Оатентйо- -t, *" тьзсййческля ' емблеотека
Патент 269821
Авторы
Классы МПК
Оатентйо- -t, *" тьзсййческля ' емблеотека
Иллюстрации
Реферат
269821
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ
6оюз Советских
Социалистических
Республик
Зависимый от патента №
Заявлено 28.VI.1968 (№ 1250334/30-15) Кл. 301т, 6
Приоритет ЗО.VI.1967 и 20.XI I.1967 (¹ 9324/67, № 17886/67, Швейцария) МПК С 21d
Комитет по делам изобретении и открытий при Совете Министров
СССР
Опубликовано 17.IV.1970. Бюллетень М 15
Дата опубликования описания 13Х111.1970
УДК 615.779.9:631.937 (088.8) Авторы изобретения
Иностранцы
Ганс Цэнер и Вальтер Келлер (Швейцария) Иностранная фирма
«Циба А Г» (Швейцария) 1й .. . т1с
П ПАТЕНТНО"пхичжаи "
ВМВЛИОТЕКМ
Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ГРУППЫ
ВЕНТУРИЦИДИ НА
Изобретение относится к спосооам получения антибиотиков сельскохозяйственного назначения, преимущественно антибиотиков, применяемых для защиты возделываемых растений от фитопатогенных грибов.
Известен способ получения антибиотика вентурнцидина A (АА368), при осуществлении которого в качестве гриба-продуцента берут штаммы N.Ñ.I.Â. 9198, Х.С.1.В. 9199 и М.С.1.В.
9200 Streptomyces aureofaciens.
Предлагается способ получения антибиотиков вентурицидина В и (или) вентурицидина
Х, при котором в качестве гриба-продуцента берут штамм S. aureofaciens ХКК1 3399 (National Regional Research Laboratory
USDA).
Штамм хранится также под названием Тй
342 в лабораториях фирмы-заявителя, а также депонирован в Микробиологическом институте при университете в Тюбингене (Швейцария).
Штамм выделяют из образца почвы, взятого в окрестностях Козусса (Гвинея). По видовым признакам (см. Hutter et al. Arch. f. Мйrobiel, 39, 173 (1961) ) он принадлежит к виду
S. aureofaciens Duggar, 1948.
Основные характерные признаки штамма
ИККI 3399: споры эллипсоидной формы, размером (0,6—
0,9) Х (0,8 — 1,4) лк, с гладкой поверхностью; воздушный мпцелий вначале беловатого цвета, позднее — от коричнево-серого до золоти5 сто-серого; цепочки спор разветвлсны моноподиально в форме открытых, свободных спиралей в -1 — -6 витков; на питательной среде. содержащей пептон.
10 меланиновидный пигмент не появляется.
Оптимальная температура роста для штамма колеблется от 33 до 37"С, в то время как у других представителей вида S. aurcofacic»s она колеблется от 27 до 30 С.
15 Помимо антибиотиков вентурицидина Х В вид S. апгео1ас1еп продуцирует известный антибиотик вентурицидин (антибиотик АА 368. см. DAS 1184458), который в дальнейшем будет называться «вентурицидином А». Анти20 биотики могут быть разделены, например, распределением по Craigy и (илп) хроматографией на селикагеле. Возможно также вентурицидин А перевести в вентурицидин В.
Способ получения антибиотиков вентурици25 дина X и (или) В заключается в следующем.
Культуру S. aureofaciens МКК1 3399, дающую вентурицидин Х и (или) вентурицидин В, выращивают в аэробных условиях в водном
269821 растворе, содержащем источники углерода и азота, а также неорганические соли, пока раствор не покажет существенного антибиотического действия. Затем выделяют вентурицидин
Х и (или) В и по желанию полученный также вентурицидин А переводят в вентурицидин В.
Полученные антибиотики можно перевести в их производные.
В качестве источников углерода и азота можно использовать глюкозу, сахарозу, фруктозу, крахмал, маннит и аминокислоты, например глицин, пептиды, протеины и их продукты расщепления, например пептон или триптон, мясные экстракты, водную вытяжку из зерна (кукуруза, пшеница), дистилляционные остатки при получении алкоголя, дрожжи, семена (особенно растений рапса, сои и хлопчатника), аммониевые соли и нитраты. Из неорганических солей питательный раствор может содержать хлориды, карбонаты, сульфаты, нитраты, фосфаты щелочных и щелочноземельных металлов, магния, цинка, марганца и железа.
Культуру ведут в аэробных условиях при взбалтывании илн перемешивании с воздухом или кислородом в специальных сосудах или ферментатерах. Более всего подходит температура 27 — 37 С. Культуральная жидкость показывает существенное антибактериальное действие в среднем через 24 час.
Культивируют преимущественно в несколько стадий: сначала готовят жидкую питательную среду, которую затем инокулируют. Сначала, например, переинокулируют споровый мицелий, полученный после двухнедельного выращивания на твердной питательной среде, в жидкую питательную среду и дают ему расти еще 48 час. Антибиотики из культурного фильтрата выделяют известными способами с учетом их химических, физических и биологических свойств.
Для проверки действия антибиотиков в отдельных стадиях изолирования, а также и в культурной среде очень хорошим тест-организмом является Botrytis cinerea. Гифы этого микроорганизма морфологически сильно изменяются под действием антибиотиков (сильное разветвление, начиная от определенной точки, так что возникают метелкообразные формы).
Этот тест проводят, например, в виде диффузии на пластинках следующим образом.
В середине солодоагаровых пластинок в кругообразную площадь диаметром 5 мм инокулируют В. cinerea, и эти пластинки подвергают в течение двух-трех дней инкубации при
24 С. За это время мицелий развивается до
20 — 30 мм. Раствор контролируемого вещества наносят посредством фильтровых кружков диаметром 6 мм на расстоянии приблизительно 5 лм от края мицелия. После этого пластинки подвергают инкубации в течение 24—
36 час при температуре 24 С. В активных растворах наблюдается морфологическое измеяение на расстоянии до 24 мм от фильтровых
4 кружков. Растворы концентрацией 10 мкг/лил антибиотиков дают еще заметно измененные гифы.
Антибиотик вентурицидин Х не является гликозидом, в отличие от вентурицидинов А и В, которые являются гликозидами 2-дезокси-D-рамнозы (вентурицидин В) или соответственно 3-о-карбаминил-2-дезокси-D-рамнозы (вентурицидин А). Он не содержит са1р хара и не является идентичным также с агликоном вентурицидина А и В (CasHsoOs)- Вентурицидин Х до сих пор получали не в виде кристаллического вещества, а в виде однородного аморфного порошка при тонкослойной
I5 хроматографии. Это жирорастворимое, нейтральное, бесцветное вещество, растворимое, между прочим, в метаноле, этаноле, ацетоне, этилацетате, хлороформе и метиленхлориде.
Элементарный анализ, о . С 66,35; Н 9,18;
О 24,90.
Мол. в. (осмометрический метод на основании паров в метиленхлориде) равен 701. Эти данные соответствуют брутто-формуле
СззН640 (мол. в. 709; С 66,07 "/о, .Н 9,10 /о, 25 О 24,83 /о) и СззН640 0 (мол. в. 692; С 67,60 /о, Н 9,31 /о, 0 23,09 /О). (a)576 — 61,5 (с= lо/о в хлороформе) .
1К вЂ” спектр в бромистом калие показывает ленты при 3480, 2965, 2942, 2875, 1702, 1643, 1452, 1382, 1300 (плечо), 1279, 1232, 1222, 1184, 1169 (плечо), 1129, 1095, 1052, 984, 910, 880, 870, 850, 780, 752, 718 см 4 (см. фиг. 1). NMRспектр в дейтерохлороформе, 60 NC, изображен на фиг. 2.
Ультрафиолетовый спектр в чистом спирте указывает следующие максимальные данные л=220 нл (lege=4,47; плечо); 7=226 нм (legs=4,50); л.=232 5 нлмк (lege=4,47); 1=241 нм (iege=4,25); 7= са. 295 нм (lege=2,53, 4Р
При тонкослойном хроматографировании на селикагеле (агент текучести этилацетат) значение Rf равно 0,80, т. е. на много выше, чем у вентурицидинов А и В (вентурицидин А
45 0,49; в е нтур и циди н В 0,41) .
При гидрировании вентурицидина Х на угле палладия в метаноле поглощается приблизительно 2 моль водорода. Тетрагидровентурицидин Х образует бесцветные кристаллы с т. пл. 156 — 157 С. Элементарный анализ, /о.
С 67,39; 67,11; Н 9,91; 9,89; мол. в. 765 (оомометрический метод при использовании паров в этилацетате). Этим данным соответствует брутто-формула СзНзsOÄ, (вычислено С 67,21 /о, Н 9,84 /о, мол. в. 697). Вероятная брутто-фор. мула вентурицидина Х СззН540щ.
Вращение тетрагидропроизводного (а) 576
48,5 (с=0,968 в хлороформе). бр Ультрафиолетовый спектр в чистом спирте показывает максимальные значения при л=212 нм (lege=2,88) и л=275 нм (legs=
2,20), Инфракрасный спектр показывает в броми65 стом калие ленты при: 3510, 3465, 3400 (пле269821
=55
Н Н
Н СН3
1а
Пг мимо этой диеновой системы имеется еще одна неконъюгпрованная кетогруппа (плечо 6О при приблизительно 295 нл в ультрафиолетовом спектре вентурицидина Х и при приблизительно 275 нл в гидрпрованпом продукте). Из
ИМЯ-спектров выводят примерно 10 метиловых групп, которые говорят о наличии угле- 65
5 чо), 2960, 2940, 2875, 1732, 1708, 1697, 1625, 1457, 1411, 1395, 1381, 1370, 1339, 1270, 1242, 1225, 1215, 1190, 1170 (плечо), 1133, 1089, 1052 (плечо), 1029, 1011, 989, 933, 908, 882, 849, 839, 808, 796, 773, 746, 729, 695, 593, сл 1 5 (см. фиг. 3). NMR-спектр в CDCI3 тетрап1дровентурицидина Х.показан на фиг. 4.
Вентурицидин Х и его тетрагидропроизводное возможно ацилировать обыкновенным способом, например, при помощи галогенидов 1о кислот и особенно галогенангидридов, например, таких алифатических, аралифатических, ароматических или гстсроциклических карбоновых кислот (особенно низших жирных кислот), как уксусная кислота. 15
При ацетилировании тетрагидровентурицпдина Х получают производное ацетилена в виде бесцветного масла. Инфракрасный спектр этого соединения в дейтерохлороформе показан на фиг. 5. го
1R-спектр в хлороформе показывает ленты при 3460, 1733, 1705 (плечо), 1457 и 1370 ал
NMD-спектр в СРС13 показывает сигналы прп
6=2,02 ррт (s, ЗН); 2,08 ррт (s, са. 9Н). (Здесь и далсе сокращение ррт обозпачастс» г5 ч/1 млн) .
При кислом метанолпзе получают приолизптельно пять продуктов реакции, из которы.: три хроматографически в чистой форме в виде бесцветных масел. Метилгликозиды при этом зги не получаются. ММК-спектры продуктов показывают ОСНз-сигналы, которые могут возникнуть из метанолиза одного из лактоновых колец. На наличие (макроциклического) лактонового кольца указывает также соответствую- 55 щий — COO — СН =группе сигнал б 5,0 ррт, который встречается в негидрированном и гидрированном вентурицидине Х. 1 ри остальных сигнала в этой области, которые показывает только негидрированпый продукт, при- 4О надлежат к агомам водорода в местах двойной связи. Сингулет при 6 2,5 ррт (фиг. 2) должен находится в С-метиловой группе, так как этот сигнал отсутствует в спектре гидрированного продукта тоже. В связи с ультрафио- 45 летовым спектром, который соответствует одному конъюгировапному дпену, можно считать одну из частичных формул 1 а и 1 о частью структуры
50 б родного скелета, похожего на классические макролиды эрптномпцинового типа.
Для вснтурицпдина А предлагается формула С!3Н-,iiNO!2. Структура соединения не выяспена. В связи с исследованием нового антибиотика вентурпцидпна В выяснены структуры частичных фрагментов вентурпцпдина В. Для вентурицпдина В из анализов выводится формула С. 2Н;ООгь Таким образом, вентурицидин
В на COiNH меньше вентурицпдина А. На основании инфракрасного спектра (фиг. 6 и 8) можно предполагать, что вентурпцпдин Л является сложным эфиром карбаминовой кислоты вентурпцидпна В, так как максимум при
1605 c,è 1 у вентурицидина В отсутствует. Это подтверждается также и тем, что вентурицидпн В дает трп-о-ацетилпроизводное, в то время как вентурицидин Л лишь ди-о-ацетилпроизводное. Это предположение подтверждено получением из вентурицидпна Л и В по одному сахарообразпому продукту расщепления
II выяснением их взаимоотношения и построения. Бентурпцпдпн Л при метанолизе с кислотным катализатором при мягких условиях с1;сдп прочего дает кристаллический метилгликозид СЗН,-NÎ.- (1). Посредством гидролиза с гидроокисью бария отщеплена карбамоиловая группа и получен метилгликозид С-,Ны04 (I I ) д идезокси гсксозы.
Из IN>LI<-спектра для метилгликозида
СЗН,ЗХ03- выводят следующее построение
ОСН3 I-I
СН3
Н
ХН3
При этом распределение отдельных сигналов поддерж11вастся расцеплением спина (см. пример 1). Сигнал при б 4,86 ррт относится к протону в третьей позиции. Его химическое смещение соответствует смещению водорода около ацилоксигруппы. К атому водорода Н-4 до.зжсп быть отнесен сигнал прн «I 3,21 ррп1.
Прп С-4, таким образом, должна быть свободная гпдрокснльная группа, в то время как карбамоиловый остаток у С-3. Сигнал Н-1 (б 4,73 ррьч) двойной доблет с малой постоянной сцепления J!,, „=3,8 cps и J!,,2, = l,a cps. Отсюда выводят, с одной стороны, экваториальное
=положение Н-1, с другой стороны, — позицию
2 СН2-группы, которая также вытекает нз расцепления спина. Постоянные сцепления 2а, 3 = 11,5 cps, 13,4 =9 cps и J4,5 =-9 cps доказывают осевое положение атомов водорода прп С-З, С-4 и С-5. Дублет при Ь 1,33 для одной СН3 — СН-группы показывает, что соединение — б-дезоксисахар. Продукт расщепления из вснтурицидина Л, таким образом, является 3-о-карбамоли-2-дезоксирамнозой. Гидролнзом с гидроокисью бария получают метилгликозит ññ-метил-2-дезокси-D-рамнозид
С Н 40 построения
Н
СН
ОН
II: К=СНз
III: R Н
То же соединение получают при метанолизе вентурицидина В. 20
При гидролизе Il получают свободный сахар
Ш, который показывает в воде оптическое вращение (а) р + 19,9 (окончательная величина через 90 мин), Агликон вентурицидина А и В в чистом ви- 25 де еще не получен. На основании тонкослойнохроматографической реакции и NMR-спектров предполагают, что оба антибиотика содержат одинаковый агликон.
Вентурицидин В и вентурицидин Х облада- Ç0 ют хорошим антимикробным, в частности фитопатогенным, действием, более эффективным, чем у вентурицидина А.
В табл. 1 дан спектр действия вентурицидина А, В и Х в разных концентрациях на раз- 55 личные грибы на диффузионных пластинах (диаметр пропитанных раствором антибиотиков фильтровых кружков 6 мм). Цифры в скобках означают неполное торможение, черточки — эксперимент не был проведен. 40
Табл. 1 указывает также, что антибиотики при проверенных максимальных концентрациях (10 мг/мл) ) не действуют на Saccharomyces cerevisiae. Это имеет значение для применения вентурицидина Х и (или) В в каче- 45 стве фунгицидов в виноградниках. Остатки органических фунгицидов, применяемых в виноградниках, в урожае исчисляются в 10 ppm.
Однако количество, равное 3 — 5 рот, уже тормозит брожение (Vegeler u. Geelanener, 7eitschr. fu> Obst- und Keinbau, 103, 494 — 504, 1967).
Так как граница действия вентурицидина Х и В на дрожжи лежит намного выше, рекомендуется применять их в качестве фунгицидов в 55 виноградниках.
При борьбе с фитопатогенными гирами, например Aspergillus niger, Alternaria tennis, Botrytis cinerea, Cercospora melonis, РЫуте1la Lycopersici, Fusarium nivale, Glemerella сш- 60
gulata, Helminthosporium avenae usf. и др., антибиотики можно применять в виде жидких средств (растворы, взвеси или эмульсии), или в твердой форме (грануляты, порошкообразНые и распыляемые средства). Для получения 65 непосредственно легкораспыляемых растворов антибиотиков берут, например, фракции минеральных масел от высокого до среднего диапазона кипения: дизельное масло или керосин, масло каменноугольной смолы и растительные или животные масла, а также углеводороды, такие как алкилированные нафталины, тетрагидронафталин, в некоторых случаях при употреблении смесей ксилолов циклогексанолов, кетонов, далее хлорированные углеводороды, как трихлорэтан и тетрахлорэтан, трихлорэтилен или тритетрахлорбензол. Успешно используют органические растворители с т. кип. выше 100 С.
Водные формы антибиотиков готовят из эмульсионных концентратов, паст или смачивающихся порошков. В качестве эмульгаторов и дисперсионных средств употребляются нейоногенные продукты, например продукты конденсации алифатических спиртов, аминов или карбоновых кислот, с длинноцепочечным остатком CI с 10 — 20 атомами углерода с окисью этилена, продукт конденсации октадецилалкоголя и 25 — 30 моль окиси этилена, или продукт конденсации жирной кислоты сои и
30 мо гь окиси этилена, или продукт конденсации технического олеиламина и 15 моль окиси этилена, или продукт конденсации додецилмеркаптана и 12 моль окиси этилена. Из анионактивных эмульгаторов, которые можно употреблять, следует упомянуть натриевую соль додецилового сложного эфира серной кислоты, натриевую соль додецилового сложного эфира бензолсульфоновой кислоты, калиевую или триэтаноламиновую соль олеиновой или абиетиновой кислоты, или смесей этих кислот, или натриевую соль петролсульфонной кислоты. В качестве катионактивных диспер сионных средств можно употреблять четвертичные аммонийные соединения, например цетилпиридинийбромид или диоксиэтилбензилдодециаламмониумхлорид.
Для изготовления порошков и распыляемых средств в качестве твердной основы могут быть использованы тальк, каолин, бентонит, углекислый кальций, фосфорнокислый кальций, а также уголь, пробочная мелочь, древесная мука и другие вещества растительного происхождения. Прспараты изготовляют и в виде грануляторов, Добавлением веществ, улучшающих прилипаемость, стойкость к смыванию, распределяемость и внедряемость в другую среду, можно расширить сферу применения препаратов. Добавлять можно жирные кислоты, смолу, клей, казеин или альгинаты.
П р и м ер 1. 300 мл питательного раствора, содержащего 20 г соевой муки (с полным содержанием жиров) и 20 г маннита на 1 л, вели пшу рН которого перед стерилизацией доводят раствором гидроокиси калия до 7,5, заливают в колбу Эрленмейера, стерилизуют, охлаждают и инокулируют бактериальной культурой S. aureofaciens ХКК1 3399. Затем суспензию инкубируют при 27 С, непрерывно взбалтывая на машине. Через примерно 48 час при
0,1
Грибы
26982! диаметр зоны торможения мг/.ыл
Таблица 1 концентрациях
0,01
Mucor TQ !8! mucede
Mucor Tii 284 miehei
12 (8) 20
14
Yeratinemyces Tii 534
А,В,Х
Испытание по HQtter et al. Arch. Mikrobiol., ! (!965).
Mucor Тй 285 parvisporus
Zygorhynchus Tii $1oe1leri !90
Trichophyton TQ 297 menthagraphytum
Trichophyton Tii 298 rubrum
Paecilomyces TQ varioti !37
Byssochlamys TQ nivea 27!
Aspergillus Тй !55 terreus
Endothia Tii !63 parasitica
Cordyceps Tu 255 militacris
Verticillium Тй соссогшп 264!.eptosphaerulina oryzae Tii 28!
Botrytis Tii !57+++ cineiea
Beauveria TQ 253 bassiana
Penicillium Tii 287 аче!!апешп
Pseudogymnoascus Tii 293
Saccharomyces cci evisiae
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В
А
В х
А
В
А
В
А
В
А, В
Х (8)
11,5
10,5
14
25 (7,5) 8
18 (9)
12 (10)
25 (11)
27 (17)
22
33 (11) 17 (15) (19) 26 (14)
19
31 (9) (14)
31
39
11
22
9
14
22 (10) (14) 21
Ь, (8) (10)
9,5
23 (7)
17 (8)
12 (11)
20 (10)
12
26 (16)
16
24 (11) 16 (12) (15) 21 (10)
14
28 (11) (12) 19
24
32
40 (11) 15
20 (10) (12) 19 (8) (8) (12) 8
14,5
12 (7) (7) (10)
14 (14)
15 (11) (20) (10) (12) 12 (8) 8
17 (11) (12) 9
24
32
31 (12) (11)
8 (9)
12 (8) (10)
22
29
26 (9) (8)
269821
12 культуру переносят в соотношении 1: 10 в питательный раствор того же состава, залитый в ферментационное устройство. Инкубирование проводят снова при 27 С и интенсивном продувании воздуха в течение 24 час. Для контроля активности культур на всех этапах работы проводят тест на В. cinerea.
S. aureofaciens М1хК1 3399 выращивают по описанному способу в питательном растворе, содержащем 20 г солодового экстракта (содержание твердых веществ примерно 50 >), 20 г сухой кукурузной барды (Disii llers
solubles), 5 г хлористого натрия и 1 г азотнокислого натрия на 1 л.
S. aureofaciens МР1х1 3399 выращивают но описанному способу в питательном растворе, содержащем 20 г сухой кукурузной барды, 20 г лактозы, 5 г хлористого натрия и 1 г азотнокислого натрия на 1 л.
S. aureolaciens NRRL 3399 выращивают по описанному способу в питательном растворс, содержащем 10 г глюкозы, 5 г пептона, 3 г мясного экстракта, 5 г хлористого натрия и
10 г углекислого кальция на 1 л. Величину рН устанавливают до стерилизации гидроокнсью калия до 7 2.
Когда культура начнет проявлять сильное антибактериальное действие, ее охлаждают и фильтруют под давлением с добавлением вещества, облегчающего фильтрацию, например
Hyfle — Supercel. Фильтрат экстрагируют дважды при том же значении рН (примерно 7,5—
7,8) половинным количеством этилацетята; при этом вещества, действующие как антибиотики, переходят в этилацетат. Значительные количества антибиотика находятся также в остатке на фильтре. Они извлекаются оттуда многократным экстр агированисм .метанолом.
Метанольные вытяжки выпаривают до небольшого объема в вакууме, разбавляют водой и затем многократно экстрягируloT эти.чацетатом. После выпаривания этилацетатных экстрактов из фильтрата культуры н остатков на фильтре получают нз 100 л культурного раствора маслянистый остаток в количестве
80 — 100 г.
40 г этого остатка предварительно очищают посредством распределения по Craig у по 190 ступеням. Применяемая при этом cucTeма растворителей содержит на 4,25 л четыреххлористого углерода 0.75 л хлороформа, 4 л метанола и 1 л воды. Вентурицидин А, В и Х накопляется в ступенях 75 — 130 (максимально в ступени 100). Эти фракции объединяют и выпаривают досуха в вакууме. Получают 25 г бледно-желтого порошка. 21 г этого вещества распределяют с той же системой растворителей по 600 ступеням. Вентурицидин находится в ступенях 265 — 396. Выпариванием в вакууме из ступеней 265 †3 получают 5,1 г вентурицидина В и Х, из ступеней 309 †3 — 5,4 г вентурицидина В и ХХА, а из ступеней 329—
396 — 10,1 г вентурицидина А и Х. Вещества дают в тонкослойной хроматограмме на селикягеле 2",4 (готовые плитки фирмы Мерк) с
65 этиляцетатом в качестве агента текучести следующие значения Rf (пятна проявлены опрыскиванием концентрированной серной кислотой и нагреванием до 140 С): вентурицидин А
0,49; вентурицидин В 0,41; вентурицидин Х
0,80. Трп с»еси веществ хроматографируют на колонках селикагеля фирмы Мерк. Из остатка от выпаривания фракции 329 — 396 при хроматогряфировании на 250 г ссликагеля (Мерк) и элюирования 1,5 л смеси хлороформа и этилацстатя (1:!) получают 1,85 г вентурицидина .", в виде желтоватого аморфного порошка с хс.ряктернстнками, указанными в общей части
-. и пса пня.
Вслед за тем ocraroi< фракции 329 — 396 элюируют 1 л этилацетата. При этом кристаллизацией нз хлороформэфира получают 5,27 г вентурицидина Л в виде бесцветных кристаллов с т. пл, 140 — 142 С, (и)23 119 (концентрация 0,5 в хлорофор»e). Спектр IR к Квг (на фиг. 6). Спектр КЧК (60 МНг) в CDCh на фиг. 7.
П р и» с р 2. 3 г вентурицидина Х гидрируют в 150 ял метанола с 750 яг 1000/О-ного палладия на угле в атмосфере водорода. Через
2 час гндрирование прекращается. Поглощено
237 лл водорода (20 С, 725 .ял рт. ст.), что соответствует примерно 2 лоль. Катализатор отфильтровывают, раствор выпаривают и остаток хроматографируют на 30 г селикагеля.
Этнлацетатом элюируют 2,56 г тетрагидропроизводного вентурицидина Х в виде бесцветного вещества, кристаллизующегося при смагивянии эфиром. Свойства соединения указаны в общей части описания.
Пример 3. 100 яг тетрагидровентурицидиня Х подвергают реакции с 2 ял ангидрида уксусной кислоты и 2 лл пиридипа в течение
6 lac при комнатной температуре. Затем раст »ор вываривают насухо. Хроматографированием на силикагеле (10 г) со смесью хлорофop»a с этилацетатом (4: 1) в качестве элюционного средства получают 84 мг бесцветного масла. Свойства этого продукта ацетилирования тетрагидровснтурицидипа Х указаны в общей части описания.
Пример 4. 4,31 г остатка от выпаривания фракции 265 — 308 примера 1 хроматографируют па 350 г сслнкагсля. Смесью хлороформа и этилацетага (1: 1) элюируют 1,76 г вентурицидина Х. Элюируя этилацетатом, получают 1,23 г хроматографически однородного вс нтурицидина В. Псреосаждением из смеси этилацетата с петролейным эфиром по.чучают вещество е виде бесцветного порошка с т. пл.
145 — 149-"C; (и) Я + 100 (концентрация 0,847 в хлороформе). Спектр IR в бромистом калие на фиг. 8, спектр 1Х14IR в СРС1з на фиг. 9.
Вычислено, О/О. С 67,16; Н 9,40; мол. в 751;
С., Н-,„О;,.
Найдено, ",о. С 66,86; Н 9,29; мол. в 733.
Молок лярный вес определяют осмометрически но давлению в метиленхлориде.
П р и м ер 5. 200 яг вентурицидина В ацетилируют ангидридом уксусной кислоты спо269821
13
Таблица 2
Защитное действие, о„
Концентрация, О
Испытуемое вещество опрыскивание поверхности поглащение через стебель
13
82
41
0,01
0,001
0,0001
Вентурнцидии В
0,3
67,4
OKcHxлорид меди (эталон)
Контроль (без обработки) собом, описанным в примере 1 для вентурицидина А. Сырой три-о-ацетилвентурициднн В очищают хроматографией на селикагеле и элюируют этилацетатом. Получают аморфный бесцветный порошок с т. пл. 150 — 152 С.
Спектр NMR в СВС!а показывает между прочим сигналы при 6=1,99 ррт (s,ЗН); 2,01ppm (s, ЗН) и 2,02 ppm (s, ЗН).
Вычислено, %. С 65,73; Н 8,73;
С48НтаОы, Найдено, %. .С 65,92; Н 8,54.
Пример 6. 100 нг вентурицидина Х растворяют в 1 мл этилцеллосольва, содержащем
10 /а тритон Х=100, и доливают дистиллированной водой до 1 л. Раствором опрыскивают виноградные лозы, например, для борьбы с инфекцией В. cinerea.
Участки опытного виноградника после опрыскивания суспензией второй генерации серой гнили четырехкратно опрыскивают вышеуказанным раствором через промежутки времени в 14 дней. При сравнении с контрольными
Пример 8. Готовят 0,1%-ный водный раствор вентурицидина Х, которым профилактически один раз опрыскивают выращенные в теплице растения риса. Через два дня после опрыскивания растения инфицируют суспензией конидий Poricularia огугаl и через семь дней осматривают для установления степени поражения грибками. По сравнеиню с контрольными растениями, не подвергавшимися опрыскиванию, растения поражаются грибками лишь на 15%.
Предмет из обретения
1. Способ получения антибиотиков группы вентурицидина на основе культуры грибапродуцента Streptornyces aureofaciens Duggar, включающий культивирование гриба на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, преимущественно в аэробных условиях глубинным методом, с возможным переводом антибиотиков в их производные, отличающийся тем, что, с целью получения вентурицидина В и (или) участками, не подвергавшимися действию раствора, установлено хорошее действие раствора против В. cinerca.
Пример 7. 11спытуемый раствр бплогически активного вещества готовят растворением
10с)а вснтУРицидлна В в этилцеллосольве, содержащем 10,а тритона X=100, и разбавленном дпстиллированной водой до требуемой концентрации.
10 Молодые листья примерно одинаковой величины саженцев лозы сорта «рислинг сильваггер» опрыскивают испытуемым раствором и раскладывают для просушки. Другую партию листьев кладут на 48 час в раствор активного
15 вещества. Обработанные таким образом листья инфицируют водной суспензией конидий
В. сгпегеа и инкубируют прп комнатной температуре во вла>кноп камере. По истечении четырех суток на глаз определяют поверхность
20 листа, изменившую окраску вследствие инфекц;ш возбудителем. Результаты приведены в табл. 2, причем в качестве эталона взят 50 оный препарат оксихлорида меди. вентуршгидина Х, в качестве гриба-продуцента берут штамм S. aureofaciens МЯКИН 3399
45 (National Regiona! Research Laboratory
USDA).
2. Способ по п. 1, отличающггйся тем, что антибиотики экстрагируют органическим растворителем или смесью растворителей, предпоч50 тительно этилацетатом и (или) метанолом.
3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что антибиотики подвергают очистки и (или) разделению распределением по принципу противотока, преимущественно распределением
55 по Graig у в системе растворителей, содержащей четыреххлористый углерод, хлороформ, метанол, воду.
4. Способ по пп. 1 и 2, от.гичающггися тем, что антибиотики разделяют посредством хро60 матографии, предпочтительно на селикагеле.
5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что антибиотики подвергают пгдрированию.
6. Способ по пп. 1 — 5, отлачающаггоя тем, что антибиотики или продукты их гидрирова65 ния подвергают анилпрованию.
269821
16
15 20 25
25 М 3 35 м 5
1ОО
6 7 б 9 10 гп
1000 - щ
2000
3000 юпо v
Фиг. 1
П РРМ(6) гЗ Я 3 35 S 00 000 c 500 Юп
Фиг 3
3000
2000 попу
7. Способ по пп. 1 — 6, отличающийся тем, нто вентурицидин Х переводят в его тетрагидропроизводное, . вп о оп ю о бо ио ф го
8. Способ по пп. 1 — 7, отличающийся тем, ято вентурицидин Х или продукт его гидрирования ацетилируют, мм
6 7 д 9 10 5 2П
269821
ОРРМ9/ ч(клн
80 70 80 50 ОО 50 гб 10
Фиг 5
М/1
15 20
2.5 Л 3 35 ((5
8 7 8 8 (О
100
0 Цб
„О:
20 (500
2000
1000
500 М. (, спи
ООПП
Чбба И фиг Б
80 70 БО 50 ((О:П 70 !б 0 РРМ((;.
Ф (г ((Ч)млн
269821
70 60 50 0 30 ДУ 10 0 РРМ(6)
Фиг 7 Ч)млн
15 20 25 5 i: 5
55 7
Б 7 д 9 10 з . I=
1500
1000 (000 g 2000
Ф г.g
70 60 50 40 30 20 10 0 PPM
Фа а. 9 v/млн
Состанп fp..Ib М. Дранишников
Техред А. А, Камышникова Корректор T. Лаврухина
Редактор E. Поздняк
Заказ 2i631iб Тираж 480 Подписное
ЦИИИПИ Комитета по делам изобретешш и открытий прп Совете Министров СССР
Москва, К-85, Раушская аб., д. 4(5
Типография, пр. Сапунова, 2 ъС3
В. ю 1
500 900 с«