Патентно-техн^^нескаябиблиотека

Патентно-техн^^нескаябиблиотека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е 287650

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сеюз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента ¹

Заявлено 12.Х1.1968 (№ 1283268/30-15)

Приоритет 14.V.1968, N 16443 А 68. Италия

Кл. 53g, 4/04

МПК А 23k 1/175

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 19.XI,1970. Бюллетень № 35

УДК 631:244.6(088.8) Дата опубликования описан .я 21.1.1971

Авторы изобретения

Иностранцы

Джиованни Франчески (Италия) и Арпад Грейн (Авст

Иностранная фирма

«Сосиета Фармасеутики» (Италия) СЕСОЮЗНАЯ

Ц js g- (ЯЩЩД

БИБЛИОТЕКА

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОРЕНИЕРАТЕНА И ЕГО 3-ОКСИИ З,З-ДИОКСИПРОИЗВОДНЪ|Х

Изобретение относится к способаAf получения химических соединений, в особенности и способам получения соединений с использованием бактериальных культур.

Известен способ получения изорегп ератеиа и его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводных с помощью химического синтеза. Однако известный способ довольно сложен и, следовательно,требует больших затрат.

С целью упрощения технологического процесса предлагается получать изорениератен и

его 3-окси- и 3,3-диоксипроизводные биологическим путем с использованием культуры гриба Streptomyces mediolani (штамм 2215/74 1. .i. из Коллекции штаммов Фермиталия). Штамм также депонирован в Институте фитопатологии при Миланском университете под № 1.РХ. 1952 и в Международном микологическом институте под ¹ 1.М.1. 134886.

Ниже дано описание мор фологически« и культурных признаков этого гриба.

А. Вид под микроскопом

На простой культуральной среде вегетативный мицелий в виде более или менее тонких гифов толщиной 0,4 — 0,9 мкл с многочисленными длинными разветвлениями, которые образуют более крупные гифы толщиной 1—

1,3 мкм, длинные и переплетенные. Из этих гифов моноподиально ответвляются гифы, образующие споры или спорофоры, которые сильно или слегка вьются, длинные, образованные малыми цепочками спор, которые вначале связаны, затем свободны. Споры гладкие, чаще кубической формы, иногда также цилиндрической и округлой формы. Под микроскопом они выглядят в виде «арактерны«кубиков размером (0,9 — 1,1) X (0,9 — 1,1) икль

Б. Микроскопический вид

В табл. 1 приведены культуральиые свойства на среда.;, в которы«S. птейо1ап1 выращивался при 28 С, причем наблюдения были проведены иа З-й, 8-й, 15-й и 20-й дни после инот5 куляции

Гриб проявляет быстрьш обильный рост с образованием компактного твердого вегетативного мицелия в виде ровной пагины, окрашенной в цвета от яично-желгого до оранжево-желтого. Воздушиьш мицелий, также обильный на всей культуральиой среде, довольно с«ож по виду с «лопком, окрашен в цвета от ванильно-желтого до гвоздично-желтого. Значительных различий между грибами, выросшими на синтетической и оргаиичес ой средах, не обнаруживается.

В. Био«имические свойства

Протеолиз желатины — реакция положительная. Превращение нитратов в шггриты — реак28765Î

Таблица !

Возушный мицелий

Вегетативный мицелий

Рост

Среда

Обильный хлопковидпый, ванильно-желтого цвета с бежевыми и розовыми оттенками

Обильный, хлопко видный ванпльно-желтого цвета с бежево-серыми оттенками

;у мерснный, ровный ванильно-желтого цвета

Обильный, в виде ровной патины

Яично-желтый или абрикосово-желтый с обеих сторон

Агар Беннета

Умеренный, в ниде ровной патины

От лимонно-желтого до абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Лимонно-желтого цвета с обеих сторон

Абрикосово-желтого цвета с обеих сторон

Arap Чапецкого

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, в виде слегка складчатой патины

Аспарагино-глюкозовый

Обильный, хлопковидный от розово-желтого до почти бежевого цвета

Глицерино-глициновый агар

Обильный, в виде складчатой патины

Скудный, ровный, беловатокремого цвета

Обильный, хлопковидный от гвоздично-желтого до светло-бежевого цвета

Агар с)мерсона

Апельсиново-желтого цвета с обеих сторон

Апельсиново-желтого цвета с обеих сторон

Обильный, в виде ровной патины

Крахмальный агар и соли

Обильный, в виде ровной патины

Обильный от пылевидного до хлопк о видного, гвоздичножелтого цвета со светло-бежевыми оттенками

Апельсиново-желтый с обеих сторон

Картофельный агар

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, довольно ровный, пылевидный, розово-желтый порошок

Обильный, хлоп ко видный от гвоздичного до светло-бежевого

Овсяный агар

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон

Аспар ННо-глицериновый агар

Обильный, в виде ровной патины

Оранжево-желтого цвета с обеих сторон

Обильный, в виде ровной патины

Обильный, слегка хлопковидный, от ванильно-желтого до светло-бежевого цвета

Агар глюкозо-дрожжевом экстракте

Глубокого оранжево-желтого цвета с обеих сторон

Обильный, в виде ровной латины

Крахмало-пептоповый агар

Обильный хлопковидный, от желтого до светло-бежевого цвета

Оранжево-желтый с обеих сторон

Обильный, в виде ровной патины

Агар на смеси пептона с нитратом калия

Умеренный, розовый, ванильно-желтый с гвоздичными оттенками

Светлый оранжево-желтый с обеих сторон

П р и м е ч а и и е. Растворимый пигмент отсутствует при выращивании па всех средах. ция положительная. Крахмал гндролизуе r.

Молоко не коагулирует, но пептонизирует. Меланин не образует. Тирозин разлагает. Образует нерастворимые пигменты.

Используют следующие источники углерода: глюкозу, l-арабннозу, сахарозу, d-кснлозу, dманннтол, d-фруктозу, мальтозу, рамнозу и глицерин; мезоннознтол и раффинозу не используют.

Гриб не растет при 50 С н не образует склероций. Погруженная в воду и взбитая культура образует изорениератен, 3-окснизореннератен и 3,3-днокснизорениератен.

Г, Идентификация гриба

Свойства, проявляемые грибом и описанные выше, позволяют отнести его к роду Streptomyces Waksman et Hehrici (Bergey s Маппце!

of Determinative Bacteriology, 1957, стр. 774—

775). По Fridman et al. он принадлежит к Rectus Flexibilis группа «желтых» (Арр!.

microbiol., 6, 1958, стр, 52).

Цвет вегетативного и воздушного мнцелня не позволяет отнести его к какому-либо из известных подвидов, предложенных Waksman, Baldacci et al., Cause et al., Flagi et al., ЕШпgener et al.

4б Сравнение свойств рассматриваемого гриба и известных показало, что ни один из последннх пе имеет всех тех свойств, которыми обладает рассматриваемый микроорганизм. бО Отсюда следует, что рассматриваемый микроорганизм не может быть идентифицирован с каким-либо видом, описанным в литературе, и поэтому его следует рассматривать как новый вид. Ему было дано название S. mediolani.

55 Он может быть размножен путем инокуляций на твердой среде или путем лнофилнзацин суспензии спор в молоке.

Согласно изобретению способ заключается в культпвированни S. mediolani в погруженной бО культуре, в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов, В частности, микроорганизм культивируют на жидкой культуральной среде в аэробных условиях при температуре 24 — 37 С, б5 предпочтительно при 27 С в течение 72—

287650

160 час рН можно варьировать в зависимости от среды от 6 до 8.

В качестве источника углерода могут быть использованы применявшиеся и ранее глюкоза, декстрин, крахмал, различная мука-- кукурузная, соевая, пшеничная, кукурузный настой и т. д..

Источником азота, помимо указанных вь!ше источников углерода, содержащих также азот, могут служить казеин, размолотые семена хлопчатника, соли аммония и т. д.

Минеральные соли, пригодные для приготовления каротеноидов, вносят в зависимости ог применяемой среды.

Например, могут быть применены обычно употребляемые хлориды, сульфаты или фосфаты натрия, калия, магния, цичка, меди и кобальта, карбонат кальция и др. Фермептацшо можно выполнять лабораторно в колбах пли в промышленных ферментерах различной мощности. По окончании ферментации мицелий отделяют от культурального бульона путем фильтрования или центрифугирования, а пигментные продукты выделяют путем экстрагирования соответствующим органическим растворителем, смешивающимся или несмешивающимся с водой, таким как метанол, хлороформ, ацетон или метиленхлорид. Разделение каждого продукта осуществляют с помощью >О хроматографии по известной технологии.

Продукты, полученные предлагаемым способом, были известны и ранее и пр!ьменялись в зоотехники с целью получения яиц домашней птицы с более ярким желтком. Эт!! соеди- З5 нения дают птице в виде добавки к кормам.

В данном случае может применяться мицелий, полученный в процессе ферментации, а не только чистые соединения.

Если применяют мицелий, выделенный из культурального бульона, то его высушива!от в горячем воздухе или в вакууме и затем размалывают.

Полученный таким путем порошок тщатель- 45 но перемешивают с обычными кормами. Количество пигментного продукта, добавляемое в пищевой продукт, может меняться в зависимости от нужной пигментации и в соответствии с выбранным количеством натуральных пиг- 50 ментных элементов, предпочтительно оно может составлять от 0,3 до 6 г на 1 гг кормов.

Пигментационное действие продуктов, полученных предлагаемым способом, было опреде- 55 лено по интенсивности цвета желтков, измеренной по колориметрической шкале «Roche» (MaillgIIy P. е1 al.).

Опыт был проведен на 30 курах-несушках 60 семимесячного возраста, размещенных по отдельным клеткам и разделенных на три группы по 10 штук в каждой.

Группа кур 65

Состав корма

1 Основная диета, содержащая небольшое количество общих пигментов, соответствующее 13,89 1гг на 1 кг корма.

2 Основная диета —, -обезвоженная люцерна+общие пигменты 1500 1гг на 1 гг смеси.

3 Основная диета+мицели!! с содержа!шем общих пигментов 1500 1Iг иа 1 гг смеси.

Состав основной, диеты, вес. О о: гибридная кукуруза 39,0 овес 17,6 пи!спичи!.!е отруби 12,0 соевая мука 44%-ная 15,0 мясная мука 3,0 рыбная» 3,0 концентрат дрожжей 1,00

Ill-метионин 0,1 фосфат натрия 0,7 карбонат кальция 6.30 хлорид натрия 0,3 свиной жир 1,0 фэркомплекс (фирменньш продукт) 1,0

Фэркомплекс — смесь в !таминов;! микроэлементов, имеющая состав (на 1 кг смеси), г: защищенный витамин А, м. ед 750,000

>> » Д», м. ед 150000

»» Е, и. ед. 500 витамин Вz 0,4

» B12 0,0024

» К 0,1

» P 2,5 фолиновая кислота 0,015

d — кальция паитотенат 1

dt — метиоиин 40 колшгхлорид 100 хлортетрациклингидрîx.лорид 2 иодин 0,1 марганец 7 цинк 5 гидроксиб .тиотол1 ол 10 неизвестные факторы роста до 1,000

В упомяиуть1х группах 2 п 3 обезноженную люцерну и мицелий заменили аналогичными количествами пшени и!ых отрубей. Опыт, длившийся 30 дней, был разделен на два периода: предэксиеримеитальный период (10 дней), когда кормление проводили в соответствии с основной диетой, ие содержащей люцерну: экспериментальный период (19 дней), когда кормление проводили так, как описано выше.

Во время экспериментального периода и в последующие дни была определена пигментация желтков. Результаты приведены в табл. 2.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Спорулированный слой десятидневной культуры S. mediolani, выросшей в пробирке на агаре-картофельном глюкозате при температуре 28 С, сняли и собрали в 4 1г г стерилизованной дистиллированной воды.

287650

Таблица 2

Отсист шкалы

7,00

7,46

7,06

7,80

9,14

11,88

7,30

8,45

9,99 как в призяли среду

4,5

2,25

2,35

0,5

0,35

100 лл. получили

1 лл кулькак в прп0,3

0,4

7,0

1,2

0,75

2,35

100 лл получили

1 лл кулькак в при4,0

1,0

0,5 At/i 3TOH C) CIIQH3HII IICIIOJlh3082 111 J.tl51 IIIIOK) лирования колбы, емкостью 300 .ил, содержащей 60 11л среды следующего состава, %: декстрин 4,0 казеин 1,0 карбонат кальция 0,5 сульфат аммония 0,1 бикалийфосфат 0,01 настой кукурузы 1,0 сырая вода до 100 11л

Стерилизацию проводили нагреванием в автоклаве при температуре 190 С в течение

20 11ин. После стерилизации рН среды составил 6,9. Колбу ипкубировали при 28 С в течение 26 час на роторном вибоаторе с числом оборотов 225 об/,11ин и ходом 3 с,11. 2 л1л полученной таким путем культуры использовали для ипокуляции колбы емкостью 300 лл, содер>кащей 60 лл той хке самой среды, стерилизованной так, как описано выше. Инкубацию проводили в уже описанных условиях. После

120 час ферментации получили 500 лкг пигментных продуктов на 1 лл культурального бульона.!

Минимальный Максимальный Срсдний результат

П р и и е р 2. Процесс такой же, мере 1, с той лишь разшщей, что в следующего состава, %: нерастворимый крахмал соевая мука кукурузный настой хлорид натрия карбонат кальция сырая вода до

После 120 «ас фер мента цип

600 л1кг пигментных продуктов на турального бульона.

Пример 3. Процесс такой же, мере 1, но среда имела состав, %: глюкоза мука из семян хлопчатника растворимый крахмал карбонат кальция сульфат аммония кукурузный настой сырая вода до

После 120 «ас ферменгац1ш

900 икг пигментных продуктов на турального бульона.

Пример 4. Процесс такой же, мере 1, но среда имела состав, %: растворимый крахмал казеин

65 соевая мука 3,0 мела сса 0,2 карбонат кальция 0,4 сульфат магния 0,1 сырая вода до 100 ил

После 69 «ас ферментации получили 600 л1кг пигментных продуктов на 1 11л бульона культуры.

Пример 5. Три колбы на 300 11л каждая, содержащие среду, описанную в примере 1, инокулировали 25-дневной культурой, выраженной на среде и в условиях, описанных в примере 1. Эти колбы инкубировали при температуре 28 С в условиях, описанных в примере 1. 170 11л культурального бульона, полученного таким образом, инокулировали в 3000 лиг той же самой жидкой среды, содержащейся в пятилитровом ферментере, снабженном винтовой мешалкой, переливной трубкой для указания на кипение, барботером, трубкой для ипокулпрования, трубкой для отвода воздуха и термометром.

Процесс осуществляли при температуре

28 С со скоростью аэрации 3 л/.11ин и при перемешивании со скоростью 400 об/лшн. Во время ферментации вспенивание регулировали путем добавления в малых количествах кремниевого пеногасителя.

Максимальный выход пигментных продуктов получился через 77 «ас ферментации и составил 50 11кг на 1 11л культурального бульона.

10 л культурального бульона фильтровали

2%-ным Хафле Суперцел (торговое наименование), фильтрат отделили. Мицелий суспендировали при комнатной температуре в 3 1 метанола и взбалтывали. Затем каждый раз экстрагировали 3 л смеси метанола с хлороформом (1:1) . Объединенные экстракты повторно промывали водой и выделенный хлороформенный слой высушивали чеоез сульфат натрия и выпаривали в вакууме при 35 С.

Темно-красный маслянистый осадок состоит из комплекса пигментов — пзорениератенов.

Этот осадок отбирали петролейным эфиром (300 сл1а). Вес красно-коричневой массы, отделенной фильтрованием, составил 1,5 г.

Маточные эфирные растворы концентрировали до 100 лл и хроматографнровали на колонке с нейтральной окисью алюминия сначала элюированием петролейпым эф1ром, чтобы удалить жиры, затем петролейным эфиром, содержащим 1% ацетона. Элюат пз большого верхнего слоя концентрировалп в малом объеме и выдерживали ночь в холодильнике. Выделили 400 лг пурпурно-красного кристаллического продукта с точкой плавления 200—

201" С; максимальная адсорбция в видимом спектре при следующих длинах золя (фракция А): растворитель петролейный эфир (428), 448, 479; бензол (440), 465, 495.

Путем «роматографирования через тонкий слой силикагеля было найдено: Rf=0,85 (бен287650

7 макс (425), 446, 475; (438), 463, 4оЗ. растворитель петролей;1ый эфир бензол

7„а|ам с НЛ1 растворитель петролейиый эфир бензол (425), 446, 475; (438), 463, 493.

Корректор Л. Л. Евдонов

Заказ 8939, 18 Тираж 480 Подписное

Ц1-1ИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раугпскав наб., д. 4/5

Типографии, »р. Сапунова, 2 зол) и Rf=0,38 (петролейный эфир с 1% ацетона). Эта фракция А поэтому были индентифицироваиа как изорениератен путем хроматографического и спектрографического сравнения и по точке плавления в смеси с образцo . i, приготовленным путем синтеза. Осуществляя элюирование колонки петролейным эфиром, содержащим 10 ацетона, собрали второй слой; из элюата, сконцентрированного до малого объема, получили 200 .яг кирпично-красного порошка, плавящегося при температуре

180 — 185 С, имеющего максимум адсорбц и в видимом спектре при следующих длш1ах волн (фракция В):

Путем хроматографии иа тонком слое силикагеля получили: Rf=0,47 (беизол) и Rf=0,7 (метилеихлорид). Указанная фра.акция В мало растворима в обычных органических растворителях, хотя otta растворима в спиртовом растворе карбоната натрия, окрашиваясь ири этом в ярко-красный цвет, и повторно осаждается подкислением.

При обработке указанным ангидридом в пиридиие она дает фенолацетат (ъ КВг 12,15, 17,58), нерастворимый в спиртовом растворе карбоиата натрия.

Указанная фракция была идентифицирована с 3-оксиизорениератеном путем хроматографического и спектрометрического сравнения и,ю точке плавления в смеси. Красно-коричневую массу (1,5 г), первоначально собранную из петролейного эфира, хроматографировали на колонке силикагеля и элюировали бензолом, содержащим 10% ацетона. Из большого нижнего слоя путем выпаривания растворителя и последующей обработки петролейным эфиром получили 600 п1г кирпично-красной аморфной массы, плавящейся и ри температуре 200 С (с разложением), обладающей максимальной адсорбцией в видимом спектре при следующих длинах волн (фракция С):

Путем хроматографии на тонком слое силикагеля получили: Rf=0,1 (бензол) и Rf=0,26 (метиленхлорид) .

Указанная фракция С была идентифициро15 вана с 3,3-диоксиизорениератеиом путем хроматографического и спектрографического сравнения и по точке плавления в смеси.

Предмет изобретения

20 1. Способ получения изэре101ератена и его

3-окси- и 3,3-диоксипроизводиых, отлача ощайся тем, что, с целью упрощения техиологнче ского процесса. выращивают гриб Streptomyces mediolani (штамм 2215, 74 F. 1. из Коллек25 ции штаммов Фермиталия) в аэробных условиях в жидкой культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов, и отделяют мицелий гриба, содержащий изорениератен и его 3-окси- и 3,3-диок30 сипроизводные, путем фильтрования или центрифугирования.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание гриба S. гпес11о1ап1 проводят при температуре 24 — 37 С при рН от 6 до 8 в тече35 ние 72 †1 час.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что изорениератен и его З-окси-З,Ç-диоксипроизводные экстрагируют органическим ра=творителем и очищают путем хроматографии.