Набор для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях

Набор для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1, aI, 5 !

X 3255

Класс 42 е, 3

ПАТЕНТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕ

ОПИСАНИЕ набора для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях.

К патенту С. А. Крастелевской, заявленному 26 июня 1924 r.

)ваяв. свил. ¹ 78525).

0 выдаче патента опубликовано ЗО ию.и !927 года. Действие патента распространяется нв 15 лет от !5 сентября 1924 года.

Предлагаемое изобретение предн.,значается !ля количественного колоричетрического определения холестерина в крови и тканях больных с нарушением обмена веществ.

Н!1 чертеже фиг. 1 пзооражаег ви, набора спереди, фиг. 2 — вид сверху, фиг. 3 вертикальный поперечный разрез и фиг. 4 —,lве проекции реактивного цилиндра.

Определение с !юмощью пре;1лагаемого набора производится непосре .ственно путем сравнения цветового то на хлорофорченного слоя реакции H: хо:!естерин с цветными тонами шта;дартных растворов, различных КоН !!ентраций красителя «Бензобраун», Огнцества красочных з!!волов, о. Фр.

Байер и К . Резу.!ьтаты сравн(ния, ол меченные по !пклле пр(гбора. показыP„ iIoT количество холестерина в 1 см" данного вещества, выраженное в миг! лиграм мах, Определение холестерина производится по .четоду, основанному нл видоизмененной автором реакции Зал-, ковского. Основным тоном 1пт; ндарт-, 1 ного раствора является желто-оранже- вый, который к»лебле гся соответс Il(.IIНо разным колпчес.гвам холеслеринл в упомянутой реакции от светло-жег!.1!х оттенк(! в слабых разведениях до оранжево-красных в более сильных.

Клжд!IЯ г(1лд!п1И11 1111 лн;п(р1 но! о рас1 вора крас!!теля стро! о соответствует гнету ...п(рофорв1енного слоя peaKIIIIN

Зллк(1вск(п о, проведенной безводно с

;!звестны чп колпчествамп lilcT»I o х»лестеринл.

Прибор сост»(гг из:

1 ) за па яннь1" .с ек.1яннь1х Цп:п1н, ров а с ilлоским;!ном, ID_#_I()ll)IIx одинаковые рлзмерьl 11 содержащих цветнук1 жи;и ость;

2) ре:1к.!.пино!.о цп:п1ндрл 1и тех же рлзчеров;

3) окрл1!1енного бе:lои крлск(п! !Пта— тивл с тремя полклмп, 13 которых пролелань! отверстия 1 ;!ля вСтЛВЛЕния нилин lpoII. прп чеч ц!(линлры с штан,(лртными растворлмн рлсгп лаглются ч.рез одно отверстие, чтобы между ними могли вставляться реактивные цилин.1ры для сравнения;

4) футляр» C крьшп(ой для п(ледохр.lнения лм!тл от действия света. — 2

0,1 0,3 0,5(0,8. 1,0 1,3 1,5

Дозировки холестерияа и кi

Осноип, раствор краситеия и каплях па

100,0 к??о. сл ?0% спирта . раженное в чиллиграммах (yI

1 куб. сл? сыворотки и при сравнении получается сходство оттенка хлорофорченного слоя реакции с я:чпулой, имеющей обозначение 1,5,„то содержание чистого холестерина в 1 куб. cm данной сыворотки равно 0 0015 мг или

1,5 г HB:IHTp сыворотки.

O«pe;

Успех этих определений зависит от тпгательности выполнения указанных деталей и условий постановки опыта, а также от чистоты и качества реактивов. Для получения сыворотки берется кровь в количестве 5 — 10 куб. см из

Цветная жидкость, заключающаяся в цилиндрах, представляет собою разведения красителя Ве11хо-)п ы11в 1) 3 6

Bayer 1 в 70% спирту. Указанный краситель способен давать все цветовые оттенки, ссютветсгвуюшие тонам реакции Залковского на холестерин. от

О,! л?г до 10 мг.

Приготовление разве;1ений этого красителя распадается на три моменгя: а) приготовление основного раствора; О) приготовление спиртовых разведений красителя, соответственно реакции Зялковского ня чистый холе- стерин; c) установка этих разве,1ений.

Точно отвешивается определенное количество красителя, с расчетом полу-, чения /, 0 раствора в 70"о спирту. т.-е. )

1 25 r красителя на 1 00,0 r 70П чистого спирта. Полученный рыспвор оставляется, для лучшего растворения красителя, на несколько часов 6 8}, DpH постоянном взбалтывании, затем.

1 6 10 16 20 26 30 (При1 о говленные растворы, во избежание возможного испарения спирта тотчас же разливаются в, цилиндры и за паиваются.

Установка разведений красителя слагается. в свою очередь, из двух моментов: 1) постановки реакции Залковского на чистый холестерин в количествах от 0,1 до 10 mr и, 2) проверки полученных разведений цветовых растворов красителя с тонами соответствующих реакций ны холестерин.

Цветовая шкала растворов набора. начиная от слабо-желтых оттенков, соответствующих содержанию холестерина в лец1о1иллигряммах, переходит в желтые тона, при содержании холестерина до 2-х mr, желто-оранжевыЕ до 4 7 л?г и оранжево-красные выше 7 ми лг. У каждой ампулы имеются цыфровые обозначения, указывающие непосредственно соответствуюгцее количество холестерины, выфильпруется и хранится в теплом месте.

Приготовленный таким образом раствор красителя имеет вид прозрачной жи,1кости интенсивного орянжевокрасного цвета. При приготовлении разведений цветовой раствор отмеривается каплями, при помощи пипетки с диаметром отверстия 2 л1л1 с резиновым шариком; один куб. сл? основного раствора красителя содержит 56 капель, отсчитанных этой пипеткой.

Приготовление растворов различных концентраций красителя. соответственно тонам реакции на чистый холестерин, произвопится путем дальнейшего разведения основного раствора в

70" спирту. Расчет для каждого о гтенка произьодится в каплях красителя 100,0 куб. сл1 70,4 спирта. Такич образом, таблицы приготовления ра.-:.ведений краски выражается следующим ооразом:

1,8 2,0 2,3 2,5 2,8 3,013,5 4,0 5,0 6,0 ?,0 10,0 !

36 l 40 46 50 56, 60 80,100,200 300 400 800 (локтевой вены у человека, l:ç г. jugulu

Iis у собак и кошек и из уха или сердца у кроликов. Кровь необходимо брать натощак. Во избежание гемолиза крови, пробирки и шприц должны быть или совершенно сухими, иllf llpc)мыты физиологическим раствором. Сыворо ку желательно исследовать по возможности в свежем виде (не позже 1

2 3 дней после взятия крови). Ге- молиз1!рованные и содержащие эритро-, цить: сыворотки рекоменд ется не,, употреолять для опыта.

Полученная обычным способом (сгояние крови на холоду, центрофугирование! прозрачная сыворотка сливается в чистую пробирку и подвер-

-яется гальнейшей ооработке. Для этоI о отмеривается, с помощью сухой градуированной пипетки, 1 «уб. с !1 прозрачной сыворотки i! приоавляется каплями в широкогорлую склянку с притертой пробкой, емкостью в 30

25 «уо. См, в которую предварительно на IIII:1lerca 5 «уб. см аосолютного алко1-о.1!1. Сыворотка, соприкасаясь с алкоголем. превращается в мелкий

x:IoïüåâèäHûé осадок. Последний слегка размешивается в спирту осторожным

1юкачиванием банки или же продуванием возлуха через пипетку. Затем, склянка тотчас же ставится в сушильный шкаф с температ»рой не менее

55 60 С, ло полной отгонки спирта !! полного высыхания остатка. Только цри такой температуре сухой остаток превращается л цельную, легко olcтaIoluyIo от,1на склянки корочку, слеп я желтоватого цвета и почти прозрачную. Более низкая температура лает ил1! Я»орфную белую 1!1Ссу, которая может заключать в себе остатки влаги, или прилипяние корочк . ко;1ну склянки. Первое влияет на изменение цвета реакции в сторону розоватых тонов, в.горое может влиять на точность исследования. Точно такл<е. более высокая температура слишком ускоряет отгонку спирта и уменыпяет. таким образом. его обрабатываю!цее действие.

Отгонка обычно продолжается от б до

12 часоВ.

П< лученный сухой остаток сыворотки измельчается в банке при помощи л1еталл1!ческого п1пателя, высыпается в хорошо высушенную ступку, тщательно растирается и снова высыпается обратно в банку. Плотно приставшие к бокам банки частицы во время реакци1! смываются",. растворяются хлороформом и серной кис IQTol!.

Сыворотку, в виде сухого остатка и непременно в тех же склянках, можно сохранять неопределенное время в экспкаторе или при обычных условиях в лаборатории. но в последнем случае ев неооходимо повторно просушить перел реакцией, которая производится с с хи» остатком сыворотки, обработанной только алкоголем. Другие составные части плазмы (лецитин. глобулин, соли и проч.) особого значения лля реакции не имеют, так как эти ве1цвстВ11, если даже 1! изВлекяк)тся, 1 о х<1 рактерного тона этой реакции не дают

Реакция производится следуюп!им образом. B банку. Содерж;пцую превр:щенную в порошок сыворотку, точно отмеривается 5 «уб. с!! чистого iëoð:— форма и равный 06 ем- химически ч11стой концентрированной серной кислоты. Смесь осторожно взбалтывается покач!!вание» банки В течение

1 мин. до появления желал!но-подобного вида»ассы и став!!тся в темное помещение, приблиз1ггельо, ня часа. до отстаивания хлоpnфnр»cннnго слоя. После того, iëoðoôoðìåííüïf слой сливается B xopofflo высушенную пробирку одинакового размера с запаянны»ц цилинлрами прибора, закрьlвается пробкой и сравнивается с оттенками растворов красителя.

Правильность получения результатов реакции находится в зависимости I)T !

<ячествя реактиВоВ, температуры 1! безводного протекания реакцш!.

Качество серной кис.юты !имеет особенно важное значение. Неосхход11 1о пользоваться серной кислотой хи<мически чистой. концентр1!Воланной. с удельным весом 1,846. Кислота с низшим»; ельным весо11, со;ержащяя больший процент волы, влияет на изменеш е цветового тона реакции. переводя нормальные желтые тона в розоватые и даже фиолетовые оттенки.

Обычно в реакции тон слоя хорошей серной кислоты бывает почти одинаковой интенсIIfIHOcTII с тоно» xþðoФОРМЕННОГО СЛОЯ ИЛИ НЕСКОЛЬ1 .О ЕМнее. G качестве серно" кислоты можно также судить по тону хлороформенного слоя реакции, который в соотвеп-, ствующих дозировках холестерина не должен уклоняться от оттенков проверенных тонов.

Перед началом работы желательно проверить качество хлороформа. Проверка производится тем же способом. как и проверка серной кислоты. Ставится реакция Залковского с чистым холестерином, и при соблюдении указанных условий она должна дать определенное соотношение оттенков хлороформенного слоя и слоя серной ки- слоты. Хорошего качества хлороформ не должен давать быстрого обесцвечивания розовых оттенков; кроме того, он должен соответствовать тем или другим оттенкам цветовой шкалы набора.

Для обработки сыворотки по предлагаемому методу необходим безводный, по возможности, алкоголь. При приготовлении абсолютного алкоголя путем обезвоживания прокаленным порошком медного купороса, необходимо, cледить за тем, чтобы он совершенно ( не содержаl частиц такового, гак как последние могут влиять на изменение цветового тона реакции в сторону розоватых оттенков. Это может быть оо яснено тем, что попавшие в сыворотку частицы медного купороса при обработке алкоголя забирают воду из нее и удерживают ее при температург

55 — 60 в термостате. в реакции же они, повидимому, отдают частицу кристаллизационной воды серной кислоте.

Температура и>»еет значение, глаяньь» образом, для реакции с чистым холестерином. При этом максимум тона наступает: при температуре 10о че- . рез 20 минут, при температуре 12

15 — через 15 минут, при температуре 20 — через 10 минут.

При более дпительной реакции, независимо от температуры, наступает изменение цветовых то нов реакции.

Реакция на холестерин с сывороткой обычно достигает максимума через 14 — 1 ч. при температуре 10—

14 С и должна проводиться в возможно сухом виде, вследствие чего реактивы должны быть, по возможности. безродны, кроме .гого, необходимо изсегать попадания влаги из воздуха, плохо высушенной сыворотки и посуды.

Определение количества холестернна, содержащегося в исследуемой сыворотке, производится сравнением тоHR хлороформенного слоя реакции с тона»и растворов красителя. Для этого, по прошествии определенного временкч хлороформенный слой сливается в маленькую пробирку, одинаковой толщины стекла и емкости с таковыми в приборе, закрывается пробкой и вставляется в штатив, для сравнения с те»Н или иными тонами красителя, которое должно производиться быстро, так как при продолжительном стоянии »сжет последовать изменение оттенка, Сравнение лучше производить прп дневном свете, падающем перпендикулярно к п IocKocTN прибора, и на уровне глаз исследователя.

Для определения количества холестерина в кровяной сыворотке достаточно брать на реакцию 1 «уб. Сл chf;воротки; но в некоторых случаях. где почему-либо взятие крови в больпгом количестве сопряжено с больши»и трудностями, можно обходиться с 0,5 «уб. ся сыворотки, соответственно уменьшая количество реактивс.в в .1ва раза.

l1pEдмвT патента, Набор для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях при помощи проьеденной безводно реакции Залковского, отличающийся тем, что оН состоит из ряда запаянных стеклянных цилиндров, имеющих одинаковые размеры, содержащих растворы различных концентраций красителя «Бензобраун», Общества красочных заводов, б. Фр. Байер и К-, а равно из одного или нескольких таких >ке размеров открытых стеклянных реактивных цилиндров д.пя сравнения оттенка исгипуемого холестеринового раствора с оттенка:»и рас.гворов указанного красителя.

Типо-питогра4ия @Бранный Пннатнпна, Ло. пнграп, »ожнунарояный. 75.