Способ получения протеинов

Способ получения протеинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

322888

О П И " " -Еьлаюэ Советскик

Социалистическил

Республик

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Зависимый от патента №

М, Кл. С 12d 13,06

Заявлено 10,Х.1967 (№ 1189904. 28-13) Приоритет 28.Х.1966, ¹ 70720. бб, Япония

Комитет оо делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 663.14(088.8) Опубликовано ЗО.Х1,1971, Бюллетень ¹ 36

Дата опубликования описания 3. II I.1972

Авторы изобретения

Иностранцы

Кацунобу Танака, Такео Сузуки, Кен Ямагучи и Мазаки Ямамото (Япония) Иностранная фирма

«Кийова Хакко Когио Ко, Лтд» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения протеинов путем выращивания микроорганизмов, например Arthrobacter, Corynebacterium, Pseudomo- 5

-nas aeruginosa, Candida lipolytica, Aspergil!us

oryzae, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводороды, например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кис- 10 лорода. Однако при получении протеина известным способом протеин накапливается в клеточных телах, а для его извлечения необходимо восстанавливать клеточные тела и затем подвергать гпдролизу, что значнтель- 15 но усложняет процесс.

Предлагаемый способ позволяет получать протеины в культуральной жидкости. Для этого в качестве микроорганизмов используют один из штаммов Arthrobacter рата fineus 20 № 2411-АТСС 15591, Corynebacterium hydrocarboclastus АТСС 15592, Micrococcus paraffinolyticus № 41-АТСС 15589, Brevibacterium

Ketoglutamicum X 2473-ATCC 15588, Arthrobacter roscoparaffinus № 1661-ATCC 15584, 25 характеризующихся следующими свойствами, Arthrobacter paraf fineus № 2411-АТСС 15591

Морфологические характеристики. 1. Раз- 30

Mep: палочки, обычно 0,8 — 1,2р, 1 — 3 мк.

2. Клетки различаются по размерам и форме.

Форма разнообразная (пскривленные, набухшие, разветвленные). 3. Подвижность: не подвижны. 4. Окраска по Граму неоднородная.

Удлиненные клетки проявляют г1и мотрицательную, В коккондные — Грамполо:ките:1ьнуlo окраску.

Характеристики культивирования. !. Колонии на питательной среде в виде агара: мясной экстракт 3 г, нептон 5 г, агар (отношение веса к объему) 1,5%, дистиллированная вода 1000 мл — обильный рост, форма окрун<ности, повсеместно светло-желтый, коричневый цвет, непрозрачный, блестящие. 2. Колонии на скошенном агаре. Обильный рост, волокнистые формы, возвышающиеся или плоские, непрозрачные, блестящие, светло-желтые до серовато-коричневого, маслянистые.

3. Питательный бульон: мясной экстракт 3 г, пептон 5 г, дистиллированная вода 1000, —— слегка мутный незначительный YëoïüåBèänûé осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура 20 — 30 С, незначительный рост ирн 37 C.

2. Оптимальное значение рН 6,0 — 8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные. 4. Реакция с лакмусом: нет изменешш нли щелочная.

5. Желатпн: не ожижается. 6. Сероводород: не вырабатывается. 7. Индол: не вырабатывается, 8. Крахмал: не гидролизуется, 9. Ни322888 трат: не восстанавливается до нитрита.

l0. Катализ — положительная реакция.

11. Уреаза — положительная реакция. 12. Ферментация углеводорода. Штамм культуры растет хорошо, потребляя и-парафин как единственный источник углерода. Из н-парафина вырабатывает большое количество глютаминовой или уксусной кислоты. 13. Способность к утилизации углеводородов. Из фруктозы и маннита вырабатывает кислоты.

При использовании уксусной кислоты или и-парафина на среде Гукера первичный кислый ортофосфат аммония не утилизируется в качестве источника азота.

Corp»ebacterium hydrocarboclastus

АТСС 15592

Морфологические характеристики. 1. Палочки размером 0,8;(3,0 мк. 2. Коккопдные и разветвленные формы наблюдаются редко.

Споры не образуются. 3. Не подвижны. Не устойчивы к действию кислоты. 4. Грамположительны.

Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде из агара имеют округлую форму, гладкие или мелкоморщинистые, возвышающиеся до выпуклости, сплошные светло-розового цвета непрозрачные маслянистые. 2. Колонии на среде из скошенного агара: умеренный рост, волокнистая форма, блестящие или матовые гладкие или морщинистые светло-розового цвета. 3. Колонии на питательном бульоне: хрупкие в виде пленки.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Воздействие на питательный желатин: ожижение отсутствует.

2. Молоко остается неизменным. 3. В. С. P. молоко: щелочная среда, не пептизируется, 4. Картофель: умеренный рост. 5. Нитраты не восстанавливаются до нитритов, 6. Проба на дыхание в присутствии нитрата: отрицательная. 7. Индол не вырабатывается. 8. Ацетилметилкарбшюл не вырабатывается. 9. Сернистый водород вырабатывается. 10. Крахмал не гидролнзуется. 11. В аэробных условиях из глюкозы вырабатывается кислота в соответствии с методом Хьюга и Лейфсона. 12. Из ксилозы, сукрозы, лактозы и крахмала не образуются ни кислота, ни газ. 13. Глюкоза, глюконат, цитрат, сукцинат, и-оксибензоат и протокатехуат утилизируются в качестве единственного источника углерода. Салицилат, л -оксибензоат, гентизат и антранилат не используются в качестве единственного источника углерода. 14. Керосин, н-декан, и-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан и н-цетан используются в качестве единственного источника углерода. 15. Оптимальная температура

25 — 30 С, скудный рост или отсутствие роста при 37 С. 16. Реакция с каталазой положительная. 17. Естественная среда и место распространения: почва.

ЗО

З5

Afi crococcus рагафпо1у1киь

М 41-АTCC 15589

Морфологические свойства. 1. Форма— сферы или короткие палочки. 2. Размер

0,8 — 1,2);0,8 — 1,4 мк. 3. Подвижность — неподвижны. 4. Окраска грамположительная.

Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агapa: скудный рост. 2. Колонии на скошенном агаре: скудный рост, волокнистая форма, цвет — от светло-красного до красновато-оранжевого, маслянистые, блестящие. 3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, компактный осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура 25 — 37 С. 2. Оптимальное значение рН

6,0 — 8,0. 3. Потребность в кислороде; аэробные; случайно-анаэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется. 5. Ожижения желатины не происходит. 6. Сероводород не вырабатывается. 7. Индол не вырабатывается.

8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с каталазой положительная. 11. Отмечается превосходный рост при использовании н-парафина в качестве единственного источника углерода, при этом вырабатываются аминокислота и карбонильная кислота, особенно L-глютами новая и а-кетоглутаровая кислоты. 12. Ути. лизация сахара: из фруктозы образуется кислота. 13. Из глюкозы и магиюзы образуется незначительное количество кислоты. Из су крозы кислота не образуется.

Brevibacterium getoglutamicum

М 2473-АТСС 15588

Морфологические свойства. 1. Форма: обыч ° но палочки, редко удлиненные клетки, споры не образуются. 2. Размер 0,7 — 0,9 0,8 — 3,0 мк.

3. Подвижность: неподвижны. 4. Окраска по

Граму положительная.

Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: точечные гладкие сплошные непрозрачные и блестящие. 2. Колонии на скошенном агаре: умеренный рост, волокнистые формы, блестящие, цвет розовато-оранжевый, маслянистые.

3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, пленки на поверхности, плотный осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температу ра 25 — 37 С, и ри 37 С усиленный рост.

2. Оптимальное значение рН 6,0 — 8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные; случайноанаэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется или изменяется до щелочной. 5. Ожижения желатины не происходит. 6, Сероводород не вырабатывается. 7. Индол не вырабатывается. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с каталазой положительная. 11. Реакция с уреазой положительная. 12. Отмечает322888 ся превосходный рост при использовании и-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются а-кетоглутаровая, L-глютаминовая кислоты и алании. 13. Утилизация схара: из глюкозы, фруктозы и сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты, мальтоза не утилизируется.

А rthrobacter roseoparaffinus

М 1бб1-АТСС 15584

Морфологические свойства. 1. Форма: обычно короткие палочки. Клетки различаются по размеру и форме, наблюдаются сферические, эллиптические и удлиненные клетки. 2. Размер 0,5 — 0,7;(0,5 — 3,0 мк. 3. Подвижность: подвижные. 4. Окраска по Граму отрицательная.

Свойства культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: умеренный рост, нитевидные структуры, блестящие розовато-оранжевые маслянистые. 2. Питательная среда в виде бульона: слегка замутненная, рост на поверхности отсутствует, незначительный компактный осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура

25 — 37 С. 2. Оптимальное значение рН 6,0—

8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные.

4. Реакция с лакмусом не изменяется. 5. Ожижение желатины происходит в виде кратеров.

6. Сероводород не образуется. 7. Индол не образуется. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат не восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с каталазой положительная. 11. Реакция с уреазой положительная. 12. Отмечается превосходный рост при использовании и-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота, особенно соответственно L-глютаминовая и а-кетоглутаровая кислоты. 13. Утилизация сахара: из глюкозы, фруктозы или сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты. 14. Образования аммиака (питательная среда в виде бульона) не происходит.

Из приведенного выше следует, что данный микроорганизм имеет свойства, черезвычайно сильно отличающиеся от соответствующих свойств известных микроорганизмов, потребляющих углеводороды .в процессе своего роста, особенно в отношении таких важных характеристик, как цветность окраски, подвижность, окраска по Граму, степень ожижения желатины и использование сахара. К тому же не наблюдается образования кислоты из сорбитола и маннитола, кроме перечисленных выше сахаров.

Свойства Pseudornonas aergginosa

Морфология. Палочки размером 0,5—

1,5 мк. 2. Встречаются единичными, спаренными и в виде коротких цепочек. 3. Подвижны, Обладают 1 — 3 полярными жгутиками. :Монотрихин в соответствии с Рейдом, Наг5

65 ским, Фарреллом и Хейли.) 4. Грамотрицательные.

Свойства культивирования. 1. Колонии на желатине желтоватые или зеленов",òî-желтые, окаймленные бахромой, неравномерные, похожие на запутанный клубок, гранулированные, вызывающие быстрое ожижение. Царапины на желатине: быстрое ожижение, жидкость приобретает желтовато-зеленую или синевато-зеленую окраску. 2. Колонии на агаре крупные распространяющиеся сероватые с темным участком посередине и просвечивающими краями, неравномерные, среда зеленоватая. 3. Колонии а скошенном агаре обильные тонкие белые блестящие, окраска среды изменяется от зеленой до темно-коричневой или черной, флуоресцируют. 4. Колонии па питательном бульоне: заметная мутность, толстые кожистые пленки, обильный осадок. Среда желтовато-зеленая до синей, причем наблюдается флуоресценция, затем коричневая. Часто образуются пноциашш, флуоресцеин и пирорубоин.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Реакция с лакмусом: образуется мягкий коагулюм с последующей быстрой пептонизацией и восстановлением лакмуса, реакция щелочная. 2. Картофель: пышный рост, грязновато-коричневый, среда становится темно-зеленой. 3. Индол обы шо не образуется. 4. Нитраты восстанавливаются до нитритов и азота. 5. Глюкоза, фруктоза, галактоза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сукроза, декстрин, инулин, глицерин, маннитол и дульцитол не ферментизируются. Глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, 2-кетоглюконовой кислоты и других промежуточных продуктов. 6. Кровяная сыворотка сжпжается, желтая жидкость, зеленоватая на поверхности. Кровь подвергается гемолизу.

7. Культуры имеют заметный запах триметиламина. 8. Аэробны случайно. 9. Оптимальная температура 37 С, хороший рост при 42 C.

10. Патогенны для кроликов, морских свинок, крыс и мышей. Источник: гнойное отделяемое после ранений.

Способ заключается в следующем. Культивируют один из штаммов вышеупомянутых микроорганизмов на питательной среде, содержаще йисточники углерода и азота, неорганические соединения и стимуляторы роста.

В качестве источника углерода используют углеводороды, например керосин. Могут быть использованы парафины (алканы) с прямыми и разветвленными цепями, содержащие 5 — 15 атомов углерода, например н-пентан, н-октан, н-декан, н-додекан, и-гексадекан, изопентан, изооктан и так далее, циклопарафины, например циклогексан и циклооктан, олефины с прямыми и разветвленными цепями, например пентен-2, гексен-1, октен-1, октен-2 и другие; циклоолефины, например циклогексен и циклооктен; ароматические углеводороды, например бензол, оксилен и так далее, и их смеси, смешанные угле322888 водороды, например легкие, тяжелые, парафиновые масла и т. д, Вместе с углеводородом или углеводородной смесью в ферментационную среду могут быть введены небольшие количества таких углеродных источников, как глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, сахароза, крахмал, гидролизат крахмала и так далее, или другой подходящий источник углерода, например глицерин, маннитол, сорбитол и т. п.

В качестве источника азота могут быть использованы различные виды неорганических или органических солей или соединений, например мочевина или аммиак и его соли, такие как сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония и другие, или природные вещества, содержащие азот, например кукурузный напиток, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, казеиновые гидролизаты, рыбная мука и т. д. Могут быть применены также смеси из двух и более перечисленных веществ.

К неорганическим соединениям, которые могут быть добавлены в культуральную среду, относятся сренокислый магний, дигидрогенфосфат калия, моногидрогенфосфат калия, хлористый натрий, сернистое железо, хлористый марганец, хлористый кальций и другие обычно применяемые соли магния, железа, марганца, цинка, кальция и т. п. Могут быть применены и смеси таких нероганических соединений.

Кроме того, в культуральную среду могут быть введены питательные вещества, существенно необходимые для роста данной особи, например такие витамины, как биотин, тиамин, пантотеновая, п-аминобензойная, никотиновая кислоты и так далее, и различные аминокислоты, например глютаминовая кислота.

Ферментацию проводят в аэробных условиях, например в условиях аэробного встряхивания культуры или помешивания погружной культуры с одновременным введением в нее стерилизованного воздуха при 20 — 60 С.

В процессе культивирования поддерживают рН среды 4 — 10 (предпочтительно 6 — 9) путем добавления мочевинного раствора аммиачной воды, аммиачного газа, углекислого аммония и т. д. Ферментацию проводят в течение 1 — 2 дней.

Целесообразно добавлять антибиотики, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты в качестве стимуляторов роста. Из антибиотиков можно использовать пенициллин, бацитрацин, стрептомицин, циклосерин и т. д.

Поверхностно-активные вещества включают реагенты не ионного, катионного, анионного или амфотерного типов. Наиболее эффективными являются жирнокислотные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (С» — С», серия твин) ч их алкиламиновые соли (Cs — С»), полиоксиэтиленалкиламины (С вЂ” С», серия Наймин), полиоксиэтиленалкилалил эфиры (Cs — С»). полиоксиэтиленалкилэфиры (С» — С,s), алкилтриметиламмониевые галоиды (С1 — С»), алкилбензилтриметиламмониевые галоиды (С» — C»), алкилпиридиновые гглоиды (С» — С»), алкилбетоины (Cis — С») и другие.

Пригодны также различные высшие жирные кислоты, и олеиновая, пальмитиновая, стеариновая и тому подобные, и их соли и эфиры, например сорбитанмоноолеат, эфир полиоксиэтилепгликольолеиновой кислоты, полиоксиэтиленгликольпальмитиновой кислоты и т. д. Эффективно действуют и различные комбинации этих соединений, После завершения ферментации полученный протеин отделяют обычным способом, например центрифугирован нем, осаждением и т. п.

П р и м ер. Arthrobacter paraffineuя

¹ 2411-ЛТСС 15591 культивируют в злачной

20 среде, содержащей 1,0 / мясного экстракта, 1,0% пентона и 0,5% хлористого натрия, рН (до стерилизации) 7,2, путем аэробпого потряхивания в течение 24 час. Культивированную таким образом бактерию прививают в

10%-ной (по объему) пропорции в 3,0 л ферментационной среды, находящейся в 5-литровом вибрационном бродильном чане.

Ферментационная среда имеет следующий состав, %:

К НР04 0,2

МО504 ° 7Н О 0,1

Мп SO4 4Н О 0,002

FeSO4 7Н О 0,02

ZnSO4.7HsO 0,001

ХН4ИОз 0,5

Кукурузный напиток 0,1.

В начале культивирования в ферментациснную среду добавляют 100 мл смеси н-пара40 финов, содержащих 11 — 18 атомов углерода..

Культивирование проводят при помешивании со скоростью 600 об/мин и аэрации стерильным воздухом при 30 С в течение 40 час.

Значение рН культуральной среды регули45 руют в пределах 6,5 — 7,5 .путем добавления во время культивирования аммиачной воды.

По окончании культивирования количество протеина, полученного в водном растворе, составляет 7 г/л.

50 Затем рН водного раствора, полученного путем центробежного отделения ферментационной жидкости, доводят до 3 — 4. Центробежное отделение полученного протеина дает

19 г сырого протеина. Последний снова рас55 творяют в воде (при рН 7 — 8) и этот протеин осаждают при рН 3.— 4.

Вновь проводят центробежное отделение.

Эти операции повторяют дважды. После суш:ки при температуре ниже 0 С получают 17 г

60 очищенного протеина.

Предмет изобретения

Способ получения протеинов путем выращивания микроорганизмов, например ЛгйгоЬасler, Corynebacterium, Pseudomonas aeryginosa, 322888

Составитель В. Дунье

Техред Е. Борисова

Редактор, О. Кузнецова

Корректоры: О. Зайцева и Н. Шевченко

Заказ 160/1 Изд. Ке 1785 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Саг;унова, 2

Candida lipolytica, Aspergillus oryzae, на питательной среде, содержа1цей в качестве источника углерода углеводороды, например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кислорода, отличающийся тем, что, с целью получения протеинов в культуральной жидкости, в качестве микроорганизмов используют один из штаммов Arthrobacter paraffineus № 2411-АТСС 15591, Corynebacterium hydrocarboclastus АТСС 15592, Micrococcus paraffinolyticus № 41-АТСС 15589, Brevibacterium

Ketoglutamicum ¹ 2473-АТСС 15588, Arthrobacter roseoparaffinus ¹ 1661-АТСС 15584,