Кювета для лазерной абляции

Кювета для лазерной абляции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к кювете для лазерной абляции, к абляционному устройству и источнику ионов для индуктивно связанной плазмы (ИСП), применяющих такую кювету для лазерной абляции, и к способу использования такой кюветы для лазерной абляции, например, для визуализации биологического материала.

Уровень техники

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-MC) обеспечивает точную количественную информацию об основных, второстепенных, следовых и ультраследовых элементах промышленных, геологических, экологических и биологических проб. В процессе ИСП-МС в так называемую горелку с ИСП (ИСП-горелку) потоком газа-носителя вносится проба аэрозоля. В этой горелке газ подвергается воздействию интенсивных высокочастотных электромагнитных полей, которые приводят к образованию плазмы посредством индукции. Ионы из плазмы затем извлекают в масс-спектрометр, где они разделяются на основе отношений их масс к зарядам.

ИСП-МС можно сочетать с лазерной абляцией (ЛА) для подвергания абляции материала из твердой пробы с целью создания аэрозоля, требующегося для ИСП. Абляцию можно проводить непосредственно в ИСП-горелке, или можно размещать пробу во внешней кювете для лазерной абляции выше по течению от ИСП-горелки, а аэрозоль, создаваемый посредством лазерной абляции, транспортируется к ИСП-горелке потоком газа-носителя. Например, документ 1 продемонстрировал кювету для лазерной абляции (так называемую кювету HEAD), для которой направление выбрасывания аэрозоля параллельно направлению уноса газа-носителя. Другая конструкция кюветы для лазерной абляции, основанная на аналогичном принципе, продемонстрирована в документе 2.

С первой половины 1990-х гг. выполняли попытки использовать ИСП-МС с лазерной абляцией (ЛА-ИСП-МС) в качестве инструмента химической визуализации путем сканирования лазерным пятном поверхности пробы. Многие исследования продемонстрировали потенциальные визуализирующие возможности ЛА-ИСП-МС на основе значительного разнообразия твердых и мягких проб. Большинство этих исследований показали эффективное пространственное разрешение приблизительно 5-100 мкм. Хотя ЛА-ИСП-МС предлагает весьма усложненный количественный анализ экспрессии антигена в одиночных клетках, в настоящее время этот метод не обеспечивает разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в пределах проб тканей.

Однако некоторые применения, такие как диагностический анализ срезов тканей, требуют повышенное пространственное разрешение, например, для визуализации изменчивости от клетки к клетке. Эффективное пространственное разрешение определяется размером лазерного пятна, "размытым" дисперсией системы. В свою очередь, над дисперсией системы часто преобладает компромисс между временем вымывания аэрозоля после каждого выстрела лазера и скоростью сканирования. Чем больше время вымывания, тем большее перекрытие будет происходить между сигналами, происходящими из соседних пятен пробы, если скорость сканирования поддерживается фиксированной. Следовательно, время вымывания аэрозоля часто является одним из ключевых факторов, ограничивающих повышение разрешения без увеличения общего времени санирования.

Время наибыстрейшего вымывания может быть достигнуто посредством абляции в горелке, приводящей к длительностям сигналов одиночных выстрелов, составляющим несколько миллисекунд. Вместе с тем, абляция в горелке ограничивается очень небольшими пробами, а сканирование лазерным пятном очень трудно реализовать при абляции в горелке. Поэтому для визуализирующих применений, как правило, применяют наружные кюветы для лазерной абляции. Вместе с тем, даже в наиболее известных конструкциях кювет времена вымывания часто составляют порядка секунд, а небольших времен вымывания, менее 100 миллисекунд, достичь трудно.

Задача изобретения состоит в обеспечении дополнительных и усовершенствованных кювет для лазерной абляции и абляционных устройств, включающих такие кюветы (например, в связи с методом ИСП-МС), которые находят применение в методах визуализации биологического материала, такого как пробы тканей, монослои клеток и биопленки, и которые подходят, в частности, для внедрения ЛА-ИСП-МС для использования в качестве метода визуализации одиночных клеток.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает кювету для лазерной абляции, обладающую потенциалом достижения коротких времен вымывания аэрозолей. Такая кювета для лазерной абляции охарактеризована в п. 1. формулы изобретения. Дополнительные варианты осуществления изобретения выложены в зависимых пунктах формулы изобретения.

Соответственно, обеспечена кювета для лазерной абляции, содержащая проточный канал, имеющий вход для подачи газа-носителя в этот проточный канал и имеющий выход. На первом участке стенки проточного канала предусмотрено боковое отверстие, а на втором участке стенки проточного канала напротив этого бокового отверстия расположено боковое окно. Рядом с боковым отверстием предусмотрена камера для пробы. Камера для пробы выполнена с возможностью приема пробы так, чтобы позволить лазерному лучу попадать в камеру для пробы через боковое окно и боковое отверстие и падать на поверхность пробы так, чтобы подвергать абляции материал с поверхности пробы и создавать аэрозоль. Камера для пробы имеет вход для подачи защитного газа в камеру пробы.

Вход и выход проточного канала могут быть соединены с трубками, имеющими, по существу, такую же площадь поперечного сечения, как сам проточный канал. Таким образом, проточный канал действует, по существу, подобно одиночной детали трубки. Следовательно, абляционную кювету согласно настоящему изобретению можно считать имеющей конструкцию «трубчатой кюветы». За счет минимизации изменений площади поперечного сечения (а предпочтительно также формы поперечного сечения) проточного канала, эта конструкция «трубчатой кюветы» позволяет поддерживать режим по существу ламинарного течения, предотвращая турбулентности настолько, насколько это возможно. Помимо этого, эта конструкция обеспечивает позиционирование пробы достаточно близко к проточному каналу, так что основная доля создаваемого лазером факела аэрозоля вводится непосредственно в поток газа-носителя. Эти меры значительно уменьшают дисперсию. На практике, представленная конструкция кюветы обеспечивает уменьшение времени вымывания до менее 30 мс (полная ширина на 1% максимума) и минимизацию отходов вымывания пробы. Это усовершенствование наблюдается для элементов по всему диапазону атомных масс.

Проточный канал предпочтительно имеет площадь поперечного сечения, которая по существу неизменна или изменяется совсем слабо. В частности, площадь поперечного сечения проточного канала предпочтительно является по существу неизменной в окрестностях бокового отверстия. Площадь поперечного сечения проточного канала можно считать изменяющейся совсем слабо, если любые изменения в поперечном сечении незначительно нарушают ламинарное течение. В частности, площадь поперечного сечения можно считать изменяющейся совсем слабо, если изменение среднего диаметра проточного канала менее 1,5 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки, предпочтительно менее 0,5 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки, более предпочтительнее менее 0,2 мм на 1 мм длины вдоль оси трубки для любой плоскости поперечного сечения вдоль проточного канала. Предпочтительно, чтобы проточный канал не образовывал четко выраженного сужения у бокового отверстия во избежание четко выраженных эффектов всасывания, как в трубке Вентури, и чтобы проточный канал не расширялся значительно в окрестностях бокового отверстия во избежание нагнетания газа-носителя в камеру для пробы за счет получающейся положительной разности давлений.

В абсолютных цифрах площадь поперечного сечения может принимать широкий диапазон значений, в зависимости от размера лазерного пятна и энергии лазера. Средний диаметр проточного канала (вычисляемый как , где А - площадь поперечного сечения) может находиться в диапазоне, например, от 50 микрометров до 5 миллиметров, предпочтительно от 200 микрометров до 5 миллиметров.

Угол между входом и выходом проточного канала предпочтительно составляет по меньшей мере 160° (точнее между 160° и 200°), предпочтительнее по меньшей мере 170° (точнее между 170° и 190°). Иными словами, проточный канал предпочтительно является по существу прямым или изогнутым не более чем на 20°, или лучше не более чем на 10° в любом направлении. Можно выбрать произвольное направление входа защитного газа относительно направления проточного канала. Вход защитного газа предпочтительно простирается перпендикулярно поперечному направлению.

Проточный канал и камера для пробы разделены разделяющей стенкой, которая образует первый участок стенки проточного канала, на котором расположено боковое отверстие. Чтобы обеспечить позиционирование пробы достаточно близко к проточному каналу, разделяющая стенка предпочтительно имеет минимальную толщину менее 500 микрометров, предпочтительнее менее 200 микрометров. Следует отметить, что толщина разделяющей стенки может изменяться по окружности проточного канала; при этом разделяющая стенка обычно будет иметь наименьшую толщину непосредственно рядом с отверстием между трубкой и камерой для пробы, и толщина будет увеличиваться по мере отдаления от этого отверстия в плоскости, перпендикулярной оси трубки. Дополнительно толщина может изменяться вдоль длины проточного канала.

Чтобы минимизировать возмущения потока, вызванные боковым отверстием, площадь поперечного сечения этого отверстия следует поддерживать небольшой. С другой стороны, может оказаться желательным выполнить отверстие достаточно большим, чтобы предоставить возможность сканирования поверхности пробы лазерным лучом без перемещения этой пробы относительно отверстия. В качестве компромисса площадь поперечного сечения бокового отверстия предпочтительно составляет не более чем примерно 20 мм², предпочтительнее не более чем примерно 7 мм². Выраженное относительно площади поперечного сечения проточного канала отношение площадей поперечных сечений отверстия и проточного канала предпочтительно не более чем примерно 5, предпочтительнее не более чем примерно 3, наиболее предпочтительно не более, чем примерно 1. Чтобы предоставить лазерному лучу возможность прохождения через боковое отверстие, это боковое отверстие предпочтительно должно иметь площадь поперечного сечения по меньшей мере примерно 0,01 мм². Ширина бокового отверстия, поперечного проточному каналу, предпочтительно менее 80% среднего диаметра проточного канала, а предпочтительнее менее 50% среднего диаметра проточного канала. Длина бокового отверстия в направлении проточного канала предпочтительно не более, чем в пять раз превышает средний диаметр проточного канала, а предпочтительнее не более чем в три раза или даже в 1,5 раза превышает диаметр проточного канала.

Чтобы предоставить возможность легкой замены пробы, кювета для лазерной абляции предпочтительно имеет конструкцию из двух частей, содержащую первую часть кюветы (именуемую далее «верхней частью кюветы»), в которой заключен проточный канал, и вторую часть кюветы (именуемую далее «нижней частью кюветы»), которая образует камеру для пробы. Нижняя часть кюветы предпочтительно выполнена с возможностью отделения от верхней части кюветы для замены пробы. Нижняя часть кюветы предпочтительно открыта к верхней части кюветы, т.е. разделяющая стенка между камерой для пробы и проточным каналом предпочтительно образована скорее верхней частью кюветы, чем нижней частью кюветы. Термины «верхняя» и «нижняя» не следует понимать как определяющие абсолютную ориентацию этих частей; эти термины используют только для лучшего различения между разными частями кюветы, а кювету для лазерной абляции можно также использовать в перевернутой ориентации, где верхняя часть кюветы обращена к полу, а нижняя часть кюветы обращена к потолку.

Изобретение дополнительно относится к комплектному абляционному устройству, содержащему абляционную кювету, описанную выше. Абляционное устройство дополнительно содержит лазер, в частности УФ-лазер, для стрельбы по поверхности пробы лазерным лучом через боковое окно и боковое отверстие, и позиционирующее устройство для изменения относительного положения пробы и лазерного луча. Позиционирующее устройство может содержать, например, любое из нижеследующего: двухкоординатный или трехкоординатный столик для перемещения всей кюветы для лазерной абляции относительно лазера; двухкоординатный или трехкоординатный столик для перемещения пробы в пределах кюветы для лазерной абляции с сохранением фиксированного относительного положения между абляционной кюветой и лазером; дефлектор луча для отклонения лазерного луча с сохранением фиксированного относительного положения между абляционной кюветой и лазером; и т.д. Позиционирующее устройство можно применять для сканирования поверхности пробы лазерным лучом. Получающийся аэрозоль можно впоследствии анализировать на предмет его элементного или изотопного состава, например, методом ИСП-МС. Таким образом можно визуализировать поверхность пробы в соответствии с ее элементным или изотопным составом. Вместе с тем настоящее изобретение не ограничивается использованием абляционной кюветы в сочетании с визуализацией методом ИСП-МС, и может применяться также в других способах, в которых требуются короткие импульсы аэрозоля.

Изобретение дополнительно обеспечивает источник ионов в виде ИСП, содержащий вышеописанную абляционную кювету. Этот источник ИСП дополнительно содержит ИСП-горелку, соединенную с выходом абляционной кюветы, и трубку, соединяющую упомянутую абляционную кювету с ИСП-горелкой. Трубка предпочтительно имеет площадь поперечного сечения, которая по существу идентична площади поперечного сечения проточного канала абляционной кюветы, или лишь слабо изменяется по сравнению с площадью поперечного сечения проточного канала так, чтобы поддерживать ламинарное течение с минимальной дисперсией по всей длине трубопровода.

Изобретение также охватывает систему для ИСП-МС (ИСП-МС-систему) содержащую такой источник ионов в виде ИСП и масс-анализатор, связанный с источником ионов. Масс-анализатор может быть, например, квадрупольным масс-анализатором, времяпролетным масс-анализатором (ВП-масс-анализатором) или масс-анализатором с секторным полем, в частности, масс-анализатором Маттауха-Герцога. Вместе с тем изобретение не ограничивается каким-либо конкретным типом масс-анализатора.

Изобретение дополнительно обеспечивает способ работы вышеописанной абляционной кюветы. Способ содержит, но не обязательно в приведенном порядке:

размещение пробы в камере для пробы таким образом, что поверхность пробы обращена к боковому отверстию;

подачу газа-носителя на вход проточного канала;

подачу защитного газа на вход камеры для пробы; и

подвергание материала абляции с поверхности посредством стрельбы лучом импульсного лазера по упомянутой поверхности через боковое окно и боковое отверстие.

Направление лазерного луча, ориентация бокового окна и бокового отверстия, а следовательно ориентация пробы в пространстве могут быть произвольными. Например, лазерный луч может быть направлен вверх, вниз, вбок и т.д., а поверхность пробы может быть ориентирована в любой ориентации, которая обеспечивает лазерному лучу возможность достигать поверхность пробы.

Каждый лазерный импульс будет вызывать квазимгновенное распределение генерируемой лазером массы аэрозоля («факела»). В данном случае, «квазимгновенное» означает временной масштаб, который значительно меньше, чем временной масштаб переноса массы потоком газа-носителя и потоком защитного газа. Распределение генерируемой лазером массы аэрозоля обуславливается действием лазерного импульса самого по себе, без учета обычного потока таких газов, как газ-носитель и защитный газ. Это распределение массы устанавливается в пределах менее 1 миллисекунды после первого взаимодействия лазерного импульса с пробой. Пробу предпочтительно позиционируют на таком расстоянии от проточного канала, что квазимгновенное распределение генерируемой лазером массы аэрозоля имеет свой центр в пределах проточного канала между боковым отверстием и боковым окном. Центр распределения массы определяют как обычно, т.е. так же, как центр масс жесткого твердого тела, проводя интегрирование по всему факелу аэрозоля. Таким образом, большая часть факела аэрозоля нагнетается непосредственно в поток газа-носителя и может быть унесено потоком газа-носителя с минимальной дисперсией.

Оптимальное расстояние между поверхностью пробы и центральной осью проточного канала будет зависеть от типа лазера, энергии лазерного луча, типа газа-носителя и защитного газа, а также расходов газов. Например, для стандартного эксимерного ArF лазера с импульсами в наносекундном диапазоне, аргоном в качестве газа-носителя с расходом 1,1 л/мин и гелием в качестве защитного газа с расходом 0,6 л/мин, оптимальным оказывается расстояние примерно 2 мм. Говоря обобщеннее, пробу предпочтительно следует позиционировать так, чтобы поверхность пробы имела расстояние от центральной оси проточного канала в диапазоне от 0,5 миллиметра до 4,5 миллиметров для лазерных импульсов в диапазоне от 50 фемтосекунд до 50 наносекунд.

Вследствие этого, оптимальное расстояние между поверхностью пробы и разделяющей стенкой, которая отделяет камеру пробы от проточного канала, будет зависеть от различных параметров. Это расстояние может находиться в диапазоне от менее 50 микрометров до 1 миллиметра или более. Расстояние должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить защитному газу возможность протекания вдоль поверхности пробы и через боковое отверстие в проточный канал.

Защитный газ выполняет по меньшей мере три задачи: он продувает аэрозоль на оси сообразно с направлением нагнетания аэрозоля, что способствует поглощению частиц аэрозоля в потоке газа-носителя; он образует «область защиты» над поверхностью пробы и гарантирует, что абляция осуществляется в управляемой атмосфере; и он увеличивает скорость течения в проточном канале. Вязкость защитного газа предпочтительно ниже, чем вязкость основного газа-носителя. Это способствует локализации аэрозоля в центре проточного канала и минимизации дисперсии аэрозоля ниже по течению от абляционной кюветы. В частности, газом-носителем предпочтительно является аргон (Ar). Аргон хорошо подходит, в частности, для прекращения распространения аэрозоля до того, как он достигает стенок проточного канала, и он также необходим для повышенной инструментальной чувствительности в большинстве случаев ИСП на основе газообразного Ar. Защитным газом предпочтительно является гелий (He). Вместе с тем этот защитный газ может быть заменен другими газами или может содержать их, например, водород, азот или водяной пар. Основная доля защитного газа, например, по меньшей мере, 50 объем. %, предпочтительно представляет собой гелий. При 25°C Ar имеет вязкость 22,6 мкПа⋅с, в то время как He имеет вязкость 19,8 мкПа⋅с.

Оптимальные расходы газа-носителя и защитного газа будут зависеть от множества факторов, прежде всего от геометрии, в частности, от площади поперечного сечения проточного канала. Во-вторых, они будут зависеть от геометрии бокового отверстия. Вместе с тем предпочтительно, чтобы объемный расход защитного газа был меньше, чем объемный расход газа-носителя, в частности, составлял от 0,3 до 1,0 объемного расхода газа-носителя. Объемный расход защитного газа можно регулировать, чтобы способствовать нагнетанию центра факела аэрозоля близко к центру проточного канала.

Способ по настоящему изобретению подходит, в частности, для химической визуализации. С этой целью вышеупомянутый способ может содержать сканирование поверхности лазерным лучом и анализ получающегося в результате аэрозоля для получения химического изображения поверхности пробы. Анализ можно осуществлять масс-спектрометрией, в частности, посредством ИСП-МС, но можно также осуществлять любым другим подходящим способом.

Данный способ хорошо подходит для исследования биологических проб, в частности проб ткани человека или ткани животного. Вместе с тем способ не ограничивается биологическими пробами и может быть применен также для проб других видов. При выполнении на биологических пробах способ по изобретению можно выполнять на субклеточном уровне, на клеточном уровне или при пониженном разрешении, при котором отдельные клетки в ткани индивидуально не разрешимы.

Краткое описание чертежей

Предпочтительные варианты осуществления описываются далее со ссылкой на чертежи, которые приводятся с целью иллюстрации представленных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, а не с целью их ограничения. На чертежах:

Фиг. 1 показывает схематический эскиз (не в масштабе) перспективного изображения кюветы для лазерной абляции в соответствии с настоящим изобретением;

Фиг. 2 показывает схематический эскиз (не в масштабе) центрального продольного сечения кюветы для лазерной абляции по фиг. 1;

Фиг. 3 показывает схематическую иллюстрацию (не в масштабе) генерируемой лазером факела в кювете для лазерной абляции;

Фиг. 4 схематически иллюстрирует результаты моделирования потока газа в проточном канале кюветы для лазерной абляции; часть (a) показывает рисунок распределения смеси He и Ar, когда полученный абляцией (уносимый) аэрозоль находится на границе раздела смеси выше бокового отверстия, причем степень смешения обозначена оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую степень смешения; часть (b) показывает смоделированный рисунок скоростей течения газов, причем скорость течения обозначена оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую скорость течения;

Фиг. 5 весьма схематично иллюстрирует комплектную систему для ЛА-ИСП-МС (ЛА-ИСП-МС-систему), применяющую кювету для лазерной абляции по фиг. 1;

Фиг. 6 показывает диаграммы, иллюстрирующие результаты оптимизаций рабочих характеристик кюветы для лазерной абляции при изменении: (a) величины зазора между поверхностью пробы и боковым отверстием; (b) расхода газа-носителя (Ar); и (c) расхода защитного газа (He); на всех диаграммах показана ширина пика, нормированная по площади пика на основании полной ширины по критерию 1%-го максимума;

Фиг. 7 показывает диаграммы, иллюстрирующие рабочие характеристики кюветы для лазерной абляции, как продемонстрировано интенсивностью ²⁷Al в масс-спектрометре при различных частотах повторения: (a) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 1 Гц; (b) вид в увеличенном масштабе ограниченного участка части (a); (c) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 10 Гц; (d) сигнал переходного процесса для частоты повторения приблизительно 30 Гц;

Фиг. 8 показывает диаграммы, иллюстрирующие характеристики кюветы для лазерной абляции для различных изотопов: (a) ширину пика; (b) относительная нормированная чувствительность, вычисленная исходя из площади пика;

Фиг. 9 показывает изображения, полученные для покрытого Pt тестового рисунка с пленкой Au в форме букв «ETH» и накрывающей пленкой Ag в форме букв «PSI»; визуализацию осуществляли (a) оптической микроскопией; (b) сканирующей электронной микроскопией; (c) и (d) ЛА-ИСП-МС в квадрупольном масс-анализаторе, применяющем кювету для лазерной абляции по фиг. 1; и

Фиг. 10 показывает изображение распределения рецептора 2 к фактору роста эпидермиса человека (HER2) на тонком срезе раковой ткани молочной железы, полученного методом ЛА-ИСП-МС в однодетекторном масс-анализаторе с секторным полем.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Кювета для лазерной абляции

Фиг. 1 и 2 схематически иллюстрируют кювету 1 для лазерной абляции, также именуемую в дальнейшем «трубчатой кюветой», в соответствии с примерным вариантом осуществления по настоящему изобретению. Абляционная кювета 1 содержит две части: первую часть или верхнюю часть 10 кюветы и вторую часть или нижнюю часть 20 кюветы. В верхней части 10 кюветы образован трубчатый проточный канал 11, простирающийся от входа 12 газа-носителя к выходу 13 смешанного газа. На участке 15 нижней стенки верхней части 10 кюветы образовано боковое отверстие 14. На участке 17 верхней стенки верхней части 10 кюветы образован поперечный проход, закрытый окном 16 из диоксида кремния, прозрачным для УФ-лучей. В нижней части 20 кюветы предусмотрена камера 21 для пробы. Вход 22 защитного газа ведет к камере 21 для пробы. Хотя вход 22 защитного газа показан как простирающийся (анти)параллельно проточному каналу 11, может быть выбрано произвольное направление входа защитного газа. Вход защитного газа предпочтительно простирается перпендикулярно поперечному направлению. В камере 21 для пробы размещают пробу 23 и устанавливают нижнюю часть 20 кюветы на верхнюю часть 10 кюветы таким образом, что верхняя поверхность 24 пробы 23 оказывается под боковым отверстием 14.

Для работы абляционной кюветы на вход 12 проточного канала 11 подают газ-носитель G1, а на вход 22 камеры 21 для пробы подают защитный газ G2. Луч 41 УФ-лазера попадает в окно 16, пересекает проточный канал 11 выходит из проточного канала 11 через боковое отверстие 14 и падает на верхнюю поверхность 24 пробы 23.

Каждый лазерный импульс генерирует аэрозольный факел 25, схематически изображенный на фиг. 3. Этот факел является непосредственным результатом действия лазерного импульса; первоначальное распределение массы в факеле сразу же после окончания лазерного импульса подвергается лишь весьма небольшому влиянию потоков газа-носителя G1 и защитного газа G2. Конструкция кюветы 1 для лазерной абляции обеспечивает возможность размещения центра распределения генерируемой лазером массы аэрозоля точно в проточном канале без необходимости сначала переносить аэрозоль в проточный канал посредством потока защитного газа. Затем газ-носитель G1 и защитный газ G2 уносят аэрозоль к выходу 13, где они выходят из абляционной кюветы в виде потока G3 смешанного газа.

В качестве газа-носителя G1 предпочтителен аргон (Ar). В качестве защитного газа предпочтительно выбирают гелий (He). Ar выгоден для остановки распространения аэрозоля, которое, как правило, происходит в атмосферах чистого He. Добавление He из контейнера для пробы имеет три преимущества: a) такая компоновка обеспечивает продувку аэрозоля сообразно с направлением нагнетания аэрозоля, что способствует поглощению частиц; b) газообразный He образует область «защиты» над поверхностью пробы и гарантирует, что абляция проводится в атмосфере He; c) смешивание Ar и He уже в трубчатой кювете не только предотвращает необходимость дисперсионного адаптера газа (резервуара для смешивания Ar и He), но также увеличивает скорость течения и вязкость газа по сравнению с обычной компоновкой, использующей в качестве газа-носителя только He, вследствие чего уменьшается дисперсия аэрозоля.

Фиг. 4 показывает результаты расчетных моделирований динамики текучей среды, осуществленных с помощью пакета программного обеспечения ANSYS CFX 12 (ANSYS Inc., Berlin, Germany). При моделировании рассматривали модель переноса напряжения сдвига для турбулентности. Моделирования осуществляли для следующих параметров: длина бокового отверстия: L=4,5 мм; ширина бокового отверстия: 1,5 мм; минимальная толщина нижнего участка стенки: w=50 микрометров; общая длина проточного канала: 50 мм; диаметр цилиндрической камеры пробы: 23 мм; расстояние между верней поверхностью 24 пробы 23 и участком 15 нижней стенки: d=350 микрометров. Потоку Ar на входе придавали постоянную скорость 2,6 м/с (1,1 л/мин), в то время как He моделировали, используя 1,4 м/с (0,6 л/мин).

Распределение смеси обоих газов на входе показано на фиг. 4 (a). Смешивание обоих газов обозначено оттенками серого цвета, а белый цвет отображает наивысшую степень смешения. У бокового отверстия 14 образуется резкая граница раздела при попадании потока He в поток Ar. В области отверстия гелий в значительной степени доминирует и образует вместе с аргоном граничный слой. Благодаря наименьшей степени смешения этих двух газов в боковом отверстии 14 и предыдущим результатам, указывающим, что полученный абляцией лазером аэрозоль легко проникает в He, но не в Ar, можно допустить, что аэрозоль не диффундирует в атмосферу аргона, вследствие чего не достигает всего поперечного сечения проточного канала и остается очень плотным. Первоначально очень резкая граница раздела расширяется в пределах нескольких миллиметров ниже по течению от отверстия. Изменяя комбинацию потоков газов на входе, можно управлять высотой граничного слоя и соответственно высотой получаемого абляцией аэрозоля.

Смоделированное распределение скоростей потока газов показано на фиг. 4 (b). Поток Ar на входе выше по течению от бокового отверстия 14 представляет типичное распределение ламинарного течения в проточном канале, являясь самым быстрым в центре трубки и постепенно замедляясь в направлении стенки трубки. Моделирование выхода обоих газов не показало значимо турбулентного течения. Как бы то ни было, расчетное число Рейнольдса (~2000) близко к перехода от ламинарного к турбулентному течению (2300~4000). Вместе с тем, использование турбулентной модели указало на четкое ламинарное течение. Поэтому можно сделать вывод, что благодаря отсутствию турбулентностей и определенному расстоянию остановки генерируемого лазером аэрозоля близко к центру трубчатой кюветы, которое согласовано с наивысшей скоростью газа, должна быть достигнута низкая дисперсия аэрозоля.

Фиг. 5 схематически иллюстрирует комплектную ЛА-ИСП-МС-систему. Лазерный луч генерируется лазером 40. Кювету 1 для лазерной абляции устанавливают на трехкоординатном столике 5, чтобы сделать возможным изменение положения пробы относительно лазерного луча. Выход 13 кюветы 1 для лазерной абляции соединен с ИСП-горелкой 6 трубкой 61. Трубка 61 имеет по существу такой же внутренний диаметр, как проточный канал 11 кюветы 1 для лазерной абляции, чтобы гарантировать ламинарное течение газа G3 на выходе. ИСП-горелка генерирует источник плазмы за счет работы радиочастотной катушки (РЧ-катушки) 62; горелки сконструирована обычным образом. ИСП-горелки хорошо известны в данной области техники и не требуют дальнейших пояснений. ИСП-горелка соединена с масс-анализатором 7 посредством источника 71 ИСП. Масс-анализатор может быть квадрупольным масс-анализатором, времяпролетным масс-анализатором (ВП-масс-анализатором), масс-анализатором с секторным полем и т.д.

Конечно, без отклонения от объема настоящего изобретения возможны многие модификации кюветы для лазерной абляции и установки для ЛА-ИСП-МС. В частности, настоящее изобретение не ограничивается конкретным выбором материалов кюветы для лазерной абляции, конкретными геометрией или размером камеры для пробы, конкретными геометрией, длиной и диаметром проточного канала в абляционной кювете, конкретными геометрией и размером бокового отверстия в абляционной кювете, конкретными размером окна или материалом, конкретным типом лазера для абляции, конкретными типами газов, вводимых в абляционную кювету, и т.д.

ЛА-ИСП-МС и масс-цитометрия

Изобретение относится к кювете для лазерной абляции, которая может быть связана с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ЛА-ИСП-МС), находящей применение при визуализации биологических проб. Таким образом, изобретение обеспечивает ЛА-ИСП-МС, содержащую (i) кювету для лазерной абляции в соответствии с изобретением и (ii) масс-анализатор. В одном применении разные молекулы-мишени в пробе могут быть помечены разными метящими атомами, и тогда ЛА-ИСП-МС используют по всем множественным клеткам меченой биологической пробы. За счет сопоставления обнаруживаемых сигналов с известными положениями лазерных абляций в кювете для лазерной абляции, которые стали источниками тех сигналов, способ позволяет соотносить меченую молекулу-мишень с конкретными местами на пробе и, таким образом, конструкцию изображение пробы.

ЛА-ИСП-МС включает в себя воздействие на пробу ткани лазерными импульсами, которые генерируют факелы абляционного (уносимого) материала из пробы, и эти факелы переносятся в виде аэрозоли в прибор для ИСП-MС с целью анализа. Метящие атомы в пробе можно различить посредством МС и поэтому их обнаружение выявляет присутствие или отсутствие множественных мишеней в факеле.

Пространственное разрешение сигналов, генерируемых таким образом, зависит от двух основных факторов: (i) размера пятна лазера, поскольку сигнал интегрируется по всей площади, которая подвергается абляции; и (ii) скорости, при которой можно анализировать факел, по отношению к скорости, с которой факелы генерируются, чтобы избежать перекрытия сигнала от последовательных факелов.

Таким образом, чтобы проанализировать отдельные клетки, следует использовать размер лазерного пятна, который не больше, чем у этих клеток, а конкретнее размер лазерного пятна, который может подвергать материал абляции при субклеточном разрешении. Этот размер будет зависеть от конкретных клеток в пробе, но в общем случае лазерное пятно будет иметь диаметр менее 4 мкм, например, в диапазоне 0,2-4 мкм, 0,25-3 мкм или 0,4-2 мкм. Таким образом лазерное пятно может иметь диаметр примерно 3 мкм, 2 мкм, 1 мкм или 0,5 мкм. В предпочтительном варианте осуществления диаметр лазерного пятна находится в пределах диапазона 0,5-1,5 мкм или примерно 1 мкм. Небольших размеров пятен можно достичь с помощью размагничивания расширенных лазерный лучей и использования оптики ближнего поля. Диаметр 1 мкм лазерного пятна соответствует фокальной точке лазера 1 мкм, но фокальная точка лазера может изменяться на +/-20% из-за числовой апертуры объектива, который переносит лазерный луч на поверхность пробы.

Для быстрого анализа пробы ткани необходима высокая частота абляции, например, 10 Гц или более (т.е. 10 абляций в секунду, что дает 10 факелов в секунду). В предпочтительном вариантом осуществления частота абляции находится в пределах диапазона 10-200 Гц, в пределах диапазона 15-100 Гц или в пределах диапазона 20-50 Гц. Частота абляции по меньшей мере 20 Гц обеспечивает возможность визуализации проб типичных тканей, достигнутой за приемлемое время. Как отмечено выше, на этих частотах приборы должны быть способны анализировать абляционный материал достаточно быстро во избежание существенного перекрытия сигналов между последовательными абляциями. Предпочтительно, чтобы перекрытие между сигналами, происходящими из последовательных факелов, составляло по интенсивности <10%, предпочтительнее <5%, а в идеальном случае <1%. Время, необходимое для анализа факела будет зависеть от времени вымывания абляционной кюветы, времени процесса перехода факельного аэрозоля в и сквозь ИСП и времени, затрачиваемого на анализ ионизированного материала.

Кювета с длительным временем вымывания либо будет ограничивать скорость, с которой можно генерировать изображение, либо будет приводить к перекрытию между сигналами, происходящими из последовательных пятен пробы (см., например, ссылку 3, в которой указана длительность сигнала более 10 секунд). Следовательно, время вымывания аэрозоля является ключевым ограничивающим фактором для достижения разрешения без увеличения общего времени сканирования. С помощью данного изобретения можно достичь времени, приходящегося на пространственно различимый пиксель в конечном изображении, менее 100 мс.

Временем процесса перехода факельного аэрозоля в и сквозь ИСП можно легко управлять, просто позиционируя абляционную кювету около ИСП и гарантируя поток газа, достаточный для переноса аэрозоля с надлежащей скоростью непосредственно в ИСП. Перенос с помощью аргона и гелия обеспечивает хорошие результаты.

Время, затрачиваемое на анализ ионизированного материала, будет зависеть от типа масс-анализатора, который используется для обнаружения ионов. Например, измерительные приборы, предусматривающие использова