системы естественной резистентности организма, влияет на систему эндогенных интерферонов, стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ и функциональную активность фагоцитов и естественных клеток киллеров (ЕК-клеток), и обладает противовирусной активностью в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов, в том числе, в отношении вирусов гриппа (H3N2, H3N8, H1N1), включая птичий грипп (H5N1), вируса герпеса II типа, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), вируса иммунодефицита кошек (ВИК), а активированная - потенцированная форма антител к гамма интерферону человека обладают антибактериальной активностью в комплексной терапии бактериальных инфекций и в профилактике бактериальных осложнений. Активированная - потенцированная форма антител к CD4 рецептору регулируют функциональную активность CD4 рецептора, что приводит к повышению функциональной активности CD4 лимфоцитов, нормализуют иммунорегуляторный индекс CD4/CD8, а также субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20).

Совместное применение заявленных компонентов ветеринарной композиции сопровождается усилением активности входящих в него компонентов, что обеспечивает эффективную иммунизации млекопитающих и птиц, преимущественно, сельскохозяйственных животных, а также профилактику и лечение широкого круга заболеваний, в том числе и инфекционных, различной этиологии у сельскохозяйственных животных.

Заявленный состав ветеринарной композиции, предположительно, за счет вышеуказанных механизмов регулируют процессы метаболизма, оказывают противовирусное и антибактериальное действие и эффективен в отношении возбудителей вирусных, бактериальных и микоплазменных инфекций птиц, ньюкаслской болезни, болезни Гамборо, а также повышает иммунитет, усиливает гуморальный иммунный ответ на вакцины, благодаря чему повышается эффективность иммунизации и сохранность поголовья, возрастает продуктивность, снижаются затраты корма, что определено экспериментально.

Предложенное использование активированной - потенцированной формы антител к β-субъединице рецептора инсулина (С-концевому фрагменту β-субъединицы рецептора и инсулина), в том числе и в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека и к CD4 рецептору расширяет арсенал средств, предназначенных для эффективной иммунизации, профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, при высокой сохранности млекопитающих и птиц, не вызывает побочных эффектов не оказывают общетоксического, иммунотоксического, местнораздражающего, аллергизирующего действия, не обладают репродуктивной токсичностью, (что обусловлено, в силу высоких разведений, практическим отсутствием или сверхмалой дозой молекул исходного вещества). Экспериментально установлено, что длительное применение ветеринарной композиции не сопровождается развитием таких побочных эффектов, как гипогликемия и ацидоз.

При этом возможно применение заявленной ветеринарной композиции в сочетании с другими биоактивными пищевыми добавками и/или препаратами, предназначенными как для повышения прироста живой массы и стимуляции роста сельскохозяйственных животных, так и для повышения эффективности иммунизации, профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний.

Заявленную ветеринарную композицию приготовляют следующим образом.

Для приготовления активированной - потенцированной формы действующих компонентов используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с. 9-33; или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol. 14. - N 1-2. P. 33-55.

Для проведения экспериментальных исследований могут быть использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридомных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном или конъюгированным антигеном: β-субъединицей рецептора инсулина (С-концевым фрагментом β-субъединицы рецептора инсулина), гамма - интерфероном человека и к CD4 рецептору. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной - потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Для получения поликлональных антител к β-субъединице рецептора инсулина в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу рецептора инсулина человека следующей последовательности:

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 1

Возможно для получения поликлональных антител к β-субъединице рецептора инсулина в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу бета-субъединица человеческого рецептора инсулина следующей последовательности:

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 2

Возможно для получения поликлональных антител к β-субъединице рецептора инсулина в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, полипептидный фрагмент С-концевого фрагмента бета-субъединицы человеческого рецептора инсулина, выбираемый, например, из следующих последовательностей:

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 3

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 4

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 5

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 6

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 7

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Выделение из антисыворотки антител к β-субъединице рецептора инсулина возможно следующим образом:

10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к β-субъединице рецептора инсулина с антигеном β-субъединицей рецептора инсулина), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к β-субъединице рецептора инсулина, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Для получения поликлональных антител к гамма - интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу гамма - интерферона человека следующей последовательности:

Последовательность 8

Возможно для получения поликлональных антител к гамма - интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов использование адъюванта и, например, одного полипептидного фрагмента гамма - интерферона человека, выбранного из следующих последовательностей::

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 9

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 10

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 11

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 12

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 13

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 14

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 15

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 16

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 17

Поликлональные антитела к гамма-интерферону могут быть получены с использованием молекул рекомбинантного гамма-интерферона следующей последовательности:

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 18

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 19

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Выделение из антисыворотки антител к гамма-интерферону возможно следующим образом:

10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na2SO4, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к гамма-интерферону с антигеном (гамма-интерферон), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к гамма-интерферону, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Поликлональные антитела к CD4 рецептору получают по вышеуказанному способу, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и цельную молекулу или один полипептидный фрагмент CD4 рецептора, выбранный, например, из следующих аминокислотных последовательностей:

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02%) и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Выделение из антисыворотки антител к гамма-интерферону возможно следующим образом:

10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na2SO4, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к гамма-интерферону с антигеном (гамма-интерферон), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к CD4 рецептору (например, к CD4 рецептору Т-лимфоцитов), очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Активированную - потенцированную форму каждого компонента ветеринарной композиции готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части каждого подвергаемого разведению раствора, начиная с упомянутого матричного раствора, в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя в сочетании с многократным вертикальным встряхиванием (потенцированием, или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с. 14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть матричного (исходного) раствора антител, например, к β-субъединице рецептора инсулина человека, с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного (или водно-спиртового) растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют, получая 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно 12 раз в разных емкостях 1-ой части исходного матричного раствора антител к β-субъединице рецептора инсулина с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений С 30 и С 50.

При использовании, например, активированной - потенцированной формы антител к β-субъедин