Применение ингибиторов vap-1 для лечения фиброзных болезней

Применение ингибиторов vap-1 для лечения фиброзных болезней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к ингибиторам VAP-1 и их применению в качестве антифиброзных средств. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу диагностики фиброзной болезни и набору для применения в диагностическом способе.

Уровень техники

Как правило, фиброзные болезни развиваются в результате нарушенного процесса заживления после травмы или хронического воспаления. Фиброзная патология преимущественно развивается в органах, которые постоянно подвергаются воздействию повреждающих факторов химической и биологической природы, например печень, легкие, кожа и почки. Независимо от того, являются расстройства острыми или хроническими, они имеют общую характеристику, заключающуюся в потере органом функции, поскольку нормальная ткань замещается рубцовой тканью. Заболевание прогрессирует, часто вызывая необратимые изменения, с плохим прогнозом и выживаемостью.

Состав фиброзного рубца является практически одинаковым независимо от причины поражения. Диагностика и установление тяжести фиброза являются очень важными с точки зрения прогноза болезни. Процесс планирования лечения в большой степени основан на оценке фиброза, его прогрессировании и начале осложнений. При фиброзе печени перкутанная биопсия является золотым стандартом для классификации и установления стадии заболевания печени. Однако это инвазивная процедура с присущим ей определенным неизбежным риском и осложнениями, которая, кроме того, ассоциируется с болью и дискомфортом. Показатели смертности в результате осложнений от этой процедуры находятся в пределах от 1:1000 до 1:10000 (Crockett et al., 2006).

Было установлено, что активность сывороточной моноаминоксидазы повышена у пациентов с циррозом, хроническим гепатитом и раком печени, которые все ассоциированы с фиброзом, но имеет нормальные показатели у пациентов с воспалительными заболеваниями соединительной ткани, такими как ревматоидный артрит или системная красная волчанка (McEwen and Castell, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:36-47; Ito et al., 1971, Digestion, 4:49-58; Ma Lin et al., 1976, Proc. Soc. Exp. Biol. med., 151:40-43). Однако полагалось, что повышенная активность сывороточной моноаминоксидазы является только показателем или ответом на поражение ткани, и не было известно об ее роли в патогенезе фиброза.

Обычные терапевтические подходы в основном направлены на лечение воспалительного процесса при фиброзе с использованием кортикостероидов и иммуносупрессоров. Однако, к сожалению, данные средства обладают слабой эффективностью, или она вовсе отсутствует, и существует очевидная потребность в новых лекарственных препаратах для лечения фиброзных болезней.

Сущность изобретения

Некоторые цели настоящего изобретения относятся к ингибиторам VAP-1 в качестве антифиброзных средств, применениям ингибиторов VAP-1 для производства лекарственного препарата для лечения фиброзной болезни и способам профилактики, лечения или ослабления фиброзной болезни у человека, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного количества ингибитора VAP-1.

Дополнительная цель настоящего изобретения относится к способу диагностики фиброзной болезни у субъекта. Способ включает (а) получение пробы жидкости организма от указанного субъекта; (b) анализ количества растворимого VAP-1 (sVAP-1) или активности SSAO в указанной пробе; (с) диагностику фиброза на основе указанного количества sVAP-1 или активности SSAO. Если желательно, то количество sVAP-1 или активность SSAO можно сравнить с количеством sVAP-1 или активностью SSAO в референс-жидкости организма.

Еще одна цель настоящего изобретения относится к набору для применения в способе диагностики фиброзной болезни.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных целей ингибитор VAP-1 представляет анти-VAP-1-антитело, такое как полностью человеческое анти-VAP-1-антитело, содержащее одну-три консенсусных CDR-последовательности, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3, и/или полипептид легкой цепи, содержащий одну-три консенсусных CDR- последовательности, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24-26. В еще одних вариантах осуществления указанное анти-VAP-1-антитело содержит полипептид тяжелой цепи, содержащий первую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:4-8, вторую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:9-13, и третью CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:14-18, и/или полипептид легкой цепи, содержащий первую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:27-31, вторую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:32-36, и третью CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:37-41.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления указанное анти-VAP-1-антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:19-23, и соответствующую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:42-46. В еще одних дополнительных вариантах осуществления указанное антитело представляет полностью человеческое рекомбинантное антитело, содержащее полипептид тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:47, и полипептид легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:48.

В еще одних вариантах осуществления вышеуказанных целей ингибитор VAP-1 представляет ингибитор SSAO, такой как соединение, выбранное из группы, состоящей из производных гидразина, пропениламинов и пропаргиламинов, 4-замещенных-2-бутиниламинов, галогеналлиламинов, производных пирролина, пропаргилдиаминов, аллиламинов, диаминов, производных 4,5,6,7-тетрагидроимидазо[4,5-с]пиридина, тиокарбамоильных производных, карбоксамидов, сульфонамидов, производных тиазола и/или гуанидина, оксимных производных, дигидразина, арилалкиламинов, оксазолидинонов, галогеналкиламинов, производных бенфотиамина и имидазопиридина.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления вышеуказанных целей фиброзная болезнь выбрана из группы, состоящей из фиброза печени и воспалительных заболеваний, предрасполагающих к нему, т.е. острого и хронического гепатита, заболевания желчного пузыря и желчных путей, и токсического поражения печени, пульмонарного фиброза, фиброза почек, включая возникший в результате диабетической нефропатии, миелофиброза, фиброза поджелудочной железы, склеродермы, соединительнотканных заболеваний, рубцевания, фиброза кожи, фиброза сердца, трансплантата органа, стеноза сосудов, рестеноза, фиброза артерий, артрофиброза, фиброза молочной железы, фиброза мышц, ретроперитонеального фиброза, фиброза щитовидной железы, фиброза лимфатических узлов, фиброза мочевого пузыря, плеврального фиброза и COPD, заболевания при котором стенки дыхательных путей становятся фиброзными по мере накопления миофибробластов и коллагена, и включаются все подобные фиброзные ткани.

Другие конкретные варианты осуществления изобретения приводятся в зависимых пунктах формулы изобретения.

Другие цели, детали и преимущества настоящего изобретения станут понятными из последующих фигур, подробного описания изобретения и примеров.

Краткое описание фигур

Ниже изобретение будет описано подробнее посредством предпочтительных вариантов осуществления при обращении к прилагаемым фигурам, где:

На фигуре 1 показано, что введение анти-VAP-1-антитела BTT-1029 приводит к практически полной защите от индуцированного CCl₄ фиброза печени. Окрашивание сириусом красным печени от мышей WT и с нокаутом VAP-1, которым вводили минеральное масло (МО, контрольная группа), CCl₄ или CCl₄ вместе с антителом против VAP-1. Количественное определение фиброзного рубца проводили с использованием пороговой обработки изображений J. Приведено среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Увеличение ×10.

На фигуре 2 показано, что в печени мышей, обработанных антителом против VAP-1, и в печени мышей с нокаутом VAP-1 практически отсутствовал гепатит и некротические участки, несмотря на индукцию под действием CCl₄ фиброза. Показаны окрашенные гематоксилин-эозином при увеличении ×20 некротические гепатоциты (острие стрелок) и текущий гепатит (стрелки).

На фигуре 3 показано, что повышение экспрессии коллагена IV и эластина в фиброзных тканях предупреждается антителом против VAP-1. Проводили количественное определение коллагена IV, эластина и ламинина с использованием пороговой обработки изображений J. Приведено среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

На фигуре 4 показано, что уровни мРНК указывают на регуляторное влияние VAP-1 на звездчатые клетки и фибробласты печени. Показан анализ эластина, aSMA, VAP-1 и TIMP1 количественной ОТ-ПЦР. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего по трем мышам при анализе в трех параллелях. *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 (ANOVA).

На фигуре 5 показано, что содержание растворимого VAP-1 и SSAO активность в сыворотке крови повышается в ответ на индуцированный CCl₄ фиброз печени. На фигуре 5А показано влияние индуцированного CCl₄ фиброза печени на содержание растворимого VAP-1 в сыворотке крови по данным разделенного во времени флуорометрического анализа с набором реагентов DELFIA. На фигуре 5В показано, что повышенная активность SSAO обнаружена в сыворотке крови мышей WT с индуцированным CCl₄ фиброзом печени по данным радиохимического анализа.

На фигуре 6 показано, что участки поражения клубочков, индуцированные CCl₄, отсутствуют у мышей с нокаутом VAP-1 и у мышей C57BL/6, обработанных антителами против VAP-1. Показано окрашивание гематоксилин-эозином при увеличении ×40, выделяющее клубочки.

На фигуре 7 показано, что накопление коллагена, в результате индуцированного CCl₄ фиброза клубочков, достоверно снижается у мышей с нокаутом VAP-1 и у мышей, обработанных антителами против VAP-1. Окрашивание сириусом красным печени от мышей WT и с нокаутом VAP-1, которым вводили минеральное масло (МО, контрольная группа), CCl₄ или CCl₄ вместе с антителом против VAP-1. Количественное определение фиброзного рубца проводили с использованием пороговой обработки изображений J. Приведено среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Увеличение ×40.

На фигуре 8 показано снижение общего числа клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа от мышей, подвергшихся воздействию табачного дыма и обработанных антителом к VAP-1 (BTT-1029), по сравнению с мышами, обработанными растворителем.

На фигуре 9 показано снижение общего числа клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа от мышей, подвергшихся воздействию табачного дыма и обработанных рофлумиластом, по сравнению с мышами, обработанными растворителем.

На фигуре 10 показано достоверное снижение в утолщении срединной оболочки в группе мышей, обработанных дексаметазоном, и в обеих группах, обработанных ингибитором SSAO (BTT-2089), по сравнению с мышами контрольной группы, обработанными 0,9% NaCl.

На фигуре 11 показано достоверное снижение утолщения неоинтимы в группе мышей, обработанных дексаметазоном, и в обеих группах, обработанных ингибитором SSAO (BTT-2089), по сравнению с мышами контрольной группы, обработанными 0,9% NaCl.

На фигуре 12 показаны примеры окрашивания сегментов сосудов гематоксилином-флоксином саффроном (HPS). Размер просвета был больше в группах С и D, обработанных ингибитором SSAO, по сравнению с контрольной группой А. А - группа с 0,9% NaCl; В - дексаметазон; С - BTT-2089 в дозе 10 мг/кг; D - BTT-2089 в дозе 30 мг/кг.

На фигуре 13 показана ткань нормальной печени, циррозной печени NASH и циррозной печени ALD, окрашенных анти-VAP-1-антителом или аналогичным по изотипу контрольным антителом. Окрашивание VAP-1 более темное в циррозной печени NASH и циррозной печени ALD по сравнению с нормальной печенью или при окрашивании антителом контрольного изотипа и отражает повышение экспрессии VAP-1 в участках фиброза.

На фигуре 14 показана ткань нормальной печени и циррозной печени NASH, окрашенных анти-VAP-1-антителом, анти-CD31-антителом и антиколлаген IV-антителом. Окрашивание VAP-1 указано стрелками и преобладает в основном в циррозной печени NASH и отражает повышение экспрессии VAP-1 в участках фиброза.

На фигуре 15 показана ткань нормальной печени и циррозной печени NASH, окрашенных анти-VAP-1-антителом, анти-CD90-антителом и анти-CD3-антителом. Окрашивание VAP-1 указано стрелками и преобладает в основном в циррозной печени NASH и отражает повышение экспрессии VAP-1 в участках фиброза.

На фигуре 16 показаны звездчатые клетки печени, окрашенные анти-VAP-1-антителом и антителом против актина гладкой мускулатуры, и миофибробласты печени, окрашенные анти-VAP-1-антителом, анти-CD90-антителом и антиколлаген IV-антителом. Окрашивание VAP-1 указано стрелками и преобладает в основном в звездчатых клетках и миофибробластах печени.

На фигуре 17 приведена диаграмма рассеивания содержания sVAP-1 и соответствующей стадии фиброза. Линии указывают медианные значения.

На фигуре 18 показана характеристическая кривая обнаружения (ROC) для sVAP-1, использованного в качестве единственного биологического маркера для прогноза значимого фиброза печени (стадии F2-4) (фигура 18А), выраженного фиброза печени (стадии F3-4) (фигура 18В) и цирроза (стадия F4) (фигура 18С).

На фигуре 19 показана характеристические кривые обнаружения (ROC) для баллов оценки фиброза по уровню sVAP-1, диабетическому статусу и соотношению АСТ/АЛТ (0,837+sVAP-1 (нг/мл)×0,001 + диабет (да=1, нет=0)×0,591+log АСТ/АЛТ×0,8) для прогноза значимого фиброза печени (стадии F2-4) (фигура 19А), выраженного фиброза печени (стадии F3-4) (фигура 19В) и цирроза (стадия F4) (фигура 19С).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на удивительном обнаружении того, что белок 1 сосудистой адгезии (VAP-1), также известный как семикарбазид-чувствительная аминоксидаза (SSAO) и определяемый геном человека AOC3, играет непосредственную роль в образовании фиброзной ткани. К настоящему времени известно, что VAP-1 принимает участие в развитии целого ряда воспалительных заболеваний, опосредуя миграцию лейкоцитов в ткань, но не было показано, что он непосредственно вовлечен в патогенез самого фиброза.

Термин «фиброз» относится к образованию или наличию избыточной соединительной ткани в органе или ткани. Этот процесс может иметь место для восстановления или замещения в ответ на стимул, такой как поражение ткани или воспаление.

Одной из целей, лежащих в основе настоящего изобретения, было исследование роли ингибиторов VAP-1 в защите различных органов от фиброзного поражения. Были получены превосходные результаты, например, при хроническом фиброзном поражении печени, вызванном четыреххлористым углеродом на мышах на модели обструктивной болезни легких (COPD), индуцированной табачным дымом, на мышах и на мышиной модели васкулярного ремоделирования, васкулярного стеноза и утолщения неоинтимы (фиброза). Таким образом, ингибиторы VAP-1 реально могут рассматриваться в качестве антифиброзных средств.

Таким образом, в одном аспекте варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу подавления или лечения фиброза в условиях in vivo в организме человека введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора VAP-1. Термин «лечение» или «процесс лечения» включает введение ингибиторов VAP-1 субъекту в целях, которые могут включать профилактику, ослабление, предупреждение или излечение расстройств, включающих фиброз, такой как фиброз печени и воспалительные заболевания, предрасполагающие к нему, т.е. острый и хронический гепатит, заболевание желчного пузыря и желчных путей, и токсическое поражение печени, пульмонарный фиброз, фиброз почек, включая возникший в результате диабетической нефропатии, миелофиброз, фиброз поджелудочной железы, склеродерма, соединительнотканные заболевания, рубцевание, фиброз кожи, фиброз сердца, трансплантат органа, стеноз сосудов, рестеноз, фиброз артерий, артрофиброз, фиброз молочной железы, фиброз мышц, ретроперитонеальный фиброз, фиброз щитовидной железы, фиброз лимфатических узлов, фиброз мочевого пузыря, плевральный фиброз и COPD, заболевание при котором стенки дыхательных путей становятся фиброзными по мере накопления миофибробластов и коллагена, и включаются все подобные фиброзные ткани.

Термин «эффективное количество» ингибитора VAP-1 означает количество, при котором, как минимум, ослабляются все патологические эффекты фиброза. Специалисты в клинической области лечения расстройств, связанных с фиброзом, могут легко определить количества и схемы введения ингибиторов VAP-1. Предпочтительно ингибиторы VAP-1, которые являются моноклональными анти-VAP-1-антителами, вводятся интраваскулярно с интервалами в пределах от одного раза в неделю до одного раза в три месяца в дозах в пределах от 0,01 до 20 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 15 мг/кг, наиболее предпочтительно от 1,0 до 10 мг/кг. Альтернативно ингибиторы VAP-1 вводят подкожно с интервалами в пределах от одного раза в неделю до одного раза в три месяца в дозах в пределах от 0,1 до 20 мг/кг, более предпочтительно от 0,2 до 10 мг/кг, наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мг/кг.

Соединения по настоящему изобретению, которые являются ингибиторами SSAO, можно вводить в эффективном количестве в пределах дозировок примерно от 0,1 мкг/кг до примерно 300 мкг/кг, предпочтительно примерно от 1,0 мкг/кг до 10 мг/кг. Соединения по настоящему изобретению можно вводить в одной суточной дозе или в пересчете на кг массы тела, или суммарную суточную дозу можно вводить в разделенных дозах, например, два, три или четыре раза в сутки.

Вышеуказанный аспект можно формулировать альтернативным путем, т.е. так, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают ингибиторы VAP-1 в виде антифиброзных средств для профилактики, лечения и/или ослабления фиброзной болезни, такой как фиброз печени и воспалительные заболевания, предрасполагающие к нему, т.е. острый и хронический гепатит, заболевание желчного пузыря и желчных путей, и токсическое поражение печени, пульмонарный фиброз, фиброз почек, включая возникший в результате диабетической нефропатии, миелофиброз, фиброз поджелудочной железы, склеродерма, соединительнотканные заболевания, рубцевание, фиброз кожи, фиброз сердца, трансплантат органа, стеноз сосудов, рестеноз, фиброз артерий, артрофиброз, фиброз молочной железы, фиброз мышц, ретроперитонеальный фиброз, фиброз щитовидной железы, фиброз лимфатических узлов, фиброз мочевого пузыря, плевральный фиброз и COPD, заболевание при котором стенки дыхательных путей становятся фиброзными по мере накопления миофибробластов и коллагена, и включаются все подобные фиброзные ткани. Следовательно, ингибиторы VAP-1 можно использовать для производства лекарственного препарата для лечения указанных фиброзных болезней.

Термин «ингибитор VAP-1» относится к любому соединению, обладающему способностью блокировать функцию VAP-1 или его SSAO активность. Ингибиторы VAP-1 можно разделить на две основные группы, блокирующие антитела и ингибиторы SSAO.

В том смысле, в котором в данном документе используется термин «анти-VAP-1-антитело» (Ab) или «моноклональное анти-VAP-1-антитело» (MAb), он включает интактные антитела, а также фрагменты антител, такие как Fab- и F(ab’)₂-фрагменты, способные специфически связываться с белком VAP-1.

Подходящие анти-VAP-1-антитела для применения в различных аспектах настоящего изобретения имеются в данной области и дополнительные антитела можно получить способами, известными специалистам в данной области. Например, в патенте США № 5580780 описано моноклональное антитело (MAb), 1В2, которое распознает человеческий VAP-1 и которое может блокировать связывание лимфоцитов с HEV в миндалинах в тесте замороженного среза. MAb 1В2 представляет собой мышиное IgM-антитело, и оно является специфическим для человеческого VAP-1. В публикации международной заявки WO 03/093319 раскрывается химерное моноклональное антитело BTT-1002, обладающее пониженной иммуногенностью по сравнению с соответствующими мышиными антителами. Однако, будучи химерным антителом, его применимость для лечения людей несет определенный риск за счет иммуногенности и возникающей продукции антител против него.

В публикации международной заявки WO 2008/129124, включенной в данный документ для сведения, раскрывается полностью человеческие анти-VAP-1-антитела с пониженной иммуногенностью и высвобождением цитокинов. Примеры предпочтительных полностью человеческих моноклональных анти-VAP-1-антител включают антитела, содержащие полипептид тяжелой цепи, содержащий одну-три консенсусных CDR-последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-3, и/или полипептид легкой цепи, содержащий одну-три консенсусных CDR-последовательности, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24-26. Другие предпочтительные анти-VAP-1-антитела включают антитела, содержащие полипептид тяжелой цепи, содержащий первую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:4-8, вторую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:9-13, и третью CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:14-18, и/или полипептид легкой цепи, содержащий первую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:27-31, вторую CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:32-36, и третью CDR-последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:37-41.

В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения полностью человеческое анти-VAP-1-антитело представляет антитело, обозначенное как 8С10, и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:19, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:42. В еще одних вариантах осуществления анти-VAP-1-антитело представляет антитело, обозначенное как 8А4, и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:20, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:43. В еще одних вариантах осуществления анти-VAP-1-антитело представляет антитело, обозначенное как 3F10, и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:21, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:44. В еще одних вариантах осуществления анти-VAP-1-антитело представляет антитело, обозначенное как 5F12, и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:22, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:45. В еще одних вариантах осуществления анти-VAP-1-антитело представляет антитело, обозначенное как 4В3, и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:23, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:46. Данные антитела также можно обеспечить в виде рекомбинантных антител, таких как рекомбинантное антитело r8C10 (BTT-1023), содержащее полипептид тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:47, и полипептид легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:48.

Примеры подходящих ингибиторов SSAO для применения в настоящем изобретении включают, не ограничиваясь этим, производные гидразина, такие как алилгидразины, в частности, фенилаллилгидразины; и производные гидроксиламина (т.е. аминокси)производные. Более конкретные примеры фенилаллилгидразинов включают, не ограничиваясь этим, 2-(фенилаллил)гидразин, N-[2-(4’-фторфенил)аллил]гидразин и (Е)-1-фтор-2-фенил-3-гидразинопропен, где более конкретные примеры производные гидроксиламина включают, не ограничиваясь этим, 2-аминоокси-1-фенилэтанол и 2-аминоокси-1-(3’,4’-диметоксифенил)этанол. Такие ингибиторы SSAO описаны в международных заявках WO 2006/094201 и WO 2005/014530, которые включены в данный документ для сведения. Другие подходящие производные гидразина включают ацетогидразиды, такие как, не ограничиваясь этим, 2-(4-{2-[5-(4-ацетилпиперазин-1-ил)пиридин-2-ил]этил}фенил)ацетоксигидразид, описанные в международной заявке WO 2009/145360, включенной в данный документ для сведения; и гидразиновые спирты, такие как, не ограничиваясь этим, (1R,2S)-2-(1-метилгидразино)-1-фенил-1-пропанол, (1R,2S)-2-(1-метилгидразино)-1,2-дифенилэтанол, 1-(1’-метилгидразино)-3-(м-метоксифенокси)-2-пропанол и (1R,2S)-2-(1-метилгидразино)-1,2-дифенилэтанол (BTT-2079), описанные в международной заявке WO02/02090, включенной в данный документ для сведения; и гидразиновые инданы, такие как, не ограничиваясь этим, (1S,2S)-2-(1-метилгидразино)-1-инданол, описанный в международных заявках WO 03/006003 и WO 2005/080319, включенные в данный документ для сведения.

Дополнительные примеры подходящих ингибиторов SSAO для применения в настоящих вариантах осуществления включают, не ограничиваясь этим, пропениламины и пропаргиламины, 4-замещенные-2-бутиниламины, галогеналлиламины (в частности, 2- и 3-галогенамины), производные пирролина, пропаргилдиамины, аллиламины и диамины. Более конкретные примеры вышеуказанных ингибиторов SSAO включают, не ограничиваясь этим, 5-феноксипента-2,3-диениламин, 4-(4-метоксифенил)бут-3-иниламин, 4-фенилбут-3-иниламин, 2-фенил-3-фтораллиламин, S-(Е)-4-(4-амино-2-фторбут-2-енилокси)-N-(1-фенилэтил)бензамид, (Е)-3-фтор-4-(4-метилсульфонил)фенокси)бут-2-ен-1-амин, (Е)-3-фтор-4-(4-метилбензо[d]тиазол-5-илокси)бут-2-ен-1-амин, (Е)-4-(4-амино-2-фторбут-2-енилокси)-N-(1-фенилэтил)бензолсульфонамид и (Е)-2-(4-фторфенэтил)-3-фтораллиламин (BTT-2089, мофегелин). Такие соединения описаны в международных заявках WO 2007/005737, WO 2005/082343, WO 2009/066152, WO 2009/055002, WO 2007/005737 и Palfreyman et al., J. Neural. Transm., 1994, 41, 407-414), которые все включены в данный документ для сведения.

Еще одни примеры ингибиторов SSAO, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь этим, производные 4,5,6,7-тетрагидроимидазо[4,5-с]пиридина (описанные в международной заявке WO 02/38153, включенной в данный документ для сведения), карбоксамиды, такие как N-гидрокси-2-(2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)ацетамидо)ацетамид и 5-амино-2-гидрокси-N-(2-гидроксибензил)бензамид, и сульфонамиды, такие как N2-{[4-(1,1-диметилпропил)фенил]сульфонил}-N1-гидроксисеринамид, описанный в международной заявке WO 2006/013209 и заявке на патент США 2007/066646, которые включены в данный документ для сведения.

Кроме того, производные тиазола и/или гуанидина, в частности, производные 2-ациламинотриазола, подходят для применения в различных вариантах осуществления настоящего изобретения. Более конкретные примеры таких ингибиторов SSAO включают, не ограничиваясь этим, N-{4-[2-(4-{[амино(имино)метил]амино}фенил)этил]-1,3-тиазол-2-ил}ацетамид, N-{4-[2-(4-{[амино(имино)метил]амино}фенил)этил]-5-[4-(метилсульфонил)бензил]-1,3-тиазол-2-ил}ацетамид, N-{4-[2-(4-{[2-амино-1Н-имидазол-4-ил)метил]фенил}этил)тиазол-2-ил]ацетамид, 2-(4-{2-[2-(ацетиламино)-1,3-тиазол-4-ил]этил}фенил)-N-[амино(имино)метил]ацетамид. Такие соединения описаны в международных заявках WO 2004/087138, WO 2004/067521, WO 2006/028269, WO 2006/011631 и WO 2005/089755, которые все включены в данный документ для сведения.

Кроме того, различные оксимные производные представляют собой ингибиторы SSAO и, таким образом, могут использоваться в различных вариантах осуществления настоящего изобретения. Такие оксимные производные включают, не ограничиваясь этим, 5-бром-1,3-бензодиоксол-4-карбальдегида оксим, 6-этокси-1,3-диметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-карбальдегида оксим, 1,3-диметил-6-(метилтио)-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-карбальдегида оксим, описанные в международной заявке WO 2010/029379, включенной в данный документ для сведения.

Также дигидразин, арилалкиламины, оксазолидиноны, галогеналкиламины и бенфотиамин (витамин В1), раскрытые в международных заявках WO 2010/015870, WO 2005/072738, Lyles G.A., Int. J. Biochemical. Cell Biol. Vol. 28, pp. 259-276 (1996) и McDonald et al., Annual Reports in Med. Chem., Vol. 42, pp 229-243 (2007)), которые все включены в данный документ для сведения, можно использовать в качестве ингибиторов SSAO в различны вариантах осуществления настоящего изобретения.

Дополнительные ингибиторы SSAO, подходящие для применения в различных аспектах и вариантах осуществления настоящего изобретения, включают производные имидазопиридина, описанные в международной заявке WO 2010/064020, включенной в данный документ для сведения.

Кроме того, подходящие ингибиторы SSAO для применения в различных вариантах осуществления настоящего изобретения включают любой стереоизомер, смесь стереоизомеров, E- или Z-формы, смесь E- или Z-форм, пролекарство, метаболит, кристаллическую форму, некристаллическую форму, гидрат, сольват или их соль, обладающие способностью ингибировать или блокировать SSAO активность VAP-1.

Другие подходящие ингибиторы SSAO можно подвергнуть скринингу с использованием тестов оценки активности SSAO, известных в данной области. Такие тесты могут включать тест оценки SSAO активности VAP-1 с использованием сопряженного колориметрического метода, в частности, описанного для моноаминоксидазы и близких ферментов (Holt A. et al., Anal. Biochem., 244:384-392 (1997)). SSAO активность в эндотелиальных клетках также можно независимо определить с использованием реагента «Amplex Red» (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин), представляющего собой высокочувствительный и стабильный зонд для Н₂О₂ (Zhou M., Panchuk-Voloshina N., Anal. Biochem., 253(2):169-174 (1997)). Кроме того, активность аминоксидазы можно определить радиохимическим способом с использованием [7-¹⁴C]бензиламина гидрохлорида в качестве субстрата (Jaakkola et al., Am. J. Pathol., 155(6):1953-1965 (1999)). В качестве источника фермента VAP-1 SSAO можно использовать рекомбинантный VAP-1, экспрессированный в клеточных линиях, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО) (Smith D.J. et al., J. Exp. Med., 188:17-27 (1998)). Другими подходящими источниками фермента VAP-1 SSAO могут быть сыворотка крови и ткани от различных видов, таких как приматы и грызуны.

Для применения по настоящему ингибиторы VAP-1 могут быть обеспечены в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, и в качестве активного ингредиента ингибитор VAP-1. Композиция содержит ингибитор VAP-1 в количестве, достаточном для отмены (полной или частичной) SSAO активности у пациента или связывания природного VAP-1 с биологическими лигандами VAP-1 у пациентов, нуждающихся в такой отмене.

Количества и схемы введения ингибиторов VAP-1 могут легко определить специалисты в клинической области лечения расстройств, связанных с фиброзом. Как правило, дозы для лечения ингибитором VAP-1 будут зависеть от таких факторов, как возраст, пол и общее состояние здоровья пациента, который подвергается лечению; вида сопутствующего лечения, если таковое имеется; кратности лечения и природы требуемого эффекта; степени поражения ткани; продолжительности проявления симптомов и других переменных факторов для корректировки врачом. Требуемую дозу можно вводить один или более раз для получения желаемых результатов. Фармацевтические композиции для настоящих вариантов осуществления могут находиться в виде разовых лекарственных форм.

Фармацевтические композиции можно вводить в любом подходящем фармацевтическом носителе, используемом для введения препаратов. Их можно вводить в любой форме, которая оказывает профилактический, паллиативный, предупреждающий или лечебный эффект в отношении фиброзных болезней человека и животных.

Фармацевтические композиции для парентерального и местного введения включают стерильные водные или неводные растворители, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, рыбий жир и органические сложные эфиры для инъекционного введения. Водные носители включают воду, водно-спиртовые смеси, включая солевые растворы и забуференные растворители для парентерального введения, включающие раствор хлорид натрия, раствор декстрозы Рингера, раствор декстрозы плюс хлорид натрия, раствор Рингера, содержащий лактозу или нелетучие жирные масла. Растворители для внутривенного введения включают жидкость и заменители питательных веществ, заместители электролитов, такие как на основе раствора декстрозы Рингера. Водные композиции по вариантам осуществления могут содержать буферы, такие как натрий- или калий-фосфатный, цитратный, ацетатный, карбонатный или глициновый буферы в зависимости от требуемых пределов рН. Также пригодно применение хлорида натрия в качестве регулятора изотоничности. Композиции могут содержать другие наполнители, такие как стабилизаторы или консерванты. Подходящие стабилизаторы включают поверхностно-активные вещества (полисорбат 20 и 80, полоксамер 407), полимеры (полиэтиленгликоли, повидоны), углеводы (сахарозу, маннит, глюкозу, лактозу), спирты (сорбит, глицерин-пропиленгликоль, этиленгликоль), подходящие белки (альбумин), подходящие аминокислоты (глицин, глутаминовую кислоту), жирные кислоты (этаноламин), антиоксиданты (аскорбиновую кислоту, цистеин и т.д.), хелатообразующие агенты (соли ЭДТА, гистидин, аспарагиновую кислоту) или ионы металлов (Ca, Ni, Mg, Mn). В подходящие консерванты входят бензиловый спирт, хлорбутанол, бензалкония хлорид и возможно парабены.

Фармацевтическая композиция может находиться в концентрированной форме или в форме порошка для восстановления, когда это потребуется. В таких случаях можно использовать порошковые композиции для растворения в наполнителях для инъекции/инфузии. В случае лиофилизации предпочтительными являются некоторые криопротекторы, включающие полимеры (повидоны, полиэтиленгликоль, декстран), сахара (сахароза, глюкоза, лактоза), аминокислоты (глицин, аргинин, глутаминовая кислота) и альбумин. В том случае, если раствор для восстановления помещают в упаковку, то он может представлять чистую воду для инъекций или раствор хлорида натрия или декстрозы, или растворы глюкозы.

Терапевтически пригодные анти-VAP-1-антитела можно конъюгировать с использованием химического метода или генной инженерии с другими агентами, которые обеспечивают направленную доставку антител к требуемому месту действия. Альтернативно с антителами можно конъюгировать другие соединения с использованием химического метода или генной инженерии для повышения или обеспечения антителам дополнительных свойств, в частности, свойств, которые повышают способность антител ослаблять патологические эффекты, опосредованные связыванием VAP-1.

В анти-VAP-1-антитела можно ввести метку с использованием химического метода или генной инженерии с получением детектируемых антител. Такие меченые антитела представляют пригодные инструменты для визуализации фиброзных участков у людей, в частности, для иммуносцинтиграфической визуализации фиброзных участков. В целях визуализации применение фрагментов антител может быть предпочтительным по сравнению с использованием целых антител для антифиброзной терапии, и фрагменты, полученные из полностью человеческих антител, будут безопаснее по сравнению с их химерными или мышиными эквивалентными вариантами.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к диагностике фиброзных болезней. В связи с настоящим изобретением было установлено, что повышенные концентрации растворимого VAP-1 (sVAP-1) в жидкостях организма (таких как сыворотка или плазма крови) и, следовательно, повышенная активность SSAO коррелируют со степенью развития фиброза. Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают средства и способы диагностики фиброзных болезней, таких как фиброз печени и воспалительные заболевания, предрасполагающие к нему, т.е. острый и хронический гепатит, заболевание желчного пузыря и желчных путей, и токсическое поражение печени, пульмонарный фиброз, фиброз почек, включая возникший в результате диабетической нефропатии, миелофиброз, фиброз поджелудочной железы, склеродерма, соединительнотканные заболевания, рубцевание, фиброз кожи, фиброз сердца, трансплантат органа, стеноз сосудов, рестеноз, фиброз артерий, артрофиброз, фиброз молочной железы, фиброз мышц, ретроперитонеальный фиброз, фиброз щитовидной железы, фиброз лимфатических узлов, фиброз мочевого пузыря, плевральный фиброз и COPD, заболевание при котором стенки дыхательных путей становятся фиброзными по мере накопления миофибробластов и коллагена, и включаются все подобные фиброзные ткани.

В некоторых вариантах осуществления диагностику фиброзных болезней, основанную на повышенных концентрациях sVAP-1 и/или активности SSAO в жидкостях организма, можно объединить с анализом существующих панелей прогностических биологических маркеров фиброзных болезней. Это может повысить диагностическую способн