Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в пцр

Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в пцр

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области органической и биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины, а именно, к новым модифицированным нуклеозидтрифосфатам, содержащим индоцианиновый краситель, присоединенный через линкеры различного строения, включающие транс-алкеновую и гидрофильную сульфамидную группу, а также к новому способу получения цианиновых красителей с сульфамидоалкильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента. Предлагаемые соединения и материалы на их основе могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР.

Уровень техники

Нуклеозидтрифосфаты, меченые цианиновыми красителями ближнего ИК-диапазона, представляют особый интерес ввиду чрезвычайно высокой чувствительности их регистрации, что позволяет использовать их в качестве инструмента для решения задач молекулярной биологии и медицины. Красители различаются природой и расположением заместителей и функциональных групп, что приводит к различиям в суммарном электрическом заряде, пространственной ориентации относительно линкера, способности к неспецифической сорбции, другим межмолекулярным взаимодействиям, что отражается на эффективности флуоресцентно-меченных нуклеотидов включаться в ДНК, синтезируемую в ходе ПЦР, под действием матрично-зависимьгх ДНК-полимераз.

Авторами патента (Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid, European patent, 1152008, - 2001, Fuji photo film со., Япония) предложено в качестве флуоресцентных меток для получения флуоресцентно-меченного нуклеозидтрифосфата использовать водорастворимые цианиновые красители, содержащие сульфонамидную группу в положении 5, а карбоксиалкильную группу в положении 1. Авторами из мРНК путем обратной транскрипции получены флуоресцентно-меченные кДНК, которые затем использовали в ПЦР (метод ПЦР с применением обратной транскрипции). Для выявления влияния структуры красителей на интенсивность флуоресценции полученного ПЦР-продукта проведена реакция обратной транскрипции при использовании коммерчески-доступных Cy5-dUTP и Су3-dUTP конъюгатов (Amersham Pharmacia Biotech). Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции маркированных полученными красителями Су5 и Су3 ПЦР-продуктов выше в 8 и 3.5 раза соответственно по сравнению с коммерчески-доступным продуктом Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech).

В патенте (Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds, European patent, 1211294, - 2002, Innosense S.r.l., Италия) для синтеза флуоресцентно-меченного dUTP предложено использовать водорастворимые индоцианиновые красители, содержащие в своей структуре от одной до трех сульфогрупп. Эффективность данных соединений для флуоресцентного маркирования ДНК в ходе ПЦР не указывается.

В патенте (Modified carbocyanine dyes and their conjugates, European patent, 1801165, - 2007, Molecular Probes Inc., США) фирмой Molecular Probes предложены новые индодикарбоцианиновые красители с карбоксипентильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента. Синтезированные красители характеризуются высоким показателем молярного коэффициента экстинкции (до 250000 л⋅моль-1⋅см-1) и повышенным значением квантового выхода флуоресценции (0.34) по сравнению с индодикарбоцианиновыми красителями с карбоксипентильной группой в положении 1. При помощи синтезированного тетрасульфированного красителя получен флуоресцентно-меченый dUTP, который рекомендован для ник трансляции и метода in-vitro транскрипции, но не для ПЦР.

В патенте (Cyanine dye labeling reagents with meso-substitution, US patent, 2004186278, - 2004, Amersham Biosciences Corp., США) для получения флуоресцентно-меченного dUTP использовали цианиновые красители с заместителем в мезо-положении полиметиновой цепи. Введение цианогруппы в мезо-положение позволило авторам гипсохромно сместить полосы в спектрах возбуждения и флуоресценции на 40 нм. Маркированный dUTP далее использовали для получения флуоресцентно-меченых ПЦР-продуктов.

В патенте (New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm, European patent, 1491591, - 2004, Visen medical inc., Италия) предложена серия флуоресцентных цианиновых красителей с карбоксильной группой, присоединенной через сульфамидоалкильную цепь в положении 5. Авторы утверждают, что такого рода красители имеют явное преимущество перед их аналогами - с карбоксиалкильной группой в положениях 1 и 5. Для синтеза красителей с сульфамидоалкильным заместителем применяли соответствующие модифицированные индолениновые основания, которые в свою очередь синтезировали из сульфоиндоленина через образование сульфохлорида. Сульфохлорид получали с выходом 60% из соответствующего сульфоиндоленина действием смесью пентахлорида фосфора и хлорокиси фосфора. Образовавшееся активное производное обрабатывали в пиридине гидрохлоридом трет-бутилового эфира аминокислоты, и с выходом 80% образовывался индоленин с сульфамидной группой в положении 5. Далее проводили сульфоалкилирование при помощи 1,4-бутансультона, и удаляли защитную группу нагреванием в смеси метанол/концентрированная соляная кислота. Краситель синтезировали, использую стандартную схему получения цианиновых красителей - из двух солей индолениния и дианила малонового альдегида в уксусном ангидриде с добавлением пиридина. По предложенной схеме синтезированы красители с различной длиной сопряженной полиметиленовой цепи - 3, 5 или 7 метиленовых групп и различными индолениновыми фрагментами. Были получены активные производные красителей - гидроксисукцинимдные эфиры, которые ковалентно присоединяли к 5-(3-амин-1-пропинил)-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфату. Предлагаемый метод получения красителей включает много стадий синтеза, требует установки и снятия защитных групп, что делает его чрезвычайно сложным в исполнении. Авторы данного патента в дезоксиуридинтрифосфатах используют линкер, включающий пропинильную и сульфамидную группу, однако отсутствуют данные по их синтезу, спектрально-люминесцентных характеристиках и возможности использования в ПЦР.

Авторами патентов (Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid, European patent, 1152008, - 2001, Fuji photo film со., Япония; Fluorescent cyanine dye, European patent, 1810998, - 2007, Ferrania Technologies S.p.A., Италия) предложен синтез цианинового красителя с сульфонамидной группой в положении 5 индоленинового цикла. Для этого предварительно получали соответствующие индолениновые основания циклизацией по Фишеру замещенных гидразинов и изопропилметилкетона с последующим алкилированием этил иодидом, 6-бромгексановой кислотой и 2-(2-йодоэтокси)-этанолом. Получение замещенных фенилгидразинов с сульфамидными заместителями в положении 5 является отдельной сложной и трудоемкой задачей.

В патенте (Biocompatible N, N-Disubstituted Sulfonamide-Containing Fluorescent Dye Labels, US patent, 20090130024, - 2009, VISEN MEDICAL, INC., США) представлены цианиновые красители с N,N'-дизамещенной карбоксиалкилсульфамидной группой, синтез которых осуществляли через предварительное получение соответствующих индолениновых оснований. Схема синтеза, используемая для получения модифицированных индоленинов аналогична схеме, представленной в патенте (New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm, European patent, 1491591, - 2004, Visen medical inc., Италия).

Все вышеперечисленные способы получения цианиновых красителей с сульфамидным заместителем имеют ряд принципиальных недостатков: многостадийность, большие энергозатраты (высокая температура, давление и длительность процесса), необходимость использования специального оборудования, применение в качестве исходных реагентов аминокислот с защитной группой, что вызывает необходимость их предварительного получения. Получение замещенных солей индолениния сопровождается многочисленными побочными реакциями за счет их высокой реакционной способности. Выделение и очистка целевых индолениниевых солей методами кристаллизации не обеспечивает должной степени очистки, а хроматографическое разделение препаративных количеств практически невозможно. Чем больше химических стадий проводится на производных индолениния, тем больше они содержат примесей, что приводит к образованию многочисленных побочных продуктов на стадии синтеза красителей. Очистка таких красителей является отдельной сложной задачей.

Авторами патента (Sulfonyl Cyanine Dyes and Derivatives, US patent, 20100041901, - 2010, COMBINIX, INC., США) представлен синтез симметричных цианиновых красителей с сульфамидоалкильными заместителями. Для этого симметричный дисульфированный цианиновый краситель обрабатывали хлорокисью фосфора в DMF с образованием дисульфонилхлорида. Затем реакцией активного производного красителя и алифатического диамина получали соответствующий симметричный краситель. Реагент хлорокись фосфора в DMF, известный как реагент Вильсмейера-Хаака, обладает не только хлорирующим действием, но и эффективно формилирует ароматические соединения. Поэтому получение дисульфонилхлорида из дисульфированного красителя данным методом сопровождается образованием побочных продуктов, которые в свою очередь реагируют с алифатическими аминами. В итоге конечный продукт загрязнен трудноотделяемыми многочисленными примесями. Описанный способ синтеза цианиновых красителей с сульфамидным заместителем предлагается только для симметричных красителей.

К недостаткам данного способа синтеза цианиновых красителей с сульфамидным заместителем является невозможность получения асимметричного красителя с одной сульфамидной группой.

Таким образом, анализ имеющихся литературных данных показал, что описанные методы синтеза несимметричных цианиновых красителей с карбоксиалкилсульфамидным заместителем в положении 5 индоленинового фрагмента сложны и малоэффективны. Предложенный нами способ синтеза красителей, с карбоксиалкилсульфамидным заместителем в положении 5 индоленинового фрагмента, проще, эффективнее, позволяет варьировать химическое строение функциональных блоков, используемых при синтезе флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов. Флуоресцентно-меченные трифосфаты предложенной структуры воспринимаются матрично-зависимой Taq ДНК-полимеразой в качестве субстрата и флуоресцентно-меченные нуклеотиды эффективно включаются в ДНК синтезируемую в ходе ПЦР.

Раскрытие изобретения

Введение флуоресцентно-меченных нуклеотидов при помощи ДНК-полимераз в ходе ПЦР нашло широкое применение для маркирования ДНК. Однако, эффективность процесса маркирования сильно зависит от типа введенного красителя, а также строения линкера, связывающего нуклеиновое основание и флуорофор. Известно, что для модификации нуклеотидов лучше всего подходит положение 5 пиримидинового цикла, поскольку в двунитевых ДНК оно ориентировано в широкую бороздку и не ингибирует взаимодействие А/Т-оснований. В качестве меченых субстратов для ДНК-полимераз на основе 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата хорошим вариантом являются его производные с линкерами на основе Е-этена (транс-изомер этилена).

Целью настоящего изобретения явился синтез новых флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов, содержащих в положении 5 электронейтральный моносульфированный индокарбоцианиновый краситель, присоединенный через линкеры различного строения, включающие транс-алкеновую и гидрофильную сульфамидную группу, и их применение для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а так же разработка способа получения цианиновых красителей с сульфамидоалкильным заместителем, входящих в состав новых модифицированных нуклеозид трифосфатов.

Поставленная цель достигается структурой заявляемого нового типа флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А).

где:

R¹ представляет собой -Н; -СН₂ОН; -(CH₂)₂S(O)CH₃;

R² представляет собой -Н, -СН₃;

n=0-5

m=1-3

M⁺ представляет собой H⁺, Na⁺, Li⁺, K⁺, [CH₃(CH₂)_n]_(4-m)NH_m⁺(где n=0-5, m=0-4).

Предлагаемые флуоресцентно-меченные трифосфаты общей формулы (А) характеризуются тем, что реактивная карбоксильная группа индоцианиновых красителей общей формулы (В), входящих в их состав, присоединена в 5 положении индоленинового фрагмента через гидрофильную сульфамидоалкильную цепочку атомов (где R¹, R² -алкильные-, гидрокси- и сульфоалкильные заместители).

где:

R¹ представляет собой -Н, -СН₃;

R² представляет собой -Н; -СН₂ОН; -(CH₂)₂S(O)CH₃;

n=0-5

m=1-3

Указанные структурные отличия индоцианиновых красителей общей формулы (В), входящих в состав нуклеозидтрифосфатов (А), приводят к ряду отличительных свойств. Ось хромофора, проходящая через сопряженную полиметиновую цепочку связей красителя, является продолжением линкера, соединяющего его с пиримидиновым основанием. Изменение пространственной ориентации хромофора относительно молекулы нуклеотида и введение гидрофильного линкера оказывает положительное влияние на эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР. Для получения линкера, соединяющего молекулу красителя и dUTP, использовали следующие алифатические аминокислоты: аминоуксусную кислоту, 2-аминопропионовую кислоту, аминокапроновую кислоту, метионинсульфоксид, серии, N-метиламиноуксусную кислоту, N-метиламинобутановую кислоту.

Для выполнения поставленной цели разработан способ получения модифицированных индоцианиновых красителей общей формулы (В), позволяющий расширить номенклатуру исходных соединений для синтеза флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов формулы (А). Техническим результатом является введение требуемого заместителя в индольный каркас красителя, увеличение выходов и простота выделения и очистки продуктов реакции.

В основе заявляемого способа лежит непосредственная модификация индоцианинового красителя, содержащего две сульфогруппы, путем превращения одной из сульфогрупп в положении 5 индоленинового фрагмента в карбоксиалкил сульфамидную. Сущность способа заключается в предварительном получении сульфохлорида индоцианинового красителя путем взаимодействия сульфогруппы в положении 5 с PCl₅ в триметилфосфате. Далее активное производное, полученное в реакции с PCl₅, без выделения обрабатывали раствором аминокомпонента в бикарбонатном буферном растворе. Реакция проводится при +20°С и атмосферном давлении. Предлагаемый метод получения асимметричных красителей, «синтез в одном сосуде», позволяет получать асимметричный продукт с минимальным количеством стадий. Минимальное количество побочных продуктов упрощает процедуру выделения и очистки целевого красителя. Продукт реакции общей формулы (В) выделяют обращено-фазовой хроматографией на колонке C18-RP в системе ацетонитрил-0.1М ТЕАА в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% ацетонитрила. Выход целевого продукта, содержащего карбоксиалкилсульфамидный заместитель, составляет 25-30% (в зависимости от структуры соединения).

Новизна настоящего изобретения состоит в том, что получение сульфамидной группы проводится путем непосредственной модификации функциональной группы, связанной с индолениновым ядром в структуре индоцианинового красителя, «синтез в одном сосуде». До сих пор такие модификации осуществлялись посредством многостадийного синтеза соответствующих замещенных индолениновых оснований с последующим получением цианиновых красителей.

Существенные отличия предлагаемого способа от аналогов:

1. Предлагаемый способ базируется на использовании в качестве исходного соединения индоцианинового красителя, обладающего интенсивной окраской, что существенно облегчает контроль образования целевых соединений общей формулы (В), а также их выделение и очистку.

2. Реакцию получения соединений общей формулы (В) проводят при атмосферном давлении, при охлаждении до 0°С с последующим нагреванием до комнатной температуры, в растворителе, не требующем предварительную очистку, без использования инертного газа.

3. Реакцию получения соединений общей формулы (В) проводят в одну стадию («синтез в одном сосуде») без выделения промежуточных соединений.

4. Проведение реакции «в одном сосуде» без выделения промежуточных лабильных сульфохлоридов позволяет получать соединения общей формулы (В) при температуре 0-20°С, избегая осмоления реакционной массы, добиться выходов целевых продуктов в пределах 30%, при этом исходный цианиновый краситель выделяется в неизмененном виде и используется повторно.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:

1. Способ позволяет проводить реакцию в «в одном сосуде» без выделения промежуточных продуктов.

2. Способ позволяет значительно уменьшить температуру (от 120°С до 0°С с последующим нагреванием до 20°С), время синтеза с нескольких дней и недели сократить до 16 ч, не требует использования специального оборудования (кроме колбы и магнитной мешалки) и инертного газа, тем самым позволяет существенно упростить синтез и снизить себестоимость целевого продукта.

3. Способ не требует использования аминокислот с защитной группой на карбоксильной функции.

4. Способ не требует предварительного получения солей индолениния с сульфамидным заместителем (длительный, трудоемкий синтез в агрессивной среде).

Полученный технический результат позволяет расширить ряд производных общей формулы (В) и тем самым номенклатуру флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А). Таким образом, совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата.

Были определены спектрально-люминесцентные характеристики красителей общей формулы (В) (m=2). Значения молярного коэффициента экстинкции красителей превышают 230000 (таблица 1). Квантовый выход флуоресценции красителей (В) в PBS превышает 25% (таблица 1). Предлагаемые красители структур (В) в зависимости от заместителей в гетероциклическом фрагменте различаются спектральным диапазоном возбуждения и флуоресценции, суммарным электрическим зарядом и растворимостью в воде (таблица 1).

Далее представлены результаты использования красителей для получения флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А) с последующим их применением для маркирования ДНК в ходе ПЦР.

Все красители общей формулы (В) в виде их пара-нитрофениловых эфиров (R³=-pNP) с выходом 60-70% (в зависимости от структуры используемого красителя (В)) маркируют нуклеотиды, содержащие в С5-положении аминоаллильный заместитель. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов в соединениях по изобретению общей формулы (А), обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона). Варьирование перечисленных противоионов не оказывает влияния на спектрально-люминесцентные характеристики нуклеотидов общей формулы (А). Поэтому детальное описание свойств модифицированных нуклеотидов общих формул (А, М⁺=Na⁺) представлено на примере их натриевых солей.

Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные красителями с сульфамидоалкильными группами, характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции (Фиг. 1) и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS (Таблица 2). Максимумы поглощения и флуоресценции модифицированных красителями нуклеотидов располагаются в области 650 и 665 нм соответственно.

Установлено, что результаты полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) зависят от структуры модифицированных нуклеотидов, используемых в качестве субстратов в ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов общей формулы (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании тест-системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis (Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M., S., Markova O., A., Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zasedatelev A., Mirzabekov A. //Clin. Microbiol. Infect. 2005. V. 11. P. 531-539).

Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5 - Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S). Флуоресцентный сигнал оказался максимальным для нуклеотидов (А1)-(А3), содержащих цианиновый краситель с алифатическим аминолинкером, минимальным для (А4, А5) и уменьшается в ряду: (А1)=(A3) больше (А2) больше (А6, А7) (линкер с N-метильным заместителем) больше (А4, А5) (линкер с заместителем при альфа-углеродном атоме) (Таблица 2, Фиг. 2). Флуоресцентные сигналы, полученные при использовании нуклеотидов общей формулы (А) (кроме нуклеотида А6), оказались выше сигнала, полученного при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5.

Установлено, что все красители формул (В) в составе коньюгатов с нуклеотидами не ингибируют полимеразную цепную реакцию. Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) не влияют на стабильность всех остальных компонентов анализа. Установлено, что все соединения формулы (А) обладают стабильностью, достаточной для проведения полного цикла анализа без заметного разложения красителя. Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР позволяет получить флуоресцентный сигнал в 6 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Cy5 на примере использования тест системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).

По совокупности всех свойств соединения формулы (А) могут успешно использоваться для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также в качестве флуоресцентных меток при разработке диагностических тест-систем, основанных на проведении ПЦР.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Нормированные спектры поглощения и флуоресценции флуоресцентно-меченного дезоксиуридинтрифосфата.

Фиг. 2. Нормированный сигнал флуоресценции для различных модифицированных нуклеотидов общей формулы (А) при использовании диагностической тест- системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).

Таблица 1. Спектральные характеристики индоцианиновых красителей общей формулы (В) в PBS (+25°С) (R³=H). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Су5 (Q=28% (PBS), Amersham, GE Healthcare).

Таблица 2. Спектральные характеристики флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в PBS (+25°С). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Cy5-dUTP (Amersham, GE Healthcare PA55022). M⁺-H⁺, Na⁺, Li⁺, K⁺, [CH₃(CH₂)_x]_(4-y)NH_y⁺(где x=0-5, y=0-4).

Осуществление изобретения

Соединения по изобретению общей формулы (А) синтезировали, согласно схеме 1.

Схема 3

Для синтеза красителей общей формулы (В) нами предложен новый способ их получения. Для этого предварительно синтезирован симметричный индокарбоцианиновый краситель (4). Синтез симметричного индокарбоцианинового красителя (4) основан на реакции конденсации соли индолениния (2) и дианила (3) (схема 2) (В.Е. Кузнецова и др, Изв. АН, Сер. хим., 2007, №11, с. 2186-2190; В.Е. Кузнецова и др., Изв. АН, Сер. хим., 2007, №12, с. 2355-2359; V.E. Kuznetsova et al, Mend. Comm, 2008, №3, pp. 138-140). Проведение реакции с МЛЧдифенилформамидином (3, m=1), с гидрохлоридом дианила малонового диальдегида (3, m=2), с гидрохлоридом дианила глутаконового диальдегида (3, m=3) приводит к образованию красителей (4, m=1), (4, m=2) и (4, m=3) соответственно. Для полного протекания реакции достаточно нагревания при 118°С в течение 1-3 ч. Синтез промежуточных соединений, необходимых для получения красителей формул (В), представлен на схеме 3 (В.Е. Кузнецова и др., Изв. АН, Сер. хим. - 2008. - №3. - С. 595-598; В.Е. Кузнецова и др, Изв. АН, Сер. хим., 2007, №11, с. 2186-2190).

Конденсацией фенилгидразина (5) с метилизопропилкетоном (6) получали соответствующий индоленин (7) (схема 2). N-Алкильное производные получали действием этилового эфира n-толуолсульфокислоты на раствор индоленина (7) в бутиронитриле.

Краситель с карбоксильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента, присоединенной через сульфамидоалкильную цепь, получали из натриевой соли дисульфированного красителя (4) действием PCl₅ в триметилфосфате (схема 2). При этом всегда образовывалась смесь моно- и дисульфонилхлоридов. Варьированием условий проведения реакции удалось подобрать оптимальные параметры для получения моносульфонилхлорида. Сульфонилхлориды при действии влаги подвергаются реакции гидролиза, выделяющаяся при этом HCl разрушает хромофорную систему красителя. Поэтому активное производное, полученное в реакции с PCl₅, без выделения обрабатывали при охлаждении и интенсивном перемешивании раствором аминокислоты (схема 2) в бикарбонатном буферном растворе, который нейтрализует образующиеся в ходе реакции кислоты. Целевой продукт общей формулы (В) выделяли обращено-фазовой хроматографией на колонке C18-RP в системе ацетонитрил-0.1М ТЕАА в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% ацетонитрила. Выход продукта реакции, содержащего карбоксиалкилсульфамоил в положении 5, составляет 25-30% (в зависимости от структуры красителя (В)). Синтезированные красители отличаются повышенной водорастворимостью, за счет присутствия сульфамидного заместителя в структуре линкера, что позволит избежать агрегации и неспецифических взаимодействий при их использовании в составе нуклеотидов в биоанализе.

4-Нитрофениловые эфиры цианиновых красителей формулы (В) получали действием HBTU и pNP в DMF. Активированные эфиры выделяли обращенно-фазовой хроматографией. Реакцией аминогруппы AAdUTP (1) с 1.25 экв. 4-нитрофенилового эфира цианинового красителя в 0.1 М NaHCO₃/Na₂CO₃ (рН 9.0) в DMF получали флуоресцентно-меченные нуклеозидтрифосфаты общей формулы (А) с выходом 60-70% в зависимости от структуры используемого красителя. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов в красителях (В), обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона).

Флуоресцентно-меченные нуклеотиды общей формулы (А) очищали в 2 этапа - анионная ионообменная хроматография на сорбенте DEAE-целлюлоза и обращенно-фазовая (C18-RP) хроматография. Строение промежуточных и целевых соединений подтверждено данными УФ-, ¹Н-ЯМР спектроскопии, ³¹Р-спектроскопии и масс-спектрометрии. Использование на последней стадии выделения и очистки перхлората натрия позволило получить нуклеотиды формул А в виде их натриевых солей. Так же нуклеотиды формулы А можно получить в фосфорнокислой форме, в виде солей щелочных металлов и в виде различных аммониевых солей, используя на последнем этапе очистки вместо перхлората натрия соответствующие реагенты:

- 0.1М KCl - для получения калиевой соли нуклеотида;

- 0.1М LiCl - для получения литиевой соли нуклеотида;

- 0.1М ТЕАА - для получения триэтиламмониевой соли нуклеотида;

- 0.1М NH₄HCO₃ - для получения аммониевой соли нуклеотида.

Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные красителями с сульфамидными группами, характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS. Максимумы поглощения и флуоресценции модифицированных красителями нуклеотидов располагаются в области 650 и 665 нм соответственно.

Еще одним объектом изобретения является применение соединений по изобретению общей формулы (А) для маркирования ДНК в ходе ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании коммерческой тест-системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.

Микрочип представляет собой расположенные на подложке ячейки из гидрогеля с иммобилизованными внутри ячеек олигонуклеотидными зондами. Диаметр ячеек приблизительно 100 микрон. В разных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды различного строения. В ячейках, в которых строение зонда соответствует строению ампликона, происходит связывание ампликона в прочный комплекс, дуплекс. В тех ячейках в которых строение зонда не соответствует строению ампликона не происходит связывания ампликона. Результаты анализа оценивают по интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа. В ячейках, в которых произошло связывание флуоресцентно-меченого ампликона с зондом, наблюдается интенсивный сигнал флуоресценции. Для регистрации сигналов используют флуоресцентный микроскоп, снабженный компьютером со специальным программным обеспечением.

На величину сигналов влияют различные факторы: эффективность встраивания ДНК-полимеразой модифицированных нуклеотидов в амплифицированный продукт, специфическое связывание с образованием совершенных дуплексов с олигонуклеотидными зондами, находящимися в ячейках биочипа, неспецифическое связывание с компонентами ячейки биочипа, яркость флуоресценции флуоресцентной метки, связанной с амплифицированнм продуктом.

Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа (Kuznetsova V.Е., Spitsyn М.A., Shershov V.Е., Guseinov Т.О., Fesenko Е.Е., Lapa S.A., Ikonnikova A. Yu., Avdonina М.A., Nasedkina Т.V., Zasedatelev A.S., А.V. Chudinov. // Mend. Commun. 2016. V. 26. Р. 95-98) и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5) (Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S). Флуоресцентный сигнал оказался выше для нуклеотидов А1-А3, содержащих цианиновый краситель с алифатическим аминолинкером, и изменяется в ряду: (А1)=(A3)>(А2)>(А6, А7) (линкер с N-метильным заместителем)>(А4, А5) (линкер с заместителем при альфа-углеродном атоме).

Так же было показано, что количество сульфогрупп в структуре красителя сильно влияет на эффективность конъюгата. Флуоресцентные сигналы, полученные для нуклеотида (А4), содержащего метилоксисульфенильную группу в составе линкера, оказались ниже сигнала, полученного при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5, содержащего в своей структуре дисульфированный индодикарбоцианиновый краситель.

Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР позволяет получить флуоресцентный сигнал в 6 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Cy5 при определении мутаций Mycobacterium tuberculosis при использовании тест систем «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия). Исходя из вышеизложенного следует, что заявляемые флуоресцентно-меченные нуклеозид трифосфаты общей формулы (А) могут успешно использоваться для маркирования ДНК в ходе ПЦР.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Осуществление изобретения

Примеры соединений и их применение

В работе использовали реагенты и растворители марок "ОСЧ", "ХЧ" или "ЧДА" фирм Aldrich, Alfa Aesar, Fluka, Химмед.

DMF очищали перегонкой в вакууме в токе азота над фталевым ангидридом [т.кип. 46°С (10 Торр)]. Диизопропилэтиламин перегоняли над нингидрином, затем над КОН (т.кип. 126-127°С). Уксусный ангидрид кипятили с безводным ацетатом калия, а затем перегоняли (т.кип. 139-140°С).

1 М Триэтиламмоний-ацетатный буферный раствор (ТЕАА) получали следующим образом. К смеси деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду и интенсивном перемешивании добавляли по каплям под слой жидкости уксусную кислоту (57 мл, 1 моль) (до рН 7.0) и объем раствора доводили до 1 л.

1 М Триэтиламмоний-гидрокарбонатный буферный раствор (ТЕАНС) получали следующим образом. В смесь деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду, интенсивном перемешивании и контроле рН пропускали газообразный CO₂ (до рН 7.5) и объем раствора доводили до 1 л.

0.1М Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), 0.15 М NaCl, рН 7.4 готовили следующим образом. Смесь калия фосфата двузамещенного (0.87 г, 0.005 моль), калия фосфата однозамещенного (0.68 г, 0.005 моль) и хлорида натрия (9.0 г, 0.15 моль) растворяли в деионизованной воде (700 мл). Подщелачивали 1М раствором калия фосфата однозамещенного до рН 7.4 и доводили объем полученного раствора до 1 л.

Буферный раствор Трис/ЭДТА («ТЕ-буфер», 10 мМ Трис (рН 8.0), 1 мМ ЭДТА) приобретали в фирме Aldrich.

Пример 1. Получение фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 5)

Сульфаниловую кислоту (52.0 г, 0.3 моль) и углекислый натрий (16.5 г, 0.06 моль) растворяют при нагревании в воде (200 мл). Полученный раствор отфильтровывают и к нему добавляют по каплям концентрированную серную кислоту (35.0 г, 19.1 мл, 0.36 моль), при этом выпадает белый осадок. К суспензии при охлаждении на льду и перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (21.0 г, 0.3 моль) в воде (50 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 12°С. Дополнительное перемешивание продолжают еще в течение 15 мин. Выделившийся осадок диазосоединения собирают фильтрацией и промывают небольшим количеством ледяной воды.

К раствору сульфита натрия (85 г, 0.67 моль) в воде (250 мл) при перемешивании и охлаждении на льду с солью добавляют влажное диазосоединение порциями с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы была ниже +5°С. Дополнительно перемешивают 1 ч. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту (200 мл), при этом выпадает осадок. Для полного обесцвечивания смеси добавляют цинковую пыль (2.0 г). Реакционную массу выдерживают 12 ч при комнатной температуре. Осадок собирают фильтрацией, промывают холодной водой и сушат на воздухе. Получают фенилгидразин-n-сульфокислоту (соединение 5) с выходом 42 г (74%).

Пример 2. Получение калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7)

Смесь фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 5) (11.0 г, 0.06 моль), 3-метил-2-бутанона (7.7 мл, 0.072 моль) и ледяной уксусной кислоты (34 мл) кипятят в течение 3 ч, а затем выдерживают 12 ч при 0°С. Выпавший осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Получают 5.1 г (71%) индоленина.

ЯМР ¹Н (D₂O, δ, м.д.): 1.28 (с, 6Н, 2С(3)H₃), 7.47-7.79 (3Н, м, ArH)

5-Сульфо-2,3,3-триметилиндоленин (4.8 г, 0.02 моль) растворяют при нагревании в метаноле (25 мл). К полученному раствору добавляют по каплям раствор гидроксида калия (1.4 г, 0.024 моль) в метаноле (16 мл). Затем добавляют изопропиловый спирт (50 мл). Осадок отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Получают 4.7 г (85%) индоленина (соединение 7) в виде блестящих пластинок светло-бежевого цвета. λ_max 260 нм. Масс-спектр (MALDI) (C₁₁H₁₂NO₃S^-): найдено m/z 239.0, рассчитано m/z 238.28.

ЯМР ¹Н (D₂O, δ, м.д.): 1.19 (6Н, с, 2С(3)Н₃), 2.19 (3Н, с, С(2)Н₃), 7.41-7.7 (3Н, м, ArH)

Пример 3. Получение 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-этилиндолениния (соединение 2)

Смесь калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7) (2.4 г, 10 ммоль), триэтиламина (1.7 мл, 12 ммоль), этилового эфира n-толуолсульфокислоты (5.0 г, 25 ммоль) и бутиронитрила (10 мл) нагревают 20 ч при 118°С. По окончанию нагревания добавляют ацетон (30 мл). Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Получают 2.32 г (86%) индолениниевой соли (соединение 2), т.пл. 240-242°С. λ_max 228 нм. Масс-спектр (MALDI) (C₁₃H₁₇NO₃S): найдено m/z 268.4, рассчитано m/z 267.35.

ЯМР ¹Н (D₂O, δ, м.д., J/Гц): 1.43 (уш.с, 9Н, СН₂СН₃, 2С(3)Н₃), 4.36 (м, 2Н, СН₂СН₃), 7.63 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.75 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.97 (с, 1Н, ArH)

Пример 4. Получение натриевой соли 3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение 4).

Смесь 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-этилиндолениния (соединение 2) (210 мг, 0.8 ммоль), гидрохлорида дианила малонового диальдегида (соединение 3) (130 мг, 0.5 ммоль), уксусного ангидрида (8 мл) и диизопропилэтиламина (800 мкл) нагревают 4 ч при +70°С. Продукт реакции выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил - 0.1 М ТЕАА градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0.1М раствором NaCl, водой, зат