Антитела против тау

Антитела против тау

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Государственная поддержка

Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительства по 1R01NS071835, присужденному Национальному институту неврологических расстройств и инсульта. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам против тау и способам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Агрегация связанного с микротрубочками белка тау связана с несколькими нейродегенеративными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера (AD) и лобно-височная деменция. При AD патологическая агрегация тау распространяется постепенно по всему мозгу, возможно, вдоль существующих нейронных сетей. AD является наиболее распространенной причиной слабоумия и растущей проблемой общественного здравоохранения. В настоящее время от данной болезни страдает примерно 5 миллионов человек в Соединенных Штатах с ожидаемым увеличением до 13 миллионов к 2050 году. Болезнь Альцгеймера приводит к потере памяти, когнитивной функции и, в конечном счете, потери независимости. Она приводит к тяжелым личностным и финансовым потерям для пациента и его семьи. Вследствие тяжести и увеличения распространенности AD и других нейродегенеративных заболеваний, связанных с агрегацией тау, в популяции, крайне важно разработать более эффективные способы лечения и диагностики.

Ссылка на цветные фигуры

Файл заявки содержит, по меньшей мере, одну фотографию, выполненную в цвете. Копии данной публикации патентной заявки с цветными фотографиями предоставляются Управлением после запроса и оплаты необходимой пошлины.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показаны аминокислотные последовательности N-конца (A) и С-конца (B) человеческого белка тау (htau).

На фиг.2 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.1 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.3 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.2 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.4 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.3 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.5 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.4 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.6 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.5 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.7 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.7 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.8 приведены графики, демонстрирующие KD HJ8.8 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.9 приведены графики, демонстрирующие KD HJ9.1 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.10 приведены графики, демонстрирующие KD HJ9.2 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.11 приведены графики, демонстрирующие KD HJ9.3 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.12 приведены графики, демонстрирующие KD HJ9.4 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.13 приведены графики, демонстрирующие KD HJ9.5 против человеческого белка тау (А) и мышиного белка тау (B).

На фиг.14 приведены результаты иммуноблоттинга, демонстрирующие присутствие полноразмерного тау у мышей ISF дикого типа и P301S tg. (А) Лизаты гиппокампа мышей Tau KO (KO), дикого типа (WT) и Р301S tg (P301S tg) анализируют методом иммуноблоттинга с использованием антитела ВТ-2 против тау или антитела против актина. Тринадцать мкг белка загружают в лунку. Четыре полосы, соответствующие эндогенному мышиному тау, и одну полосу, соответствующую человеческому тау, обозначены белыми кружками и черными кружками, соответственно. Существует также полоса 39 кДа, соответствующая форме человеческого белка тау в лизате гиппокампа P301S tg. Такая форма может представлять собой продукт деградации тау. ISF тау мышей дикого типа (WT) и P301S tg (P301S tg) подвергают иммунопреципитации с использованием моноклональных антител против тау HJ9.3 (В) или HJ8.1 (С) и анализируют методом иммуноблоттинга. Полосы визуализируют с помощью биотинилированного антитела ВТ-2. Серые и черные стрелки обозначают эндогенный мышиный тау и человеческий тау, соответственно.

На фиг.15 (А) приведено схематическое изображение разных мутантных конструкций тау, используемых в данном исследовании, и на фиг.15 (B-D) приведены изображения, демонстрирующие, что белки Tau RD образуют фибриллярные агрегаты в трансфицированных клетках НЕК293. (A) В зависимости от схемы эксперимента, каждая форма мутантного тау несет на карбокси-конце маркер, представляющий собой голубой или желтый флуоресцентный белок (CFP или YFP), либо гемагглютинин (HA). (В) Анализ методом атомно-силовой микроскопии (AFM) SDS-нерастворимого вещества из клеток НЕК293, временно трансфицированных разными формами RD, показывает, что RD(ΔK)-HA и RD(LM)-HA продуцируют видимые фибриллярные частицы. Фибриллы не детектируются в устойчивых к агрегации RD(PP)-HA (n=2). Масштабная метка, 1 мкм. (С) Клетки НЕК293, временно трансфицированные различными формами RD-YFP и одним YFP, окрашивают X-34, амилоид-специфичным красителем. Включения, образованные RD(WT)-YFP, RD(ΔK)-YFP и RD(LM)-YFP, визуализируются с помощью конфокальной микроскопии и окрашиваются X-34. X-34-положительные клетки не обнаружены при экспрессии только YFP или RD(PP)-YFP. Стрелки указывают включения, окрашенные X-34. (n=3) (D) Нетрансфицированные клетки (NT) и разные формы RD-YFP/CFP трансфицируют в клетки HEK293 с последующей экстракцией тритоном/SDS и анализом методом вестерн-блоттинга с использованием антитела против участка RD. Обнаружены как мономеры, так и элементы с более высокой молекулярной массой. (S=растворимый белок, Р=осажденный нерастворимый белок). Процедуру повторяют три раза с получением одинаковых результатов.

На фиг.16 показаны агрегаты тау RD в клетках НЕК293, детектированные методом FRET. Чтобы количественно определить внутриклеточную агрегацию белка RD методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), разные мутанты RD (wt, ΔΚ, PP, LM), слитые с YFP и CFP, совместно трансфицируют в клетки HEK293. (А). Клетки НЕК293, совместно трансфицированные RD(LM)-CFP/YFP, обследуют и количественно определяют внутриклеточное образование агрегатов с использованием микроскопии с фотообесцвечиванием акцептора для FRET. Донорный сигнал до (Pre) и после (Post) фотообесцвечивания акцептора подтверждает, что включения RD(LM)-CFP/YFP продуцируют среднюю эффективность FRET 18,2%±0,058 SD (n=6). На верхних и нижних панелях изображены акцепторные и донорные каналы, соответственно, до и после фотообесцвечивания. В правом верхнем углу изображена тепловая карта рассчитанной эффективности FRET. Масштабная метка гистограммы показывает расчетную эффективность FRET на попиксельной основе. Эффективность FRET для агрегата тау RD составляет ~34% в данной ячейке. (В). Используя FPR, определяют относительный FRET для разных конструкций. В случае RD(PP)-CFP/YFP значимый уровень FRET не наблюдается. Но как RD(ΔK)-CFP/YFP, так и RD(LM)-CFP/YFP, продуцируют интенсивный сигнал FRET (n=3). (С). Клетки НЕК293, экспрессирующие RD(ΔK)-CFP/YFP, подвергают воздействию фибрилл RD(ΔK)-CFP/YFP в различных концентрациях (мономерные эквиваленты 0,01, 0,03, 0,1 и 0,3 мкΜ) в течение 9 ч. Внеклеточные фибриллы RD(wt)-HA в дозозависимой манере индуцируют агрегацию RD(ΔK)-CFP/YFP (n=3). (* обозначает р<0,05, ** обозначает р<0,001, планки погрешностей соответствуют SEM).

На фиг.17 приведены изображения и графики, демонстрирующие перенос агрегатов тау-RD между клетками и индукцию последующей агрегации. (А). Клетки НЕК293, трансфицированные RD(ΔK)-YFP, совместно культивируют в течение 48 ч с эквивалентным числом клеток, экспрессирующих RD(LM)-HA. Клетки фиксируют 4% параформальдегидом и окрашивают иммунофлюоресцентной меткой/X-34. В ряде клеток наблюдается совместная локализация RD(LM)-HA и RD(ΔK)-YFP во включениях. Эти включения также окрашиваются X-34, что свидетельствует о наличии бета-складчатой структуры (закрашенные стрелки). Кроме того, некоторые включения RD(LM)-HA окрашиваются X-34, но совместная локализация с включениями RD(ΔK)-YFP отсутствует (незакрашенные стрелки). (В). Две популяции клеток, одна из которых экспрессирует RD(ΔK)-CFP/YFP, и другая - RD(LM)-HA, совместно культивируют в течение 48 ч. В качестве контроля используют RD(PP)-HA или нетрансфицированные клетки, NT. FRET увеличивается в результате совместного культивирования с RD(LM)-HA, но не с RD(PP)-HA или клетками, трансфицированными суррогатом (n=3). (С). Чтобы анализировать гибель клеток, индуцированную агрегатами тау, как механизм высвобождения тау, клетки НЕК293 трансфицируют в течение 48 ч RD-HA (PP, ΔΚ или LM) или суррогатом. Трансфицированные суррогатом клетки обрабатывают различными концентрациями стауроспорина (1, 2, 4, 20 мкМ) в течение 30 минут при 37°С, чтобы индуцировать гибель клеток. Затем клетки подвергают воздействию пропидиййодида, 5 мкг/мл, и измеряют флуоресценцию с помощью планшет-ридера. Признаки гибели клеток в разных трансфицированных популяциях отсутствуют. (** обозначает р<0,001, планки погрешностей соответствуют SEM).

На фиг.18 приведены изображения и графики, демонстрирующие, что агрегаты RD способствуют передаче неправильного сворачивания от клетки к клетке. Клетки НЕК293 совместно трансфицируют разными конструкциями RD-CFP и RD-HA. Спустя 15 ч трансфицированные клетки культивируют совместно с клетками, экспрессирующими RD(ΔK)-YFP или RD(PP)-YFP, в течение 48 ч. (A) Для определения, происходит ли совместная агрегация в результате непосредственного контакта белков, проводят микроскопическое исследование FRET. Сигнал CFP измеряют до и после фотообесцвечивания YFP. Агрегаты RD(LM)-CFP и RD(LM)-YFP характеризуются средней эффективностью FRET 14,2%±0,053 SD (n=11), свидетельствующей о том, что RD(LM)-CFP и RD(LM)-YFP находятся в непосредственном контакте. Верхние и нижние панели изображают акцепторные и донорные каналы, соответственно, до (Pre) и после (Post) фотообесцвечивания. Типичная тепловая карта рассчитанной эффективности FRET приведена в правом верхнем углу. Гистограмма демонстрирует расчетную эффективность FRET на попиксельной основе. Эффективность FRET для агрегата тау RD составляет ~25% в данной ячейке. Отрицательные значения генерируются неспаренными CFP. (В) Сигнал FRET наблюдается, если клетки, экспрессирующие RD(ΔK)-CFP/RD-HA, культивируют совместно с клетками, экспрессирующими RD(ΔK)-YFP. Этот сигнал увеличивается, если агрегация RD(ΔK)-CFP индуцируется в результате совместной экспрессии склонных к агрегации форм тау, как ΔΚ, так и мутантов LM. RD-CFP или RD-YFP, содержащие мутацию PP, блокирующую образование β-складчатой структуры (n=3), не генерируют какого-либо значащего сигнала. (С) Чтобы подтвердить увеличение неправильной укладки, популяции клеток, экспрессирующих один CFP или RD(LM)-CFP, в течение 48 ч подвергают предварительному воздействию клеток, экспрессирующих RD-HA, содержащий одну из мутаций PP, ΔΚ или LM, чтобы инициировать неправильную укладку в разной степени. Затем указанные совместно культивируемые популяции делят на части и совместно культивируют в течение 48 ч с клетками, экспрессирующими RD(ΔΚ)-YFP, чтобы определить степень агрегации на основе переноса между клетками и FRET. Предварительное воздействие клеток RD(LM)-HA на клеточную популяцию RD(ΔΚ)-CFP индуцирует сигнал FRET, в 2,6 раза превышающий сигнал, индуцированный в результате предварительного воздействия на RD(PP)-HA. Введение клеток, экспрессирующих чистый CFP, во вторую популяцию клеток полностью блокирует влияние предварительного воздействия на склонных к агрегации мутантов RD-HA (n=3). (* указывает, что значение р<0,05, ** указывает, что значение р<0,001, планки погрешностей соответствуют SEM).

На фиг.19 приведены графики и результаты иммуноблоттинга, демонстрирующие распространение агрегатов тау через внеклеточную среду. (A) Клетки НЕК293, трансфицированные RD(LM)-HA, совместно культивируют в течение 48 ч с эквивалентным количеством клеток RD(ΔΚ)-CFP/YFP и затем проводят анализ FRET. Увеличение объема клеточной культуральной среды приводит к снижению эффективности трансклеточного перемещения агрегатов. (B) Перенос кондиционированной среды от клеток, экспрессирующих RD(LM)-HA, к клеткам, экспрессирующим RD(ΔΚ)-CFP/YFP, является достаточным для того, чтобы индуцировать агрегацию на 60%. (C) Добавление в среду антитела HJ9.3 приводит к уменьшению FRET, а также препятствует распространению агрегации. (D) Неспецифическое IgG не оказывает какого-либо влияния на распространение. (E) HJ9.3 не оказывает влияния на внутриклеточную агрегацию RD(ΔΚ)-CFP/YFP, совместно экспрессированного в той же клетке. (F) HJ9.3 блокирует эффект RD(LM)-HA, связанный с индукцией RD(ΔΚ)-YFP при совместном культивировании клеток, что определяют путем фракционирования в присутствии детергента и методом вестерн-блоттинга. (Т=общий белок, S=растворимый белок и Р=осадок нерастворимого белка). (G) Количественный анализ трех независимых исследований методом вестерн-блоттинга демонстрирует ~60% уменьшение фракции осадка после воздействия HJ9.3 по сравнению с общей фракцией. (H) Клетки, экспрессирующие RD(LM)-YFP и mCherry, совместно культивируют и анализируют методом проточной цитометрии. HJ9.3 уменьшает процент двойных положительных клеток от 2,07% до 1,31%. Клетки, смешанные непосредственно перед цитометрией, используют в качестве фонового контроля (* обозначает p<0,05, ** обозначает р<0,001, планки погрешностей соответствуют SEM).

На фиг.20 приведены изображения клеток НЕК293, трансфицированных RD(ΔΚ)-YFP (верхние панели) или суррогатом (нижние панели). HJ9.3 добавляют к культуральной среде и инкубируют в течение 48 ч. В конце эксперимента клетки фиксируют, пермеабилизируют и окрашивают вторичным антителом против мышиных антител (меченным Alexa 546). Локализацию комплексов HJ9.3/тау определяют методом конфокальной микроскопии. В верхних панелях показано, что многие комплексы детектируются при экспрессии RDΔ(K)-YFP, и в отсутствии указанной экспрессии комплексы не наблюдаются (нижние панели). Ортогональные анализы (правая панель) показывают, что комплексы в большинстве своем присутствуют на поверхности клетки, хотя иногда наблюдаются внутриклеточные комплексы.

На фиг.21 приведены изображения и график, демонстрирующие, что фибриллы тау опосредуют распространение от клетки к клетке. (А) Кондиционированную среду собирают из трансфицированных клеточных популяций, совместно культивированных с HJ9.3 или контрольным антителом IgG (1:1000) в течение 0 ч или 48 ч, и затем анализируют методом иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. HJ9.3, в отличие от IgG, специфически улавливает частицы тау RD из клеточной среды. Агрегированные частицы высшего порядка присутствуют при экспрессии RD(ΔK)-YFP или RD(LM)-YFP, но не RD(PP)-YFP. (В) Количественный анализ результатов трех независимых исследований методом вестерн-блоттинга свидетельствует о ~10-кратном увеличении тау после 48 ч инкубации. (C) Клетки подвергают воздействию HJ9.3 в течение разных периодов времени. (D) Комплексы антитело/антиген, выделенные из среды, подвергшейся в течение 48 ч воздействию HJ9.3, помещают на чипы AFM и визуализируют. В среде клеток, экспрессирующих RD(ΔK)-HA и RD(LM)-HA, наблюдаются фибриллярные частицы, тогда как RD(PP)-HA продуцирует только аморфные агрегаты. Масштабная метка, 1 мкм.

На фиг.22 изображены схема и графики, демонстрирующие активность HJ8.5 и HJ9.4 в отношении рекомбинантного человеческого белка тау. (А) Схема, иллюстрирующая совместное культивирование клеток RD(LM)-CFP и RD(ΔK280)-YFP в присутствии и в отсутствии разных моноклональных полноразмерных антител против тау. (B) График, демонстрирующий, что HJ8.5, HJ9.3 и HJ9.4 способны блокировать распространение тау. (C) График, демонстрирующий, что HJ8.5, HJ9.3 и HJ9.4 можно использовать для детекции фибрилл RD-tau методом ELISA.

На фиг.23 приведена схема, иллюстрирующая экспериментальный план (A) интрацеребровентрикулярной инъекции и (B) имплантации осмотического насоса в боковой желудочек каждой мыши. (С) Изображение, подтверждающее размещение канюли путем окрашивания крезиловым фиолетовым.

На фиг.24 приведены изображения антител против тау после инфузии в течение 6 недель мышам P301S tg, полученных путем (A) окрашивания кумасси синим и (B) иммуноблоттинга против рекомбинантной самой длинной изоформы человеческого белка тау hTau40 с использованием антител, поступающих из насоса, до и после 6 недель инфузии.

На фиг.25 изображен график, показывающий отсутствие перекрестного взаимодействия вливаемых антител против тау в анализе общего тау методом HJ8.7-BT2B ELISA. Перед применением в методе ELISA антитела в указанных концентрациях предварительно инкубируют с рекомбинантным человеческим белком тау.

На фиг.26 приведены изображения коронарных срезов пириформной коры мышей P301S tg в возрасте 9 месяцев, получавших среду/PBS (верхние панели) или разные моноклональные антитела против тау (HJ8.5, HJ9.3, как указано в нижних панелях). Срезы окрашивают биотинилированным антителом AT8, которое распознает аномально фосфорилированную форму тау.

На фиг.27 приведены графики, демонстрирующие процент площади, покрытой нейрофибриллярными клубками, окрашенными AT8, в (А) гиппокампе CA2 и СА3, (В) миндалинах, (С) пириформной коре и (D) энторинальной коре.

На фиг.28 приведены графики, демонстрирующие детекцию фибрилл тау и мономера RD-tau методом ELISA с использованием антитела HJ9.3. Мономеры и фибриллы RD-wt tau в различных концентрациях помещают в планшет для ELISA. HJ9.3 используют в качестве первичного антитела. Для детекции используют антитела против мышиных антител, связанные с HRP.

На фиг.29 приведена схематическая иллюстрация трансклеточного распространения агрегации тау, происходящего посредством переноса фибрилл в клеточную среду. Белковый агрегат, присутствующий в донорной клетке, выходит из нее (А), поступает в клетку-реципиент (B) и непосредственно контактирует с белком, имеющим природную укладку (С), увеличивая неправильно уложенное состояние (D). Такое перемещение между клетками опосредуется фибриллами, которые высвобождаются непосредственно в среду. Данные фибриллы могут улавливаться в межклеточном пространстве антителом против тау (HJ9.3), что препятствует распространению между клетками (E).

Фиг.30. Характеристика антител против тау методами поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и иммуноблоттинга. На фигуре изображены сенсограммы SPR, демонстрирующие связывание каждого антитела против тау с иммобилизованным рекомбинантным человеческим тау (самые длинные изоформы hTau40, 441 а.к.) и иммобилизованным мышиным тау (самые длинные изоформы mTau40, 432 а.к.). Каждое антитело используют в различных концентрациях (0,11, 0,23, 0,46, 0,90, 1,8, 3,7, 7,5 мкг/мл), и графики выделяют соответствующим цветом. (А) Сенсограммы SPR для связывания антитела HJ9.3 с иммобилизованным человеческим тау и иммобилизованным мышиным тау (B). (С) Сенсограммы SPR для связывания антитела HJ9.4 с иммобилизованным человеческим тау и иммобилизованным мышиным тау (D). Сенсограммы SPR для связывания антитела HJ8.5 с иммобилизованным (E) человеческим и (F) мышиным тау. (G) Растворимые фракции RAB мышей в возрасте 3 месяцев с нокаутом тау (KO), в возрасте 3 месяцев дикого типа (WT), в возрасте 3 месяцев Р301S (3mo) и в возрасте 9 месяцев Р301S (9mo) анализируют методом иммуноблоттинга с использованием указанных антител против тау.

Фиг.31. Сенсограммы SPR, иллюстрирующие взаимодействие антител против тау с иммобилизованными фибриллами человеческого белка тау. Сенсограммы SPR иллюстрируют взаимодействие антител против тау HJ9.3 (A), HJ9.4 (В) и HJ8.5 (С), использованных в различных концентрациях, и иммобилизованных фибрилл человеческого белка тау.

Фиг.32. Характеристика антител против тау в разных анализах. Иммуноокрашивание срезов головного мозга мышей в возрасте 3 месяцев с нокаутом тау (KO), в возрасте 3 месяцев дикого типа (WT), в возрасте 3 месяцев Р301S (3mo) и в возрасте 12 месяцев Р301S (12mo) из участка пириформной коры и лобной коры ткани, пораженной болезнью Альцгеймера (AD), проводят путем окрашивания биотинилированным антителом HJ8.5. Вставка в микрофотографию среза мыши P301S в возрасте 12 месяцев демонстрирует окрашивание тела клетки помимо диффузного окрашивания нейропиля. Черная стрелка указывает увеличение площади. Вставка в микрофотографию коры головного мозга человека с AD демонстрирует окрашивание нейрофибриллярных клубков (NFT) при большем увеличении. Черная стрелка указывает увеличение площади. Масштабная метка 250 мкм в панели с tau KO, изображения получены с таким же увеличением. Масштабная метка 50 мкм во вставках P301S 12mo и AD.

Фиг.33. Антитела против тау блокируют поглощение и затравочную активность агрегатов P301S tau, детектируемую методом FRET. Клетки НЕК293, экспрессирующие RD(ΔK280)-CFP/YFP, инкубируют с 2,5 мкг общего белка лизатов мозга 1×TBS в течение 24 ч. (A) Лизаты мозга мышей P301S в возрасте 12 месяцев вызывают гораздо большую затравочную активность (n=5), чем лизаты мышей с нокаутом (KO) (n=7), мышей дикого типа (WT) (n=6) или молодых мышей P301S в возрасте 3 месяцев (n=2) (****p<0,0001). (B) Клетки НЕК293 совместно трансфицируют с RD(ΔK280)-CFP и RD(ΔK280)-YFP. Через 18 ч к клеткам добавляют лизаты мозга Р301S, предварительно инкубированные в отсутствии или в присутствии антител против тау (HJ8.5, HJ9.3 и HJ9.4) или контрольного антитела (антитело HJ3.4 против Αβ). Все антитела против тау, инкубированные с лизатами головного мозга P301S, по существу блокируют затравочную активность. Статистическую значимость определяют с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным множественным сравнением Даннета с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0 (***p>0,001). (С) Титрование указанных антител в различных концентрациях (0,125 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 2 мкг/мл) проводят в присутствии фиксированного количества лизатов головного мозга Р301S. Через 24 часа проводят анализ методом FRET. Из всех использованных антител против тау HJ8.5 наиболее эффективно блокирует поглощение и затравочную активность лизатов головного мозга P301S. Статистическую значимость определяют с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным множественным сравнением Бонферрони. (**p<0,0001, *p<0,01, результаты приведены в виде среднего значения±SEM).

Фиг.34. Поглощение клетками антител против тау, связанных с агрегатами P301S Tau, не обнаружено. Лизаты мозга P301S инкубируют с клетками НЕК293 в течение 3 ч. Чтобы детектировать тау, используют все 3 разных антитела против тау или контрольное антитело (антитело HJ3.4 против Αβ), с последующим окрашиванием антителами против мышиных IgG, меченных Alexa-fluor546. Кроме того, P301S лизаты мозга предварительно инкубируют в отсутствии и в присутствии 3-х разных антител против тау и антитела HJ3.4, после чего их добавляют к клеткам НЕК293, фиксируют и пермеабилизируют. Alexa-fluor546-меченые антитела против мышиных IgG используют для идентификации интернализованных антител. Для окрашивания ядра используют 4',6'-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; показан синим цветом).

Фиг.35. Экспериментальная схема ICV инфузии антител и эффективность антитела в другом способе лечения. (А) Экспериментальный план инфузии антител или среды (PBS) путем интрацеребровентрикулярной инъекции в левый боковой желудочек головного мозга. (B) Показательное окрашивание крезиловым фиолетовым коронарных срезов участка мозга, чтобы подтвердить размещение имплантированного хирургическим способом зонда в левом боковом желудочке. В данном исследовании используют мышей с правильным размещением зонда в левом боковом желудочке.

Фиг.36. Антитела против тау сильно уменьшают окрашивание AT8 в мозге мыши P301S. Показательные коронарные срезы мышей P301S в возрасте 9 месяцев, обработанных PBS (A), антителом HJ3.4 (B), антителом HJ8.5 (C), антителом HJ9.3 (D) и антителом HJ9.4 (E), окрашенные биотинилированным антителом AT8, в участках, включающих пириформную кору и миндалину. Масштабная метка 250 мкм. Вставки в А-Е показывают окрашивание фосфорилированного тау биотинилированным антителом AT8 с более высоким увеличением, масштабная метка 50 мкм.

Фиг.37. Некоторые антитела против тау сильно уменьшают AT8-окрашивание мозга мышей P301S. Процент площади, покрытой аномально фосфорилированным тау, окрашенным биотинилированным AT8, в пириформной коре (А), энторинальной коре (B), миндалине (C) и участке гиппокампа СА1 (D) мышей Р301S в возрасте 9 месяцев, получавших антитела против тау HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15), HJ9.4 (N=13), антитело против Αβ, HJ3.4 (N=8) или PBS (N=16). Окрашивание AT8 в нескольких разных отделах головного мозга у мышей, получавших антитела против тау, ниже, чем у мышей, получавших PBS или антитело HJ3.4. HJ8.5 оказывает наибольшее воздействие. **p<0,01, *p<0,05, результаты приведены в виде среднего значения±SEM.

Фиг.38. Количественное определение окрашивания биотинилированным антителом AT8 у самцов и самок мышей Р301S. Процент площади, покрытой аномально фосфорилированным тау, окрашенным биотинилированным AT8, в пириформной коре (А и Е), энторинальной коре (B и F), миндалине (С и G) и участке гиппокампа CA1 (D и H) у самцов (А) и самок (B) мышей Р301S, получавших антитела против тау (HJ8.5, HJ9.3 и HJ9.4), контрольное антитело (HJ3.4) и PBS.

Фиг.39. Некоторые антитела против тау сильно уменьшают ThioS-окрашивание нейрофибриллярных клубков в головном мозге мышей Р301S. (A) Показательные изображения ThioS-окрашивания нейрофибриллярных клубков в пириформной коре мышей Р301S в возрасте 9 месяцев, получавших в течение 3 месяцев PBS и антитела HJ3.4, HJ8.5, HJ9.3 и HJ9.4. У мышей, получавших антитело HJ8.5, ThioS-окрашивание нейрофибриллярных клубков уменьшается по сравнению с мышами, получавшими PBS или антитело HJ3.4. Масштабная метка соответствует 100 мкм. (B) Полуколичественный анализ окрашивания ThioS с использованием оценок от 1 (отсутствие окрашивания) до 5 (максимальное окрашивание) проводят у всех мышей, получавших антитела против тау, и контрольных мышей. У мышей, получавших антитело HJ8.5, ThioS-окрашивание значительно уменьшается по сравнению с мышами, получавшими PBS или антитела HJ3.4. *p<0,05, **p<0,01.

Фиг.40. Корреляция между окрашиванием фосфорилированного тау и окрашиванием активированных клеток микроглии. (A) Окрашивание фосфорилированного тау биотинилированным AT8 у мышей Р301S в возрасте 9-месяцев, получавших HJ8.5 (N=6), HJ9.3 (N=6) и PBS (N=6 в каждой группе) в значительной степени коррелирует с PHF1-окрашиванием другого антитела против фосфорилированного тау. (B) Наблюдается значительная корреляция между CD68-окрашиванием активированных клеток микроглии и окрашиванием фосфорилированного тау биотинилированным AT8 во всех группах (n=6 в каждой группе) (C) Иммуноблоттинг типичных образцов фракции 70% FA (N=4) проводят с использованием поликлональных мышиных антител против тау (Abcam).

Фиг.41. CD68-окрашивание активированных клеток микроглии. Активацию микроглии анализируют у мышей Р301S. Типичные изображения CD68-окрашенных активированных клеток микроглии в пириформной коре 9-месячных мышей Р301S, получавших PBS (A), антитело HJ3.4 (B), антитело HJ8.5 (С), антитело HJ9.3 (D) и антитело HJ9.4 (Е).

Фиг.42. Уровень нерастворимого тау у мышей Р301S уменьшается в результате воздействия антител HJ8.5 и HJ9.3. Кору головного мозга всех обработанных мышей [получавших PBS (N=16) или антитела HJ3.4 (N=8), HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15), HJ9.4 (N=13)] последовательно экстрагируют RAB (A), RIPA (В) и 70% FA (С), после чего количественно определяют уровень тау с использованием метода ELISA. Среди разных групп отсутствуют статистические различия в уровнях растворимого тау во фракциях RAB и RIPA. Однако наблюдается значительное снижение уровня нерастворимого тау во фракциях 70% FA, полученных от мышей, получавших антитела против тау HJ8.5 и HJ9.3, по сравнению с группами, получавшими PBS или антитело HJ3.4. Уровень нерастворимого тау у мышей, получавших антитело HJ9.4, не отличается от уровня, наблюдающегося у контрольных групп (**p<0,01). Уровни человеческого белка тау (D), мышиного белка тау (E) и тау, фосфорилированного по Ser202 и Thr205 (F), определяют во фракциях 70% FA с использованием специфических антител против человеческого белка тау, против мышиного белка тау или против фосфорилированного тау методом ELISA (N=6 мышей на группу). Наблюдается снижение уровня человеческого белка тау у всех групп мышей, получавших антитела против тау, и изменения уровня мышиного белка тау отсутствуют. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, путем детекции активности AT8, что во фракциях 70% FA уровень тау, фосфорилированного по Ser202 и Thr205, уменьшается у мышей, получавших антитела против тау по сравнению с контрольной группой, подобно уровню общего человеческого белка тау.

Фиг.43. У мышей Р301S, получавших антитело против тау, с помощью анализа FRET обнаруживают уменьшение затравочной активности тау в экстрактах коры головного мозга. (А) Затравочную активность тау измеряют с использованием растворимых фракций RAB, полученных от всех мышей, обработанных PBS (N=16), HJ3.4 (N=8), HJ8.5 (N=13), HJ9.3 (N=15) и HJ9.4 (N=13), на клетках HEK293 методом FRET. Клетки HEK293 совместно трансфицируют RD(ΔK280)-CFP и RD(ΔK280)-YFP. Через 18 ч к клеткам добавляют растворимые фракции RAB. У мышей, получавших антитела HJ8.5 и HJ9.3, затравочная активность гораздо ниже, чем у мышей, получавших PBS или HJ3.4. В растворимых фракциях RAB, полученных от мышей, обработанных антителом HJ9.4, не наблюдается снижение затравочной активности по сравнению с растворимыми фракциями RAB, полученными от мышей, обработанных PBS или антителом HJ3.4 (***p<0,001, результаты приведены в виде среднего значения±SEM). (B) Растворимые фракции RAB, полученные от мышей с нокаутом тау, обработанных PBS или антителом против тау, подвергают иммунопреципитации. Элюирование затравочной активности из комплексов антитело/гранулы измеряют методом FRET. У мышей, получавших HJ8.5 и HJ9.3, затравочная активность гораздо меньше, чем у мышей, получавших PBS (****р<0,0001, результаты приведены в виде среднего значения±SEM). (C) Результаты ELISA-анализа фракций 70% FA, полученных из участков коры головного мозга 9-месячных мышей Р301S всех экспериментальных групп, в значительной степени коррелируют с результатами анализа растворимых фракций RAB методом FRET. (D) Сравнивают уровни тау (X-ось) и затравочную активность (Y-ось) в растворимых фракциях RAB коры головного мозга всех мышей Р301S в возрасте 9 месяцев. Значимая корреляция между 2 указанными параметрами отсутствует. (E) Частицы тау, присутствующие в растворимых фракциях RAB, полученных от мышей с нокаутом в возрасте 3 месяцев (KO), мышей дикого типа в возрасте 3 месяцев (WT), мышей Р301S в возрасте 3 месяцев и мышей Р301S в возрасте 9 месяцев, получавших PBS, разделяют методом SDD-AGE с последующим анализом методом вестерн-блоттинга. Для детекции частиц тау используют поликлональные мышиные антитела против тау. Высокомолекулярные частицы присутствуют в растворимой фракции RAB и у мышей Р301S в возрасте 3 месяцев, и, в больших количествах, у мышей Р301S в возрасте 9 месяцев.

Фиг.44. Результаты тестирования условно-рефлекторной реакции на страх демонстрируют, что среди групп отсутствуют значимые различия в двигательной активности, сенсомоторных реакциях или компонентах слухового ориентира. Результаты rmANOVA не позволяют выявить значимые основные или интеракционные эффекты лечения, включающие влияние на общую способность к передвижению в тесте с использованием платформы с отверстиями (A), в тесте с прохождением мыши по рейке (B), или на любой другой показатель сенсомоторных реакций (не показано), или на способность удерживаться на вращающемся барабане (С). Данные, полученные в результате изменения базовых условий на 3-й день тестирования условно-рефлекторной реакции страха, демонстрируют наличие значимого эффекта лечения (*р=0,027), причем последующие сравнения показывают, что большая часть этого эффекта обусловлена значительными различиями между мышами, получавшими HJ9.4, и контрольной группой, получавшей PBS+HJ3.4 (р=0,0007). (D). Однако каких-либо существенных основных или интеракционных эффектов лечения не было обнаружено после анализа rmANOVA результатов тестирования слухового ориентира (мин 3-10), позволяя предположить, что уровни замирания существенно не различаются среди групп в течение указанного времени (E). Для определения, может ли уровень активности оказывать влияние на состояние замирания в процессе тестирования ситуативного страха на 2-й день, авторы рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (r) между общей способностью к передвижению, измеренной с помощью теста на платформе с отверстиями, и % времени, проведенного в состоянии замирания во время тестирования ситуативного страха, и обнаружили, что достоверная корреляция отсутствует (р=0,39) (F).

Фиг.45. Дефицит условно-рефлекторной реакции на ситуативный страх у трансгенных мышей Р301S tau уменьшается в результате введения антител HJ8.5 и HJ9.4. (A) В 1 день тестирования условно-рефлекторной реакции на страх различие в уровне замирания среди групп не наблюдается ни во время 2-минутного исходного состояния, ни во время испытания звук/шок (T/S), о чем свидетельствует отсутствие значимых основных или интеракционных эффектов, связанных с введением антител, определяемое путем анализа полученных результатов методом rmANOVA. (B) И наоборот, значимый эффект введения антител (*р=0,019) и значимый эффект поминутного взаимодействия (**р=0,0001) определяют с помощью анализа rmANOVA результатов по уровням замирания, полученным на 2 день тестирования условно-рефлекторной реакции на страх. Только в группе, получавшей HJ9.4, наблюдается значительное привыкание от 1 до 8 минуты (#р=0,002). (C) Последующие запланированные сравнения демонстрируют, что замирание в группах, получавших антитела против тау HJ8.5 и HJ9.4, значительно увеличивается по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS+HJ3.4, при усреднении значений, полученных в течение 8-минутного сеанса (**р=0,006 и *р=0,022, соответственно). Однако дальнейший анализ полученных данных свидетельствует о том, что наибольшее различие между группой, получавшей HJ9.4, и контрольной группой, получавшей PBS+HJ3.4, наблюдается в течение 2 минуты (†p=0,004), тогда как наибольшее различие между группой, получавшей HJ8.5, и контрольной группой наблюдается в течение 4-7 минут (††р<0,004), как изображено в "B".

На фиг.46 приведен график, демонстрирующий анализ тау методом сэндвич-ELISA, который можно использовать для различения образцов плазмы, положительных по затравочной активности, и образцов плазмы, отрицательных по затравочной активности. Затравочную активность определяют по способу, описанному Kfoury et al 2012 J Biol Chem 287(23). Количество агрегатов тау приводят в виде относительного связанного с изменением укладки возбуждения по сравнению с сигналом, полученным из плазмы здоровых молодых людей (т.е. фоновым сигналом анализа).

На фиг.47 приведены графики, демонстрирующие влияние антител настоящего изобретения против тау на распространение тау в клетке. В каждом графике первый столбец представляет среду без добавления антител, то есть, соответствует о фоновой эффективности распространения. (A) HJ8.1 и HJ8.2; (B) HJ8.3 и HJ8.4; (C) HJ8.5 и HJ8.7; (D) HJ8.8 и HJ9.1; (E) HJ9.2 и HJ9.3; (F) HJ9.4 и HJ9.5.

На фиг.48 приведен график, представляющий результаты клеточного анализа, демонстрирующие влияние отдельных антител против тау или эквимолярных смесей антител против тау на распространение тау.

На фиг.49 в разделе (А) приведен график, демонстрирующий, что антитело HJ9.3 не оказывает влияния на внутриклеточную агрегацию тау при одновременной экспрессии RD(ΔK)-CFP/YFP в той же клетке, и в разделе (В) приведен график, демонстрирующий, что неспецифический IgG не влияет на чресклеточное распространение агрегации тау.

На фиг.50 приведен график, демонстрирующий, что HJ9.3 ингибирует поглощение агрегатов тау по данным метода проточной цитометрии. Клетки подвергают воздействию рекомбинантных фибрилл RD, меченных флуоресцентным красителем химическим способом. После обработки трипсином и диспергирования клетки считают с использованием проточного цитометра. HJ9.3 дозозависимо уменьшает число клеток, несущих флуоресцентную метку, что указывает на ингибирование поглощения агрегатов.

Подробное описание изобретения

Общеизвестной минимальной связью между болезнью Альцгеймера и всеми видами таупатии является агрегированное состояние тау. При всех указанных болезненных состояниях мономерный тау, как известно, превращается в полимерные упорядоченные фибриллы. Нейрофибриллярные клубки (NFT), которые состоят из агрегатов фибриллярного тау, являются нейропатологическим признаком таупатии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что распространение тау-патологии в головном мозге может вызываться формой агрегата тау, которая высвобождается из "донорной" клетки и поступает во вторую "реципиентную" клетку, индуцируя дальнейшую неправильную укладку и агрегацию тау в реципиентной клетке путем непосредственного белок-белкового контакта. Специфическую форму агрегата тау, которая обеспечивает такое распространение агрегатов тау от клетки к клетке, называют "затравкой тау", и ее активность в настоящем описании называют "затравочной активностью", так как данная форма агре