Способ получения биологически активных веществ

Способ получения биологически активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е 295267

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К П АТЕНТУ

Зависимый от патента №

Заявлено 05Х.1968 (М 1237001/28-13) МПК С 124 13/06

Приоритет 15Y,1967, № 30402/67, Япония

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

i-Äl; 577 15(088.8) Опубликовано 04.11.1971. Бюллетень № 7

Дата опубликования описания 5Л .1971

Авторы изобретения

Иностранцы

Кацуиобу Танака, Казуо Осима, Казуо Кимура и Масаки Ямамото (Япония) Иностранная фирма

«Кийова Хакко Когио Ко, Лтд» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению биологически активных веществ.

Известен способ получения биологически активных веществ путем выращивания их продуцентов Hrevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимуляторов роста, например биотина.

Для большей эффективности и экономичности получения биологически активных веществ по предложенному способу в качестве продуцента используют Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 15587.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Выращивание продуцентов Brevibacterium

ketoglutamicum ATCC 15587 для получения биологически активных веществ производят в питательной среде, содер>кащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимуляторов роста, например биотина.

Процесс может протекать как в синтетической питательной среде, так и в естественной ферментативной среде, в течение всего периода времени, пока питательная среда содержит основные, необходимые для нормального роста и развития штамма микроорганизма питательktbIp вещества. которые пода1отся в питаre;Ibную среду в соответствующих количествах.

В качестве основного источника углерода в ходе протекания процесса используют газообразные углеводороды, в частности такие, как метан, этан, пропан, нормальный бутан, изобутан, пропилеп, бутилен и тому подобные соединения, а также различные смеси указанных соединений.

В ходе проведения процесса в ферментационной среде в незначительных количествах могут, кроме того, присутствовать другие источники > rëåðoäà, например жидкие углеводороды, включающие в себя парафины: иорlб мальный пентаи, нормальньш октаи, нормальный декан и углеводы (Глюкоза, фр ктоз;i, мальтоза, сахароза, крахмал, крахмальные гидролизаты, меласса и т. и.) или другие соответствующие источники углерода (глицерин, 20 маннит, сорбит, органические кислоты, глютаминовая кислота и т. п.).

Эти соединения могут использоваться как в чистом виде, так и в виде двух или более

1 помянутых соединений, при этом количество

2> этих веществ незначительно по сравиешпо с количеством газообразных углеводородов.

В качестве источника азота применяют различного типа неорганические либо органические соли или соединения, такие как мочевпиа, 30 аммиак, аммонийные соли (хлористый аммо5

З0

15

7,0

3 ний, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний, фосфат аммония и т. п.), или одну или несколько аминокислот в комбинации с натуральными соединениями, содержащими азот, кукурузный, дрожжевой, мясной экстракты, пептон, рыбную муку, казампнокислоту, рыбные растворимые продукты, экстракт рисовых отрубей, рибонуклеиновую кислоту и т. п.

Эти соединения можно употреолять как в чистом виде, так и в виде различных сочетаний.

В качестве неорганических соединений применяют сульфат магния, фосфат натрия, первичный кислый фосфорнокислый калий, вторичный фосфорнокислый калий, сульфат железа или другие соли железа, хлористый магний, хлористый кальций и т. п.

Для ускорения роста могут быть введены биотин или аминокислоты (глютаминовая или аспарагиновая).

Ферментаци1о проводят в аэробных услов.(ях, в частности при аэробном встряхивании культуры или при перемешивании погружсцпой в питательную среду культуры, при температуре в пределах 20 — 50 С и рН среды

4,0 — 9,0.

Получаемые го предлагаемому способу аминокислоты включают такие соединения, как глютамиповая кислота, валин, лизин и алании, а получаемые сахариды включают такие соединения, как глюкоза, трегалоза.

Кроме того, могут быть получены также витамины - — рпбофлавин (витамин P»), органические кислоты (лимонная кислота, аденозин5-фосфат, дифосфат аденозина и трифосфат аденозина) .

Для получения аминокислот п относящихся к классу кислот циклических соедпнений в ферментативную среду следует вводить значительные количества источника азота, и кроме того, различные антибиотики, поверхностно активные вещества, жирные кислоты, спирты.

Изобретcíèe иллюстрируется следующими примерами.

Hp.Iìåð 1.

В трехгорлой колбе емкостью 250 лл приготовляют 20 лл питательной ферментативной среды следующего состава:

N H.,NO8 2%

1х;а НРО4 12Н О 0 05%

КН РО., 0,05%

NgSO4 7Н О 0.01%

Мп804 Н О 0,001%

FeSO4 7Н О 0,001%

Мп804 7НгО 0,001%

СаС1 2Н О 0,001%

CuSO4 ° 5Н О 50 у/1

НзВОз 107/1

Na>MoO.I 2Н О 10 у/1

Экстракт кукурузный 0,1%

Значение pI-I питательной среды составляет

Затем предварительно культивированный в среде бульона ВгелЬас1ег1ппт ketoglutamicum

ATCC 15587 в условиях аэробного встряхивания инокулируется в ферментатпвной среде, после чего эту среду встряхивают при температуре 30 С с помощью термостатического смесителя. Затем в среду вводят газовую смесь нормального бутана с воздухом, при этом концентрация бутана в ней составляет предпочтительно 50% по объему. Неиспользованный бутан может быть направлен на рециркуляцию и совместно с порциями свежего бутана вво,диться в ферментативную среду.

По истечении трех дней культивирования в среду вводят 0,1 % бромида цетилтрпметиламмония, после чего проводят дальнейшее культивирование в течение четырех дней. В результате чего в ферментативной среде образуется

0,30 г/дил левовращающ и глютаминовой кислоты, 0,12 г/дил аланина, 0,05 a/äè I валина и

0,001 г/дцл лизина.

Культивирование осуществляют в пятидесяти трегорлых колбах емкостшо 250 лл и полученный в результате культивирования сироп сливают из всех колб с последующим отделением от клеточного материала микроорганизмов (что производят путем центрифугпрования) и получают полностью сброженный сироп. Затем рН среды 1 л полученного сиропа доводят до = 2,0 путем добавления соляной кислоты, обрабатывают в колонке с ионообменной смолой катионного типа Амберлит УК

120 (типа Н), после чего производят выделение индивидуальных аминокислот методом элюировация посредством последовательного повышения значений рН. После этого концентрируют сироп и получают 0,8 г аланина, 0,4 г валина и 5 лл лизина, Кроме того, выделяют

4 г сухого клеточного материала микроорганизмов.

Пример 2.

В ферментативной среде, которая используется в ходе прсведения процесса, оппсанного в примере 1, осуществляют инокулирование

ВrevibacteI ium ketoglutamicum ATCC 15587, после чего в условиях, описанных в примере 1, производится культивирование. По истечении суточного процесса культивирования в ферментативную среду вводят 50 ед/.чл пенициллина 6, и культивирование продолжают в течение б час. По завершении процесса культивирования выделяют 0,45 г/дил левовращающей глютампповой кислоты, 0,1 г/дил трегалозы и 0,001 г/дил глюкозы. Полученную 1.-глутаминовую кислоту подвергают адсорбции в колонне с ионообменной смолой, заполненной

Лмберлитом 1R-120 (Н-типа) так же, как в примере 1, с целью ее выделения. Затем 1 л вытекающей жидкости пропускают через другую колонну с ионообмепной смолой, заполненную диалоном SA-1В (типа борной кислоты), и колонну со смолой элюируют 0,005—

0,03 лол. раствором борной кислоты для фракционирования трегалозы и глюкозы, при этом получают 0,8 г кристаллов трегалозы и 5 лг кристаллов глюкозы.

295267

Предмет изобретения

Составитель 3. Салиыовская

Текред Л. Я. Левина Корректор Л. A. Царькова! едактор В. С. Левятов

Заказ 7!1О. 17 Изд. Хо 317 Тираж 473 Подписное

1ХНИИПИ Комитета по делам изобрете|шй и открытий при Совете Министров СССР

Москва, 7К-35, Раушская иаб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Пример 3. Производят инокулирование

Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587 в ферментативной среде, состав которой аналогичен составу ферментативной среды, используемой в ходе проведения процесса по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что концентрация азотнокислого аммония в данном случае доводится до 0,2%, а концентрация экстракта кукурузы доводится до 0,01%

После этого ферментативная среда подвергается встряхиванию в течение 7 дней в условиях, в которых проводится аналоп|чная операция в ходе осуществления процесса, описанного в примере 1. По завершении указанного процесса в ферментативной среде образуется 0,3 г/дцл а-кетоглутаровой кислоты и 0,001 г/дь1л лимонной кислоты. 1 л натуральной жидкости пропускают через колонну со смолой, заполненную Диалионом SA-11 RA (ОН-типа), что приводит к образовангпо лимонной кислоты и а-кетоглутаровой кислоты, которые адсорбируются на указанной смоле, а затем колонну со смолой элоируют водой или водным раствором аммиака (до 1 н раствора), что приводит к фракционированию смеси на лимонную кислоту и o. -кетоглутаровую кислоту.

К раствору элюата добавляют примерно 1 г

СаС1з для отделения кальциевых солей, соответственно, лимонной и а-кетоглутаровой кислоты, при этом получают 5 лг цитрата кальция и 2 г а-кетоглутарата кальция.

Пример 4. Процесс ферментации осуществляют в условиях, идентичных условиям, описанным в примере 2, в результате чего в ферментативном сиропе образуется 5 лл рибофлавина (витамин Вз). К 1 л культуральной жидкости добавляют 4 н раствора НСl до рН 1,0 и образующуюся муть удаляют с помощью центрифуги. Фильтрат концентрируют до примерно

100 л|л и рН концентрированного фильтрата доводят до нужной величины добавлением едкого патра. Затем раствор выдерживают в течение пяти дней в холодном месте, при этом получают 4,5 яг кристаллов рибофлавина.

Характеристика штамма Вге11Ьас1егium

l etogiutamicum ОТСС 15587.

Морфология; палочки размером 0,7 — 0,9)(0,8 — 3.0 д|к, встречаются удлиненные клетки, спор не образуют, неподвижны, грам-положптельнь|е.

Культурные признаки: а) ко.1онии на питательном агаре: пятнистые, г1адкие, сплошные, непрозрачные, блестящие; o) на скошенном ar аре: умеренный рост, нитевидньш, блестящий, розовато-оранжевого цвета, маслянистый; в) на жидкой питательной среде: немного мутный, с пленчатой поверхностью, образует плотный осадок.

Физиологические характеристики: растет при температуре 25 — 37 С (оптимальная 37 С); оптимальная величина рН 6,0 — 8,0;

Лэробные илп анаэрооные.

20 Отношение к различным веществам:

Лакмусовое молоко — не изменяет. или имеет щелочну|о реaêönIo: желапш — не сжижает; стероводород — не образует; индол — не оораЗУет; КРахма 1 — Ilc гид|во 1изз ет; KaTaлаза — положительно; уреаза — положительно; штамм хорошо растет па Н. парафинах B качестве единственного источника углерода и образует кетоглутаровую кислоту, глутам|шовую кислоту и алании; в весьма малы.; количествах из r11o30 козы, фруктозы и сахарозы образует кислоты, i:à 1üòoç не сваивает.

35 Способ пол чения биолоп|чески активных веществ путем выращива|н|"; их продуцентов

Brevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в

40 присутствии стимуляторов роста, например биотина, оттяа,ощий7ся тем, что в качестве продуцента биолоп|чески активных веществ используют Brevibacterium 1 etoglutamicum

АТС С 15587.