Композиции и способы для одновременного обнаружения hcv антигена/антитела

Композиции и способы для одновременного обнаружения hcv антигена/антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка зависит от и претендует на приоритет предварительной заявки США №61/821,953, поданной 10 мая 2013 года, полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством отсылки.

Изобретение по данному описанию может быть осуществлено, применено и лицензировано при поддержке или для правительства Соединенных Штатов.

Область техники

Изобретение, в общем смысле, относится к диагностике заболевания, а в частности - к способам обнаружения присутствия или отсутствия вируса гепатита С (HCV, ВГС) в биологическом образце или для диагностики, лечения или предупреждения HCV у пациента.

Уровень техники

Вирус гепатита С (HCV, ВГС) является основным возбудителем передающегося с кровью и спорадического гепатита "ни-А, ни-В". Связь хронических HCV инфекций с циррозом печени и печеночно-клеточной (гепатоцеллюлярной) карциномой делает HCV серьезной проблемой для здоровья во всем мире.

Для диагностики инфекции применяют преимущественно два основных теста на HCV: 1) ПЦР (PCR)- анализы; и 2) серологический метод обнаружения антител. Серологическое тестирование на антитела (Ab) к HCV представляет собой стандартный метод обнаружения HCV инфекции у человека. Однако первые серологические тесты имели значительные недостатки, а именно, слабую чувствительность, что давало неприемлемо завышенные ложноотрицательные результаты. Хотя чувствительность и специфичность иммуноанализов второго и третьего поколения с применением ферментных меток была значительно повышена, наличие "периода серонегативного окна" от инициирования HCV инфекции до наступления сероконверсии делает возможными ложноотрицательные результаты. Этот период варьируется от 2 месяцев у иммунокомпетентных субъектов до 6-12 месяцев у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

Геном вируса HCV представлен однонитевой положительно-смысловой РНК с длиной цепи примерно 9,400 нуклеотидов. Следовательно, HCV инфекции можно также детектировать, применяя методы на основе нуклеиновых кислот с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR). Помимо скрининга на основе PCR (ПЦР) была предложена комбинация PCR-скрининга с серологическими тестами. Такой комбинированный метод снижает риск передачи HCV от инфицированных доноров во время "периода серонегативного окна" вследствие того, что метод на основе PCR позволяет осуществить детекцию до наступления сероконверсии. К сожалению, применение молекулярно-генетических тестов является значительной проблемой для здравоохранения и клинических лабораторий, связанной с необходимостью в специальном оборудовании и чувствительностью к перекрестному заражению.

В связи с этим существует потребность в композициях и способах, которые можно применять в качестве средства при скрининге с целью идентификации и проявления HCV инфекции у субъекта.

Сущность изобретения

Обнаружение HCV в биологическом образце часто ставит в тупик вследствие заражения источника образца. Например, требуется несколько недель, чтобы у HCV-инфицированного субъекта наступила сероконверсия в такой степени, когда в образце можно будет детектировать антитела к HCV. Это оставляет окно для возможного переноса инфекции от инфицированного субъекта, который не знает о своей инфицированности, вследствие неспособности имеющихся анализов обнаружить присутствие вируса. Хотя PCR анализы позволяют детектировать вирусный антиген до наступления сероконверсии, многие медицинские центры не имеют средств для проведения таких анализов. Кроме того, PCR анализы восприимчивы к перекрестному заражению вследствие их высокой чувствительности. Поэтому целью изобретения является предоставление композиции, которую можно эффективно применять в анализе для обнаружения (детекции) присутствия HCV как до, так и после сероконверсии, и не на основе методов PCR.

В изобретении предусматривается агент для обнаружения (детектирующий агент) HCV, который детектирует антитело, специфическое к ядерному (core, коровому, сердцевинному) белку вируса гепатита С (HCV) в образце, содержащий 5 или более последовательных (соседних) аминокислот, включающих остатки или расположенных между остатками 14-31, 50-91, или и те и другие, последовательности SEQ ID NO: 1, причем в этом детектирующем агенте исключены остатки 41-50 и 100-120 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам детектирующий агент содержит последовательность SEQ ID NO: 2. Необязательно, детектирующий агент содержит последовательность SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам аминокислотная последовательность содержит последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, необязательно связанные между собой непосредственно или разделенные линкером Необязательно, линкер включает последовательность SEQ ID NO: 4.

В настоящем изобретении предусматривается также способ обнаружения (детекции) присутствия или отсутствия HCV в биологическом образце, применимый как до, так и после сероконверсии. На самом деле этот способ можно применять вне зависимости от того, когда субъект был инфицирован HCV или от его способности вырабатывать (продуцировать) антитела к HCV. Способ, необязательно, включает осуществление контакта биологического образца с детектирующим агентом, таким как любой из детектирующих агентов, описанных или заявляемых в данной заявке; и обнаружение присутствия или отсутствия в биологическом образце антитела к HCV-ядерному белку, которое специфически связывается с указанным детектирующим агентом, причем обнаружение антитела указывает на присутствие HCV в указанном образце. Необязательно, обнаружение антитела применяется для обнаружения присутствия или отсутствия HCV инфекции у субъекта. Согласно некоторым вариантам способ включает также осуществление контакта образца с антителом к HCV-ядерному белку, причем антитело не связывается с детектирующим агентом с аффинностью, достаточной для того, чтобы полученный результат анализа был ложноотрицательным. Антитело к HCV-ядерному белку, необязательно, является моноклональным или поликлональным. Необязательно, антитело к HCV-ядерному белку и детектирующий агент контактируют с образцом одновременно. Биологический образец, необязательно, представляет собой образец крови, плазмы или сыворотки крови. Биологический образец, необязательно, представляет собой клетку или клеточный экстракт.

В настоящем изобретении предусматриваются также наборы, пригодные для применения в способах обнаружения присутствия или отсутствия HCV-ядерного белка в биологическом образце. В набор, необязательно, входит детектирующий агент, включающий пептид, содержащий 5 или более последовательных (соседних) аминокислот, включающих остатки или расположенных между остатками 14-31, 50-91, или и те и другие, последовательности SEQ ID NO: 1, причем в этом детектирующем агенте исключены остатки 41-50 и 100-120 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам детектирующий агент содержит последовательность SEQ ID NO: 2. Необязательно, детектирующий агент содержит последовательность SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам аминокислотная последовательность содержит последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, необязательно непосредственно связанные между собой или разделенные линкером Необязательно, линкер включает последовательность SEQ ID NO: 4. Набор, необязательно, включает фармацевтически приемлемый носитель, необязательно, воду или буферный водный раствор.

Композиции и способы по изобретению удовлетворяют назревшую потребность в быстрой, надежной, простой и недорогой системе для обнаружения HCV инфекции у субъекта, независимо от статуса сероконверсии субъекта.

Подробное описание

Нижеприведенное описание конкретного(-ых) варианта(-ов) изобретения по существу является лишь иллюстративным и никоим образом не претендует на ограничение объема изобретения, его приложения или применений, которые, естественно, могут меняться. Данное изобретение описано с использованием неограничивающих определений и терминов, включенных в настоящую заявку. Эти определения и термины предназначены не для ограничения объема или практического осуществления изобретения, но лишь с целью иллюстрации и наглядности. Хотя способ описан в виде последовательности отдельных стадий или использования конкретных элементов, следует принять во внимание, что описанные стадии или элементы могут быть взаимозаменяемыми, в результате чего описание изобретения включает несколько элементов или стадий, расположенных по-разному, и это легко поймет специалист в данной области техники.

В плазме HCV-инфицированных субъектов присутствуют вирусные частицы с физико-химическими, морфологическими и антигенными свойствами нуклеокапсидов безоболочечных вирусов гепатита С (HCV). Эти частицы имеют плавучую плотность 1.32-34 г/мл в CsCl, неоднородны по размеру и экспрессируют локализованные поверхностные эпитопы (антигенные детерминанты) HCV-ядерного (корового) белка. HCV ядерный антиген (белок) играет жизненно важную роль в капсидировании вируса. Он синтезируется только в гепатоцитах, реплицирующих РНК HCV и в силу этого может служить в качестве маркера активной HCV инфекции вместо PCR. Ядерный белок является весьма консервативным среди различных генотипов HCV. Обнаружить ядерный белок у HCV-инфицированных пациентов в период серонегативного окна довольно просто.

К сожалению, обнаружение ядерного белка самого по себе страдает недостатками вследствие сероконверсии. Когда в крови появляются антитела к ядерному белку, титр свободного ядерного белка снижается. Чтобы преодолеть это затруднение, авторы изобретения предусматривают композиции, которые делают возможным одновременное, в одной лунке, обнаружение молекул, которые присутствуют до сероконверсии, а также антител, которые присутствуют после сероконверсии. Одновременное обнаружение как ядерного антигена, так и антител, специфических к ядерному белку, представляет собой наилучший альтернативный вариант точной (чувствительной) диагностики гепатита С у доноров крови.

В изобретении предлагаются композиции и способы обнаружения HCV в биологическом образце. Композиция включает детектирующий агент, который представляет собой белковую молекулу. Детектирующий агент включает пептид, имеющий последовательность, представляющую одну или более областей ядерного белка HCV, в соответствии с определением в Genbank код доступа №АВ719482.1 и с SEQ ID NO. 1.

MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG RRQPIPKARQ PEGRAWAQPG YPWPLYGNEG LGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG (SEQ ID NO: 1).

Детектирующий агент включает пептид, представляющий по меньшей мере одну область ядерного белка HCV (ядерного белка вируса гепатита С). Область ядерного белка HCV охватывает 4 или более аминокислот, необязательно, 5 или более аминокислотных остатков, включающих остатки или находящихся между остатками 14-31, 50-91, или и те и другие, последовательности SEQ ID NO: 1. Необязательно, детектирующий агент включает 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот. Необязательно, детектирующий агент включает 70 или менее аминокислот, необязательно, 69 или менее аминокислот. Необязательно, детектирующий агент включает от 4 аминокислот до 41 аминокислоты, необязательно, от 4 до 18 аминокислот, необязательно, от 4 до 70 аминокислот. Необязательно, детектирующий агент включает от 5 до 17 аминокислот. Необязательно, детектирующий агент включает от 5 аминокислот до 41 аминокислоты. Приведенные выше значения длины аминокислотных последовательностей, необязательно, даются без учета метки (тега), линкера или другой аминокислоты или последовательности аминокислот, которые существенно не меняют способность детектирующего агента действовать нужным образом.

Следует принимать во внимание, что аминокислотная последовательность детектирующего агента во всех возможных вариантах изобретения необязательно включает одну(-о) или более аминокислотных замен, делеций, добавлений или модификаций последовательности, включающих остатки или находящихся между остатками 14-31, 50-91, или и те и другие, последовательности SEQ ID NO: 1, при условии, что такая область сохраняет свою функцию эпитопа, распознаваемого антителом к ядерному белку, образующимся к эпитопу, имеющему последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, остатки 14-31, 50-91, или ее релевантную часть. Для иллюстрации, детектирующий агент может включать одну(-о) или более аминокислотных замен, делеций, добавлений или модификаций последовательности остатков 14-31 или 50-91, которые не нарушают способность антитела, специфического к одной или более таких областей, или к ее участку, связываться с детектирующим агентом.

Согласно некоторым вариантам детектирующий агент включает область первого эпитопа. Область первого эпитопа, необязательно, включает 5 или более аминокислотных остатков 14-31 последовательности SEQ ID NO: 1. Область первого эпитопа, необязательно, включает последовательность NTNRRPQDVKFPGGGQIV (SEQ ID NO: 2). Детектирующий агент, необязательно, включает область второго эпитопа. Область второго эпитопа, необязательно, включает 5 или более аминокислот из остатков 50-91 последовательности SEQ ID NO: 1, необязательно, остатков 50-90 одной лишь последовательности SEQ ID NO: 1, или включая одну дополнительную аминокислоту на С-конце, необязательно M или L. Необязательно, область второго эпитопа включает последовательность RKTSERSQPRGRRQPIPKARQPEGRAWAQPGYPWPLYGNEGL (SEQ ID NO: 3). Необязательно, в области второго эпитопа исключен последний остаток L в последовательности SEQ ID NO: 3.

Детектирующий агент, необязательно, включает линкер. Линкер, необязательно, расположен между областью первого эпитопа и областью второго эпитопа. Линкер, необязательно, представляет собой пептид, содержащий 1 или более аминокислот, при этом линкер не совпадает с участком аминокислотной последовательности ядерного белка HCV. Необязательно, линкер включает от 2 до 50 аминокислот или любое число аминокислот в любом интервале между ними. Необязательно линкер включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, или более аминокислот. Необязательно, линкер включает последовательность SGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 4).

Детектирующий агент, необязательно, не включает один или более последовательных (соседних) остатков аминокислот 1-13, 32-49, 41-49, 41-50, 91-120 или 100-120 последовательности SEQ ID NO: 1 или любую их комбинацию.

Детектирующий агент включает пептид или представляет собой исключительно пептид. Предполагается, что термины "пептид", "полипептид" и "белок" в данном контексте обозначают природное или синтетическое соединение, содержащее 4 или более аминокислот. Аминокислоты, которые могут присутствовать в пептиде, включают стандартные (широко распространенные) аминокислоты: аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серии, треонин, валин, триптофан и тирозин, а также малораспространенные натуральные аминокислоты, модифицированные аминокислоты или синтетические соединения, такие как альфа-аспарагин, 2-аминобутановую или 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 2-аминокаприновую кислоту (2-аминодекановую кислоту), 6- аминокапроновую кислоту, альфа-глутамин, 2-аминогептановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, альфа-аминоизомасляную кислоту (2-аминоаланин), 3-аминоизомасляную кислоту, бета-аланин, алло-гидроксилизин, алло-изолейцин, 4-амино- 7-метилгептановую кислоту, 4-амино-5-фенилгептановую кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, гамма-амино-бета-гидроксибензолпентановую кислоту, 2-аминосубериновую кислоту, 2-карбоксиазетидин, бета-аланин, бета-аспарагиновую кислоту, бифенилаланин, 3,6-диаминогексановую кислоту, бутановую (масляную) кислоту, циклобутилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, N5-аминокарбонилорнитин, циклопентилаланин, циклопропилаланин, 3-сульфоаланин, 2,4-диаминобутановую кислоту, диаминопропионовой кислоту, 2,4-диаминомасляную кислоту, дифенилаланин, Ν,Ν-диметилглицин, диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропановую кислоту, S-этилцистеин, N-этиласпарагин, N-этилглицин, 4-азафенилаланин, 4-фторфенилаланин, гамма-глутаминовую кислоту, гамма- карбоксиглутаминовую кислоту, гликолевую (оксиуксусную) кислоту, пироглутаминовую кислоту, гомоаргинин, гомоцистеиновую кислоту, гомоцистеин, гомогистидин, 2-гидроксиизовалериановую кислоту, гомофенилаланин, гомолейцин, гомопролин, гомосерин, 2-гидроксипентановую кислоту, 5-гидроксилизин, 4-гидроксипролин, 2-карбоксиоктагидроиндол, 3-карбоксиизохинолин, изовалин, 2-гидроксипропановую кислоту (молочную кислоту), меркаптоуксусную кислоту, меркаптобутановую кислоту, саркозин, 4-метил-3-гидроксипролин, меркаптопропановую кислоту, норлейцин, нипекотиновую кислоту, нортирозин, норвалин, омега-аминокислоту, орнитин, пеницилламин (3-меркаптовалин), 2-фенилглицин, 2-карбоксипиперидин, саркозин (N-метилглицин), 2-амино-3-(4-сульфенил)пропионовую кислоту, 1-амино-1-карбоксициклопентан, 3-тиенилаланин, эпсилон-N-триметиллизин, 3-тиазолилаланин, тиазолидин 4-карбоновую кислоту, альфа-амино -2,4-диоксопиримидинпропановую кислоту и 2-нафтилаланин. Таким образом, термин "пептид" в данном контексте может включать пептиды, содержащие от 5 и до примерно 200 аминокислот или любое число (аминокислот) или в любом интервале между ними.

В последовательности пептида можно сделать модификации и изменения по сравнению с последовательностью дикого типа SEQ ID NO: 1 или его области эпитопа и все еще получать молекулу, способную специфически связываться антителом к ядерному белку. Например, некоторые аминокислоты могут заменять другие аминокислоты в последовательности без заметной потери активности, где активность означает способность специфически связываться антителом к ядерному белку. Поскольку именно это представляет собой активность взаимодействия, а природа пептида определяет эту активность пептида, то в последовательности пептида можно делать некоторые (определенные) аминокислотные замены и тем не менее получать полипептид с подобными свойствами.

Осуществляя такие изменения, можно принимать во внимание индекс гидропатичности аминокислот. Вообще важность индекса гидропатичности аминокислот для придания полипептиду активности установлена в уровне техники. Известно, что некоторые аминокислоты могут заменять другие аминокислоты, имеющие аналогичный индекс или показатель гидропатичности, и все еще получать в результате полипептид с аналогичной биологической активностью. Каждой аминокислоте был присвоен индекс гидропатичности, исходя из его характеристик гидрофобности и заряда. Далее приводятся эти индексы: изолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистеин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серии (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9); и аргинин (-4.5).

Полагают, что относительная гидропатическая характеристика аминокислоты определяет вторичную структуру образующегося в результате полипептида, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. Из уровня техники известно, что аминокислоту можно заменить на другую аминокислоту, имеющую близкий (аналогичный) индекс гидропатичности, и тем не менее получить функционально эквивалентный полипептид. При таких изменениях возможно замена аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах ± 2, в пределах0 ± 1 и в пределах ± 0.5.

Замену подобных аминокислот можно также осуществлять с учетом гидрофильное™, в частности, если предполагается получить при этом полипептид или пептид с эквивалентной активностью. Аминокислотные остатки имеют (им заданы) следующие величины гидрофильности: аргинин (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.0±1); глутамат (+3.0±1); серии (+0.3); аспарагин (+0.2); глутамин (+0.2); глицин (0); пролин (-0.5±1); треонин (-0.4); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); изолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин (-2.5); триптофан (-3.4). Понятно, что аминокислоту можно ввести в качестве замены вместо другой аминокислоты, имеющей аналогичную (близкую) величину гидрофильности, и по-прежнему получить биологически эквивалентный и, в частности, имеющий эквивалентную или более высокую активность, пептид. В таких изменениях предпочтительными для замены являются аминокислоты, величина гидрофильности которых находится в пределах ± 2, особенно предпочтительны аминокислоты с величиной гидрофильности в пределах ± 1, и еще более предпочтительны аминокислоты с величиной гидрофильности в пределах ± 0.5.

Как подчеркивается выше, обычно аминокислотные замены осуществляют на основании сходства заместителей в боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и т.п.Такие заместители обычно считаются консервативными заместителями. Типичные консервативные заместители, которые соответствуют различным вышеприведенным характеристикам, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают (исходный остаток: типичная замена): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) и (Val: Ile, Leu). Поэтому в вариантах настоящего изобретения рассматриваются функциональные или биологические эквиваленты описанного выше пептида. В частности, варианты полипептидов могут включать варианты, последовательность которых примерно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% идентична последовательности рассматриваемого полипептида.

Пептид получают любым из различных методов, известных из уровня техники, включающих, например, выделение из клетки или из организма, химический синтез, экспрессию нуклеиновой кислоты и частичный гидролиз белков. Химические методы пептидного синтеза известны в уровне техники и включают, например, твердофазный пептидный синтез и пептидный синтез в растворе (жидкофазный пептидный синтез). Пептид, включенный в состав детектирующего агента, может представлять собой натуральный или ненатуральный пептид. Термин "натуральный (природный)" относится к эндогенному пептиду клетки, ткани или организма, и включает аллельные варианты. Ненатуральный (не природный) пептид представляет собой синтетический пептид или пептид, полученный вне организма, с которым он ассоциирован в природе, или модифицированный пептид, который отсутствует в немодифицированных клетке, ткани или организме.

Например, пептид является рекомбинантным пептидом. Пептид по изобретению может экспрессироваться совместно с ассоциированными метками (тегами), модификациями, другими белками, например, такими, которые входят в состав химерного пептида, или другими модификациями или комбинациями, известными в уровне техники. Типичные метки (теги) включают 6х His, FLAG, биотин, убиквитин, SUMO или другую метку, известную в уровне техники. В качестве иллюстрации, метка (тег) может отщепляться, например, путем связывания с пептидом с помощью последовательности расщепляющего фермента, который затем отщепляется с помощью фермента, известного в уровне техники, включающего, например, но без ограничения, Фактор Ха, тромбин, белок SUMOstar, получаемый от компании Lifesensors, Inc., Malvern, РА, или трипсин. Также следует принимать во внимание, что можно осуществлять химическое расщепление с использованием подходящего отщепляемого линкера.

Экспрессию пептида осуществляют, например, при использовании транскрипции нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, и трансляции РНК, транскрибированной с нуклеотидной последовательности. Экспрессию пептида, необязательно, проводят на клеточной системе, например, в клетках Е. coli, клетках Hela или клетках яичника китайского хомячка. Также применимы бесклеточные системы экспрессии.

Детектирующий агент, необязательно, выделяют или очищают. Предполагается, что термины "очищенный" или "выделенный" в данном контексте относятся к композиции, которую отделяют от других компонентов, причем композиция является очищенной в той или иной степени по сравнению с ее состоянием в природе или с состоянием после экспрессии в клетке или синтетической системе. Следовательно, выражение "очищенный пептид" относится также к пептиду, не содержащему примесей из окружающей среды, в которой он может находиться в природе.

Выделенный пептид можно подвергать фракционированию для удаления различных других компонентов. Если применяется выражение "по существу" очищенный, "практически" очищенный, то это пояснение (определение) относится к композиции, в которой белок или пептид является основным компонентом, например, составляющим примерно 50% или более всех белков, содержащихся в композиции.

С учетом настоящего раскрытия и данных из уровня техники специалистам в данной области техники будут понятны методы количественного определения степени чистоты белка или пептида. Эти методы включают, например, определение специфической активности активной фракции или определение количества полипептидов во фракции с помощью анализа SDS/PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Предпочтительным способом определения чистоты фракции является количественное определение (расчет) специфической активности фракции и сравнение ее со специфической активностью исходного экстракта и тем самым вычисление степени чистоты, выражаемой в настоящей заявке как "-кратная степень очистки". Фактические числа, используемые для количественного изображения активности, естественно, будут зависеть от конкретного метода анализа, выбранного для того, чтобы следить за очисткой, и от того, обладает экспрессируемый белок или пептид детектируемой активностью или не обладает.

Специалистам в данной области техники хорошо известны различные методы, применимые для очистки белков. Эти методы включают, например, преципитацию (осаждение) с использованием сульфата аммония, полиэтиленгликоля, антител и т.п. или тепловой денатурацией с последующим центрифугированием; хроматографию, например, ионообменную хроматографию, гель-проникающую хроматографию (гель-фильтрацию), обращенно-фазовую, гидроксилапатитную и аффинную хроматографию; изоэлектрическое фокусирование; электрофорез в геле; и комбинации этих и других методов. Как известно из уровня техники, полагают, что порядок осуществления различных стадий очистки может меняться или что некоторые стадии можно исключить, и тем не менее осуществить адекватный способ получения практически (по существу) очищенного белка или пептида.

Общего требования, чтобы детектирующий агент всегда предоставлялся в особо чистом состоянии, нет. На самом деле в некоторых вариантах изобретения предполагается применение менее чистых продуктов. Частичную очистку можно осуществлять, применяя меньше стадий очистки в сочетании (друг с другом), или применяя различные формы той же самой общей схемы очистки. Например, катионообменная колоночная хроматография, проводимая на системе для ВЭЖХ (HPLC), обычно дает более многократную степень очистки, чем тот же способ с применением хроматографической системы, работающей под низким давлением. Преимущество методов, в которых достигается более низкая степень относительной очистки, может заключаться в сквозном извлечении белкового продукта или в сохранении активности экспрессированного белка.

Известно, что миграция пептида в геле может меняться, иногда значительно, в разных условиях SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977). Поэтому следует принимать во внимание, что в различных условиях проведения электрофореза средняя (кажущаяся) молекулярная масса очищенного или частично очищенного экспрессированного продукта может меняться.

Некоторые варианты изобретения включают выделение детектирующего агента. Способы выделения пептидов включают, например, колоночную хроматографию, аффинную хроматографию, электрофорез в геле, фильтрацию или другие способы, известные из уровня техники. Согласно некоторым вариантам пептид экспрессируется с меткой, пригодной для аффинной очистки. Метка представляет собой, необязательно, метку (хвост) 6х His. Белок по изобретению, меченный тегом 6х His, очищают, например, Ni-NTA колоночной хроматографией или с использованием антитела к метке 6х His на твердой подложке (носителе) (Geneway Biotech, San Diego, CA). Также пригодны для такого применения другие метки и системы очистки.

Следует понимать, что пептид, не обязательно, не является меченым. Согласно таким вариантам очистку, необязательно, проводят способами, известными в уровне техники, включающими, например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, преципитацию (осаждение) солью, например, такой как сульфат аммония, стрептомицина сульфат или протамина сульфат, обращенно-фазовую хроматографию, эксклюзионную (по размеру) хроматографию, например, такую как высокоэффективная гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация), ВЭЖХ (HPLC), металл-аффинную хелатную хроматографию или другие способы, известные в уровне техники. Специалист в данной области техники может выбрать наиболее подходящие методы выделения и очистки в объеме настоящего изобретения.

Детектирующий агент может быть рекомбинантным. Экспрессию белка можно осуществлять при использовании транскрипции нуклеотидной последовательности, кодирующей детектирующий агент, трансляции с матрицы РНК, транскрибируемой с этой нуклеотидной последовательности, ее модификаций или фрагментов. Экспрессию белка, необязательно, осуществляют на клеточной системе, например, в клетках Е. coli, клетках Hela или клетках яичника китайского хомячка. Следует принимать во внимание, что также применимы бесклеточные системы экспрессии.

Необязательно, пептид получают методами химического синтеза. Методами химического синтеза получают белки протяженностью более 600 аминокислот, включая или не включая модификации, такие как модификации, являющиеся результатом гликозилирования или фосфорилирования. Способы химического синтеза белков и пептидов включают, например, твердофазный химический синтез белков. Типичные способы химического синтеза белков представлены в обзорах Miranda, LP, Peptide Science, 2000, 55:217-26 и Kochendoerfer GG, Curr Opin DrugDiscov Devel. 2001; 4(2):205-14.

Детектирующий агент, необязательно, можно охарактеризовать, применяя такие методы анализа, как например, но без ограничения, вестерн-блоттинг, биофизические методы определения молекулярной массы макромолекул, SDS- PAGE/окрашивание, HPLC и т.п., методы распознавания антител, анализы жизнеспособности клеток, анализы апоптоза и анализы, позволяющие сделать заключение об иммунной защите или иммунной патологии путем адоптивного переноса клеток, белков или антител.

Также предусматриваются выделенные олигонуклеотиды, кодирующие детектирующий агент. Эти олигонуклеотиды можно применять для получения пептидов, включенных в детектирующий агент. Вырожденный генетический код понятен специалисту в данной области, поэтому специалист в полной мере и сразу поймет, какая нуклеотидная последовательность позволит продуцировать последовательность заданного пептида. По сути олигонуклеотид включает любой полинуклеотид, который кодирует детектирующий агент.

Предполагается, что термин "нуклеотид" означает комбинацию основание- сахар-фосфатная группа, либо натуральную, либо синтетическую, линейные, кольцевые и последовательные повторы нуклеотидов и нуклеозидов, например, кДНК, геномную ДНК, мРНК и РНК, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды и их производные. Это определение охватывает также модифицированные нуклеотиды, которые включают добавления к сахар-фосфатным группам, а также к основаниям.

Термин "олигонуклеотид" относится к нескольким нуклеотидам, связанным в виде одно- или двунитевой (одно- или двухцепочечной) молекулы, которая может быть натуральной или полученной синтетическими, ферментативными методами или методами клонирования. Термин "олигонуклеотид" относится к полинуклеотиду, содержащему менее 2000 нуклеотидов.

Термин "олигонуклеотид" в данном контексте относится к одно- или двухцепочечным молекулам, которые могут представлять собой ДНК, включающую нуклеотидные основания А, Т, С и G, или РНК, состоящую из оснований A, U (введенное вместо Т), С и G. Олигонуклеотид может представлять собой кодирующую цепь или ее комплемент. Олигонуклеотиды могут иметь последовательность, идентичную природной (натуральной) последовательности, или может включать альтернативные кодоны, которые кодируют ту же самую аминокислоту, что и аминокислота в природной последовательности. Кроме того, олигонуклеотиды могут включать кодоны, представляющие консервативные замены аминокислот, хорошо известные в уровне техники.

Олигонуклеотид, кодирующий детектирующий агент по настоящему изобретению, может представлять собой часть рекомбинантной нуклеотидной конструкции, включающей любую комбинацию сайтов рестрикции и/или функциональных элементов, хорошо известных в уровне техники, которые способствуют молекулярному клонированию и другим манипуляциям с рекомбинантной ДНК. Поэтому в настоящем изобретении также предусматривается конструкция на основе рекомбинантного олигонуклеотида, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид и/или полипептид по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении предусматривается также вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептидную последовательность. Типичные векторы включают плазмидные векторы, космидные векторы, катионные липиды в качестве векторов, не-липосомальные катионные векторы, катионный циклодекстрин, вирусы с РНК- или ДНК- генетическим материалом, полиэтиленимины, гистидилированный полилизин или другие векторные системы, известные в уровне технике. Вектор, необязательно, представляет собой плазмиду. Подходящий вектор, необязательно, проявляет специфическую экспрессию в определенных типах клеток, или имеет другие регуляторные последовательности или последовательности, выполненные с возможностью стимулировать или ингибировать экспрессию гена или белка. Например, вектор содержит селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотикам.

В изобретении предусматривается олигонуклеотид. Олигонуклеотид, необязательно, кодирует пептид, включающий последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, комбинацию SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 3, расположенных в любом другом или в перечисленном порядке. Генетический код представляет собой вырожденный код, в котором специфические нуклеотидные последовательности кодируют конкретные аминокислоты. По существу специалисты в данной области техники могут определить нуклеотидную последовательность, которая будет кодировать пептиды по изобретению.

Нуклеотидная последовательность по изобретению, необязательно, является выделенной из клеточных материалов, с которыми она связана в природе. В данном контексте термин "выделенная нуклеиновая кислота" обозначает нуклеиновую кислоту, выделенную из других компонентов или практически (по существу) не содержащую по меньшей мере некоторые из других компонентов природного (встречающегося в природе) организма, например, структурные компоненты клетки, обычно ассоциированные с нуклеиновыми кислотами в клеточной среде, и/или другие нуклеиновые кислоты. Выделение нуклеиновых кислот, необязательно, осуществляют такими методами, как лизис клеток с последующей экстракцией фенолом плюс хлороформ, а затем осаждением нуклеиновых кислот этанолом. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно выделять из клеток методами выделения нуклеиновых кислот, хорошо известными в уровне техники. Или же нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно синтезировать в соответствии со стандартными протоколами, хорошо описанными в литературе по синтезу нуклеиновых кислот. Также рассматриваются модификации нуклеиновых кислот по изобретению, при условии, что сохраняется базовая структура и функция пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой.

В уровне техники известно множество методов синтеза и продуцирования нуклеотидных последовательностей, включающих, например, клонирование и экспрессию в клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых, таких как клетки Sf9, клетках дрожжей и клетках млекопитающих, таких как клетки Hela, клетки яичников китайского хо