Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка

Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 61/504102, поданной 1 июля 2011 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Список последовательностей содержится в файле под названием «MONS294WO.txt» размером 41 килобайт (согласно оценке Microsoft Windows^®), который был создан 29 июня 2012 г., представлен в электронном виде и включен в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Изобретение в целом относится к области сельского хозяйства, растениеводству и молекулярной биологии. В частности, изобретение относится к способам и композициям для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в репродуктивной ткани мужских особей трансгенных растений и их применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Гибридные семена, т.е. семена, полученные способом гибридизации или перекрестного опыления близкородственных растений, могут быть выращены в потомственные гибридные растения, обладающие требуемой комбинацией признаков, отсутствующих у любого из родительских растений. Гибридные растения могут демонстрировать лучшие агрономические характеристики, включая улучшение размера растений, урожайность, питательную композицию, устойчивость к заболеваниям, толерантность к гербицидам, толерантность к стрессу, климатическую адаптацию и другие желательные признаки. Эффективное получение гибридных семян требует отсутствия самоопыления растения собственной пыльцой.

[0005] При получении гибридных семян у женской особи родительского растения можно предотвратить образование пыльцы и/или сбрасывание пыльцы для облегчения перекрестного опыления женской особи, а не для самоопыления. Такое предотвращение может быть достигнуто, например, удалением вручную содержащих пыльцу структур (например, удаления соцветия метелки у кукурузы ручным или механическим способом), использованием генетических способов контроля опыления (например, цитоплазматическая стерильность мужских особей, ядерная мужская стерильность) и/или использованием химического препарата.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Изобретение относится в целом к способам избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенных растений, конструкциям рекомбинантной ДНК, пригодным в таких способах, а также трансгенным растениям, клеткам и семенам, содержащим такие конструкции рекомбинантной ДНК. Конструкции рекомбинантной ДНК и трансгенные растения, клетки и семена, содержащие такие конструкции, обеспечивают значительно улучшенный способ использования гербицидов для индукции мужской стерильности у трансгенных растений для получения гибридных семян.

[0007] В одном аспекте изобретение предоставляет конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, которая кодирует рекомбинантный белок и специфический для мужской ткани элемент миРНК (мтс-миРНК), функционально связанный с кодирующей белок последовательностью. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включен в 3’-нетранслируемый участок кодирующей белок последовательности. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК расположен между кодирующей белок последовательностью и последовательностью полиаденилирования, которая является частью 3’-нетранслируемого участка. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения экспрессия рекомбинантного белка в трансгенном растении придает растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду. В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.

[0008] Другой аспект изобретения предоставляет способ получения конструкции рекомбинантной ДНК, включая идентификацию элемента мтс-миРНК, включая по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК и функционально связанный элемент мтс-миРНК с кодирующей белок последовательностью, например, последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный белок. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149, или по меньшей мере один элемент мтс-миРНК, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК является специфичным для метелки.

[0009] В дополнительном аспекте изобретение предоставляет трансгенное растение, включая конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, а также семена, клетку или часть трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения растение является однодольным растением. В другом варианте воплощения изобретения растение является растением кукурузы (Zea mays).

[0010] В дополнительном аспекте изобретение также предоставляет способ избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения путем экспрессии в трансгенном растении конструкции рекомбинантной ДНК, которая включает кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК. В другом варианте воплощения изобретения мужская репродуктивная ткань является метелкой растения кукурузы. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК является по меньшей мере одним элементом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения экспрессия рекомбинантного белка в трансгенном растении придает растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду. В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.

[0011] Изобретение также предоставляет способ индукции мужской стерильности у трансгенного растения, включая этап применения гербицида по отношению к трансгенному растению, имеющему в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, который придает трансгенному растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду, при этом гербицид применяют во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, тем самым индуцируя мужскую стерильность в трансгенном растении. В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является растением кукурузы. В другом варианте воплощения изобретения применение гербицида предотвращает по меньшей мере опадение пыльцы или выпячивание пыльников в обработанном трансгенном растении. В другом варианте воплощения изобретения стадию развития мужской репродуктивной ткани, во время которой используют гербицид, выбранный из группы, состоящей из стадии развития растения кукурузы V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 и V14. В другом варианте воплощения изобретения гербицид выбран из группы, состоящей из ингибиторов ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase), ингибиторов ацетолактатсинтазы (ALS), ингибиторов фотосистемы II (PSII), ингибиторов протопорфириногеноксидазы (PPO), ингибиторов 4-гидроксифенилдиоксигеназы (HPPD), ингибиторов 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS), ингибиторов глутаминсинтетазы (GS) и синтетических ауксинов. В другом варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.

[0012] Изобретение также предоставляет способ получения гибридных семян, включая применение эффективного количества гербицида по отношению к трансгенному растению, включающему в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, при этом гербицид применяют во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, тем самым индуцируя мужскую стерильность у трансгенного растения; опыление трансгенного растения пыльцой от второго растения; и сбор гибридных семян от трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является кукурузой. Эффективное количество гербицида является дозой гербицида, достаточной для придания трансгенному растению, включающему конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, мужской стерильности (эффективная доза). В другом варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS. В другом варианте воплощения изобретения глифосат применяют во время развития в эффективной дозе от примерно 0,125 фунтов кислоты в эквиваленте на акр до примерно 8 фунтов кислоты в эквиваленте на акр. Другие специфические варианты воплощения изобретения описаны в представленном ниже подробном описании. В тексте данной заявки и формуле изобретения, если в контексте не указано иначе, слово «включает» и его вариации, такие как «содержит» и «содержащий», будет пониматься как подразумевающее включение указанного целого числа, элемента или этапа, или группы целых чисел, элементов или этапов, но не исключение любого другого целого числа, элемента или этапа, или группы целых чисел, элементов или этапов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0013] Фиг.1 отображает картирование последовательностей мтс-миРНК на элементе мтс-миРНК (SEQ ID NO: 85), как это описано в примере 1. Ось Х слева направо представляет ориентацию элемента мтс-миРНК, при этом верхняя спираль представлена в верхней половине диаграммы, а нижняя спираль представлена в нижней половине диаграммы; нуклеотидная позиция в направлении от 5’ до 3’ показана слева направо вверху и справа налево внизу. Последовательности мтс-миРНК показаны в соответствующих позициях выравнивания. Ось Y представляет относительное обилие мтс-миРНК, экспрессируемой в ткани метелки в виде транскриптов на четверть миллиона последовательностей (tpq). Мтс-миРНК, представленные в библиотеке более часто, обведены кружком.

[0014] Фиг.2 отображает анализ нозерн-блоттинг для измерения экспрессии мРНК, специфической для метелки, как это описано в примере 2.

[0015] Фиг.3 отображает картирование последовательностей мтс-миРНК на элементе мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87), как это описано в примерах 2 и 8. Ось Х слева направо представляет ориентацию элемента мтс-миРНК, при этом верхняя спираль представлена в верхней половине диаграммы, и нижняя спираль представлена в нижней половине диаграммы; нуклеотидная позиция в направлении от 5’ до 3’ показана слева направо вверху и справа налево внизу. Последовательности мтс-миРНК показаны в их соответствующих позициях выравнивания. Указаны три последовательности мтс-миРНК, используемые для получения трех специфических зондов (sR648011 (SEQ ID NO: 8), sR1372590 (SEQ ID NO: 26) и sR410590 (SEQ ID NO: 33)).

[0016] Фиг.4 отображает анализ нозерн-блоттинг временной экспрессии элемента мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87) в зрелой метелке с использованием РНК от различной инбредной зародышевой плазмы, как это описано в примере 2.

[0017] Фиг.5 отображает локализацию экспрессии миРНК in situ в зрелом пыльнике с использованием антисмысловых (слева) или смысловых (справа) зондов для последовательности мтс-миРНК (sR648011, SEQ ID NO: 8), как это описано в примере 2.

[0018] Фиг.6 отображает локализацию белка CP4-EPSPS в пыльниках от необработанных распылением растений, трансгенных на предмет конструкции 3 (фиг.6А) или конструкции 4 (фиг.6В), как это описано в примере 4. Растения кукурузы, трансгенные на конструкцию 3, содержат кассету экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК. Растения с конструкцией 4 являются контролем.

[0019] Фиг.7 отображает трансгенные растения кукурузы, полученные из конструкций, содержащих кассету экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК, которые были вегетативно толерантны к глифосату и имели индуцированную мужскую стерильность с поздним применением глифосата, как это описано в примере 7. Фиг.7А отображает трансгенные растения кукурузы с и без обработки глифосатом. Фиг.7В отображает метелки от необработанных трансгенных растений, и фиг.7С отображает пыльцевые зерна необработанных трансгенных растений. Фиг.7D отображает метелки от обработанных трансгенных растений, и фиг.7Е отображает пыльцевые зерна обработанных трансгенных растений.

[0020] Фиг.8 отображает данные для одного года полевых исследований, измеряющих показатель мужской фертильности (ПМФ) после поздней обработки глифосатом. Фиг.8А отображает среднее значение ПМФ, полученное при трех различных режимах обработки глифосатом (Trt 1, Trt 2 и Trt 3) для NK603 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза), MON 87427 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза с индуцированной глифосатом мужской стерильностью) и двух явлений, связанных с конструкцией 3, как это описано в примере 5; пунктирная линия указывает на промышленный стандарт для мужской стерильности, ПМФ 2. Фиг.8В отображает метелку растения, у которого обработаны распылением только семена. Фиг.8С отображает метелку растения, обработанного распылением глифосатом на поздней стадии для индукции мужской стерильности.

[0021] Фиг.9 отображает результаты полевого исследования, измеряющие количество растений на делянке, при этом мужская стерильность измерена по выпячиванию пыльника через S90, при S90+3 и S90+6, при двух различных режимах обработки глифосатом способом распыления (Trt 2 и Trt 3) для NK603 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза), MON 87427 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза с индуцированной глифосатом мужской стерильностью) и четырех явлений, связанных с конструкцией 3, как это описано в примере 5.

[0022] Фиг.10 отображает результаты исследований жизнеспособности пыльцы, как это описано в примере 5. Фиг.10А и 10В отображают пример позднего выпячивания пыльников в метелке при явлении распыления при наличии стерильности и конструкции 3. Квадрат на фиг.10А является участком, увеличенным на фиг.10В. Пример позднего выпячивания пыльника обведен кружком на Фигуре 10В. Окрашивание пыльцы из стерильного пыльника с поздним выпячиванием при явлениях распыления конструкции 3 по Alexander выявило только нежизнеспособную пыльцу (полупрозрачный голубой цвет, неправильная форма пыльцевых зерен) (фиг.10С). Пыльца от пыльников, необработанных конструкцией 3, была полностью жизнеспособной и при окрашивании по Alexander была непрозрачной, темно-фиолетовой и сферической (фиг.10D).

[0023] Фиг.11 отображает результаты полевого исследования, изучавшего растения NK603 и явления конструкции 3 для получения инбредных зерен и мужской фертильности, как это описано в примере 6. Урожай инбредных зерен был измерен в значениях бушели/акр, а индуцированная мужская стерильность была измерена как показатель мужской фертильности (ПМФ). Горизонтальные усы указывают промышленный стандарт для мужской стерильности, ПМФ 2. Trt 1, Trt 2 и Trt 3 обозначают режимы обработки 1, 2 и 3.

[0024] Фиг.12 отображает результаты полевого исследования, изучавшего нетрансгенные женские инбредные растения (Null), линия MON87427, и три явления конструкции 3, все с одинаковой генетической основой, которые были перекрестно опылены мужским тестером MON810/MON88017 для получения гибридных семян F1. Урожай гибридных зерен был измерен в значениях бушели/акр. Trt 1, Trt 2 и Trt 3 обозначают режимы обработки 1, 2 и 3.

[0025] Фиг.13 отображает анализ пыльцевых зерен из гибридных растений F1, как это описано в примере 7. Панели отображают результаты окрашивания пыльцы по Alexander, полученной в результате трех различных гибридных скрещиваний F1: нетрансгенная женская особь x MON88017 мужская особь; MON87427 женская особь x MON88017 мужская особь; и явление конструкции 3 женская особь x MON88017 мужская особь. Фертильность метелки была функционально восстановлена в гибридах F1, полученных от растений с явлением конструкции 3 с использованием пыльцы MON88017.

[0026] Фиг.14 отображает схематические чертежи вариантов воплощения конструкций рекомбинантной ДНК (представлено в направлении от 5’ к 3’ слева направо), включая (вверху) кодирующую белок последовательность (например, ДНК, кодирующую устойчивый к глифосату EPSPS), функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК (например, одну или более, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104) (вверху). В неограничивающем специфическом варианте воплощения изобретения (внизу) конструкция рекомбинантной ДНК включает промотор, функционально связанный, по порядку, с интроном, транзитным пептидом, CP4-EPSPS, кодируемым SEQ ID NO: 95, элементом мтс-миРНК (SEQ ID NO: 81) и 3’UTR.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конструкции рекомбинантной ДНК

[0027] Изобретение предоставляет композиции и способы для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в репродуктивной ткани мужских особей трансгенных растений и их применение. В одном аспекте изобретение предоставляет конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, т.е. химерный трансген, включающий кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и по меньшей мере один элемент мтс-миРНК, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью. В одном варианте воплощения изобретения такие конструкции рекомбинантной ДНК являются пригодными для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения. В одном аспекте изобретение предоставляет рекомбинантную молекулу ДНК, включающую конструкцию рекомбинантной ДНК, и способы ее применения. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть представлены в качестве ДНК или РНК, в зависимости от того, что указано; описание одной обязательно определяет другую, что известно специалисту в данной области техники. Кроме того, описание данной последовательности нуклеиновой кислоты обязательно определяет точный комплемент такой последовательности, что известно специалисту в данной области техники.

[0028] «Мужская тканеспецифичная миРНК» или «мтс-миРНК» является малой РНК (мРНК) из от примерно 18 до примерно 26 нуклеотидов (например, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов), обогащенной или специфически экспрессируемой в мужской репродуктивной ткани(ях) (например, мужском соцветии) растения, т.е. имеющей мужскую тканеспецифичную схему экспрессии. Мужская тканеспецифичная миРНК встречается естественным образом у растений и может быть определена с использованием известных в данной области техники способов, таких как низкомолекулярный нозерн-анализ. Последовательность ДНК, являющаяся комплементарной мтс-миРНК, обозначается в настоящем описании как «последовательность мтс-миРНК». Примеры последовательностей мтс-миРНК для мтс-миРНК эндогенного растения представлены как SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В варианте воплощения изобретения последовательность мтс-миРНК является точным комплементом ДНК (без несоответствий) для заданной мтс-миРНК. В других вариантах воплощения изобретения последовательность мтс-миРНК варьирует в пределах 1-3 нуклеотидных несоответствий в сравнении с заданной мтс-миРНК, но при этом обладает достаточной комплементарностью для связывания или гибридизации, например, при обычных физиологических условиях, с такой мтс-миРНК. «Комплементарность» обозначает способность нуклеотидов в одной полинуклеотидной цепи образовывать пары с нуклеотидами другой полинуклеотидной цепи в соответствии со стандартными правилами комплементарности Уотсона-Крика (т.е. пары гуанина с цитозином (Г:Ц) и пары аденина с тимином (А:Т) или урацилом (А:У); возможна внутрицепочечная гибридизация между двумя или более комплементарных участков отдельного полинуклеотида. При включении в конструкцию рекомбинантной ДНК, как это описано в настоящем описании, мтс-миРНК способна осуществлять миРНК-опосредованную супрессию или нарушение экспрессии гена и/или белка.

[0029] По меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК могут быть соединены в кластер или даже перекрываться в одной молекуле ДНК. Такая молекула ДНК обозначается в настоящем описании как «мужской тканеспецифичный элемент миРНК» или «элемент мтс-миРНК» и определяется как включающая по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК в окне последовательности из примерно 500 нуклеотидов. Элемент мтс-миРНК может иметь любую длину, такую как примерно 20 нуклеотидов (нт), примерно 25 нт, примерно 30 нт, примерно 40 нт, примерно 50 нт, примерно 60 нт, примерно 70 нт, примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт, примерно 300 нт, примерно 350 нт, примерно 400 нт, примерно 450 нт, примерно 500 нт, примерно 550 нт или примерно 600 нт.

[0030] Конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению является молекулой ДНК, включающей по меньшей мере кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК. Термин «рекомбинантный» обозначает молекулу или клетку, или организм, который был получен искусственно посредством генной инженерии и, таким образом, является продуктом деятельности человека и обычно не встречается иным образом в природе. Как используется в настоящем описании, конструкция рекомбинантной ДНК является молекулой рекомбинантной ДНК, включающей две или более гетерологичных последовательностей ДНК. Термин «гетерологичный» обозначает взаимосвязь между двумя или более последовательностей нуклеиновых кислот или белка, которые были получены из различных источников (например, из разных мест в геноме или от различных видов). В одном примере промотор и кодирующая белок последовательность ДНК являются гетерологичными относительно друг друга, если промотор не является нативным промотором кодирующей белок последовательности ДНК. В другом примере кодирующая белок последовательность является гетерологичной относительно элемента мтс-миРНК, если такая комбинация не встречается естественным образом в природе, например, элемент мтс-миРНК растения, функционально связанный с геном толерантности к гербициду, такому как CP4-EPSPS. Кроме того, отдельная последовательность может быть «гетерологичной» относительно клетки или организма, в которую ее вводят (т.е. последовательность, не встречающаяся естественным образом в такой отдельной клетке или организме).

[0031] Термин «функционально связанный» обозначает две молекулы полинуклеотидов, связанных таким образом, что одна молекула может влиять на экспрессию другой. Например, первая молекула полинуклеотида функционально связана со второй молекулой полинуклеотида, при этом молекулы полинуклеотидов располагаются таким образом, что первая молекула полинуклеотида может влиять на экспрессию другой молекулы полинуклеотида. Две молекулы полинуклеотидов могут быть частью отдельной неразрывной молекулы полинуклеотида и могут быть смежными или разделенными. Например, элемент мтс-миРНК функционально связан с кодирующей белок последовательностью, если, после транскрипции в клетке мужской репродуктивной ткани, присутствие элемента мтс-миРНК приводит к супрессии экспрессии рекомбинантного белка в клетке. Функциональная связь кодирующей белок последовательности и элемента мтс-миРНК может быть достигнута, например, посредством введения элемента мтс-миРНК, прилегающего к кодирующей белок последовательности (такой как расположенная на 5’ или 3’ конце кодирующей белок последовательности, но не обязательно смежным образом), в или прилегающего к нетранслируемому участку (UTR) конструкции рекомбинантной ДНК (такой как расположенная в или после 5’ UTR или 3’ UTR) и/или после кодирующей белок последовательности и перед сигналом полиаденилирования. В одном варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК располагаются между кодирующей белок последовательностью и последовательностью полиаденилирования, т.е. в направлении 3’ и прилегая к кодирующей белок последовательности. В другом варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК расположены между стоп-кодоном кодирующей белок последовательности и последовательностью полиаденилирования. В другом варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК расположены в пределах 3’ UTR последовательности, прилегающей к кодирующей белок последовательности.

[0032] Последовательность ДНК элемента мтс-миРНК может варьировать при использовании различных комбинаций и расположений отдельных последовательностей мтс-миРНК и/или при введении 1-3 нуклеотидных несоответствий в элементе мтс-миРНК (относительно заданной последовательности мтс-миРНК). Примеры элементов мтс-миРНК представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 57-94 и 96-104 и в рабочих Примерах. Элемент мтс-миРНК может функционировать в любом направлении, т.е. он ненаправленный и, таким образом, он может использоваться в направлении от 5’ к 3’ или в направлении от 3’ к 5’ в конструкции рекомбинантной ДНК.

[0033] Элементы мтс-миРНК, последовательности мтс-миРНК и мтс-миРНК могут быть идентифицированы способами, известными специалистам в данной области, например, посредством биоинформационного анализа мРНК растений и библиотек кДНК. Пример такого способа идентификации представлен в примерах ниже. В частности, мтс-миРНК и последовательности мтс-миРНК могут быть идентифицированы из библиотек мРНК. Идентифицированные последовательности мтс-миРНК могут быть сопоставлены с кДНК и/или геномными коллекциями последовательностей для идентификации элементов мтс-миРНК (т.е. участков ДНК, включающих по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК в окне из 500 нуклеотидов в последовательности), которые пригодны для разработки конструкций рекомбинантной ДНК, как это описано в настоящем описании.

[0034] В некоторых вариантах воплощения изобретения такие элементы мтс-миРНК синтезируют или модифицируют in vitro для содержания большего, меньшего или различного количества последовательностей мтс-миРНК и/или для изменения относительного положения одной или более последовательностей мтс-миРНК, при этом такая модификация является преимущественной в увеличении или снижении эффекта элемента мтс-миРНК. Способы синтеза или in vitro модификации элемента мтс-миРНК и определения оптимальной вариации требуемого уровня супрессии известны специалистам в данной области. Химерные элементы мтс-миРНК также могут быть получены с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как вставка дополнительных требуемых последовательностей мтс-миРНК внутри элемента мтс-миРНК или присоединение дополнительных последовательностей мтс-миРНК на 5’ или 3’ конце относительно элемента мтс-миРНК. Неограничивающие варианты воплощения химерного элемента мтс-миРНК включают элементы мтс-миРНК, имеющие примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт или примерно 300 нт последовательности SEQ ID NO: 86; примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт или примерно 300 нт последовательности SEQ ID NO: 87; и/или примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт, примерно 300 нт, примерно 350 нт, примерно 400 нт, примерно 450 нт, примерно 500 нт или примерно 550 нт последовательности SEQ ID NO: 85. Дополнительные варианты воплощения изобретения представлены в рабочих Примерах.

[0035] Конструкция рекомбинантной ДНК может использоваться для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужских репродуктивных тканях трансгенного растения, экспрессирующих конструкцию, т.е. для получения экспрессии по меньшей мере в вегетативных тканях, но не в мужских репродуктивных тканях. Как используется в настоящем описании, «экспрессия рекомбинантного белка» обозначает выработку рекомбинантного белка из кодирующей белок последовательности и полученного транскрипта (иРНК) в клетке. Как используется в настоящем описании, термин «супрессия» обозначает снижение; например, супрессия экспрессии рекомбинантного белка обозначает снижение уровня рекомбинантного белка, вырабатываемого в клетке, например, посредством посттранскрипционной супрессии гена, опосредованной интерференцией РНК.

[0036] Избирательная супрессия рекомбинантного белка, как используется в настоящем описании, обозначает снижение выработки рекомбинантного белка в клетке или ткани в сравнении с эталонной клеткой или тканью по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95% или по меньшей мере примерно на 99%. Эталонная клетка или ткань может быть, например, вегетативной клеткой или тканью от одного и того же или подобного трансгенного растения, экспрессирующего рекомбинантный белок, или, например, вегетативной клеткой или тканью трансгенного растения, имеющего подобный трансген для экспрессии рекомбинантного белка, но с отсутствием элемента мтс-миРНК. Супрессия экспрессии белка может быть определена с использованием любого способа, известного специалисту в данной области, такого как непосредственное измерение накопления белка в образце клетки или ткани с использованием способа, такого как ELISA или вестерн-блоттинг, путем измерения ферментативной активности белка или путем фенотипичного определения экспрессии белка. В одном варианте воплощения изобретения избирательная супрессия рекомбинантного белка обозначает достаточное снижение экспрессии рекомбинантного белка, способного придавать толерантность к гербициду в мужской ткани трансгенного растения, что приводит к определяемому фенотипу измененной мужской фертильности у трансгенного растения, по отношению к которому был применен гербицид в качестве воздействия на стерильность. Определение измененной мужской фертильности у такого трансгенного растения, таким образом, будет указывать на избирательную супрессию рекомбинантного белка.

[0037] Как используется в настоящем описании, термин «кодирующая белок последовательность» обозначает молекулу полинуклеотида, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную или белковую последовательность, т.е. полипептидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок. В зависимости от условий нуклеотидная последовательность может фактически транслироваться или не транслироваться в полипептидную молекулу в клетке. Границы кодирующей белок последовательности обычно определяются старт-кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая белок последовательность по изобретению включает, но не ограничивается этим, кодирующую белок последовательность, которая обеспечивает требуемые характеристики, связанные с морфологией, физиологией, ростом и развитием растения, урожайностью, повышением питательности, устойчивостью к болезням или вредителям, толерантностью к гербицидам или толерантностью к окружающей среде или химическим препаратам. В одном варианте воплощения изобретения кодирующая белок последовательность по изобретению кодирует рекомбинантный белок, который, при экспрессии в трансгенном растении, придает толерантность к гербицидам по меньшей мере клетке и/или ткани, в которой возникает экспрессируемый белок; избирательная супрессия белка толерантности к гербициду в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения в сочетании со своевременным применением гербицида приводит по меньшей мере к пониженной мужской фертильности или к мужской стерильности. Такая индуцируемая мужская стерильность в комбинации с вегетативной толерантностью к гербицидам может использоваться для повышения эффективности, с которой получают гибридные семена, например, способом элиминации или снижения необходимости физического удаления пестиков у растения кукурузы, используемого в качестве женского в заданном скрещивании во время получения гибридных семян. Системы индуцируемой гербицидами мужской стерильности были описаны, например, в патенте США № 6762344 и публикации патента США 2011/0126310. Примеры гербицидов, пригодных при практическом применении изобретения, включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase) (например, т.н. fops и dims), ингибиторы ацетолактатсинтазы (ALS) (например, сульфонилмочевины (SU) и имидазолиноны (IMI)), ингибиторы фотосистемы II (PSII) (например, триазины и фениловые эфиры), ингибиторы протопорфириногеноксидазы (PPO) (например, флумиоксазин и фомесафен), ингибиторы 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD) (например, изоксафлутол и трикетоны, такие как мезотрион), ингибиторы 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS) (например, глифосат), ингибиторы глутаминсинтетазы (GS) (например, глуфосинат и фосфинотрицин), синтетические ауксины (например, 2,4-D и дикамба). Примеры кодирующих белок последовательностей и/или рекомбинантных белков для использования в практическом применении изобретения включают, но не ограничиваются этим, гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к ингибиторам HPPD (таким как нечувствительный к гербицидам HPPD), гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к глюфосинату (такому как pat и bar), гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к глифосату (такому как толерантный к глифосату EPSPS, известному как CP4-EPSPS, представленному в настоящем описании как SEQ ID NO: 95), и гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к дикамбе (такой как дикамба монооксигеназа (DMO)).

[0038] Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению получают способами, известными в данной области техники, и в различных вариантах воплощения изобретения они включены в векторы трансформации растения, плазмиды или ДНК пластид. Такие конструкции рекомбинантной ДНК пригодны для получения трансгенных растений и/или клеток и, таким образом, они также могут содержаться в геномной ДНК трансгенного растения, семени, клетки или части растения. Следовательно, изобретение включает варианты воплощения, в которых конструкция рекомбинантной ДНК расположена в векторе трансформации растения или на биолистической частице для трансформации клетки растения, или в хромосоме, или пластиде клетки трансгенного растения, или в трансгенной клетке, ткани трансгенного растения, семени трансгенного растения, пыльцевом зерне трансгенного растения или в трансгенном или частично трансгенном (например, привитом) растении. Вектором является любая молекула ДНК, которая может использоваться в целях трансформации растения, т.е. введения ДНК в клетку. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению могут быть, например, вставлены в вектор трансформации растения и использоваться для трансформации растения с целью получения трансгенных растений, семян и клеток. Способы построения векторов трансформации растения хорошо известны в данной области техники. Векторы трансформации растения по изобретению обычно включают, но не ограничиваются этим: подходящий промотор для экспрессии функционально связанной ДНК, функционально связанную конструкцию рекомбинантной ДНК и сигнал полиаденилирования (который может быть включен в последовательность 3’UTR). Промоторы, пригодные для практического применения изобретения, включают промоторы, функционирующие в растении для экспрессии функционально связанного полинуклеотида. Такие промоторы различны и хорошо известны в данной области техники, и включают промоторы, являющиеся индуцируемыми, вирусными, синтетическими, конститутивными, временно регулируемыми, пространственно регулируемыми и/или пространственно-временно регулируемыми. Дополнительные необязательные компоненты включают, но не ограничиваются этим, один или