Патент ссср 334720
Иллюстрации
Реферат
О П И С А Н И Е 334720
ИЗОБРЕТЕН ИЯ ссюа Советскив
Юбциалистических
Республик
К ПАТЕНТУ
Зависимый от патента №
M. Кл. С 12d 13/10
А 61k 19/00
Заявлено 20.!1.1970 (№ 1415654/30-15) Приоритет 21.II.1969, № 9619/69, Великобритания!!омитет по делам иаобретений и открытий при Совете Министров
СССР
Опубликовано 30.!!!.1972. Бюллетень № 12
УДК 577.15.07:577.151..159 (088.8) Дата опубликования описания 28.IV.1972
Автор изобретения и заявитель
Иностранец
Мишель Ореман (Франция) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ
ПРОДУКТОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ
ВЯЗКОСТИ КИШЕЧНОЙ, БРОНХИАЛЬНОЙ И ЦЕРВИКАЛЬНОЙ
СЛИЗИ
Изобретение кааается способов получения .ферментных продуктов, расщепляющих белок, основное свойспво которых — способность вызывать оптимизацию вязкости слизи в живом организме, особенно, вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи.
Цель изобретения — создание ферментов, которые отличаются способностью оптимизировать вязкость кишечной слизи и увеличивать таким образом. скорость поглощения перевариваемой пищи,,а -,также различных добавок, вводимых, перорально.
Кишечная слизистая оболочка, как и все слизистые оболочки, защищена от вредного влияния окружающей среды слизью. Вязкость слизи определяется наличием макромолекул слизистого вещества и мукополисахаридов, которые соединяются между собой протеиновыми мостиками и образуют плотную сетчатую структуру.
Кишечная слизь является барьером между слизистой оболочкой и пищевым комком, Этот барьер препятствует слишком тесному контакту кишечной стенки с крупными молекулами ферментов внутреннего происхождения (трипсинами и хемотрипсинами), которые вызывают переваривание пищи, но могут вредно воздействовать на слизистую оболочку. Однако барьер должен легко пропускать малые молекулы перевариваемой пищи.
Если кишечная слизь слишком вязка, то она тормозит проход в кровь перевариваемых пищевых элементов, если вязкость слизи недостаточна, то она теряет свою защитную роль слизистой оболочки. Между этими двумя величинами редко бывает оптимум.
Установлено, что при помощи промышленных операций брожения можно изготовить расщепляющие белок ферменты, способные в живом организме сообщить кишечной слизи оптимум вязкости.
Обычные расщепляющие белок ферменты, которые были испытаны как добавки в корм или питье для животных, оказывают ли бо
15 слишком слабое, либо слишком значительное действие на вязкость слизи.
Получаемые же по изооретению протеолптические ферменты оптимизируют вязкость слизи.
20 Кроме того, установлено, что оптимизация вяз кости слизи и, следовательно, повышение скорости поглощения перевариваемых пищевых элементов увеличивают скорость роста животных и уменьшают их коэффициент по25 требления.
Способ получения протеолитических ферментных продуктов, предназначенных для оптимизации вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи, заключается в том, чтс
30 на питательной среде, содержащей источники
334720 азота, углерода и минеральных солей при аэрации среды воздухом культивируют грибпродуцент Streptomyces fradiae, предпочтительно штаммы № 1998 и 2019 (Museum
Naional d Histoire Naturelle de Paris), а культивирование ведут до тех пор, пока конечный титр среды не достигнет 3000 ед. Ансома (ед. А.) на 1 мл среды.
При этом используется жидкая среда, содержащая 30 г соевой муки, 30 г глюкозы, 0,8 г динатрийфоофата, 10 г карбоната кальция в расчете на 1 л среды, рН среды около
7,0. Аэрация воздухом из расчета 0,3 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мл. Культивирование ведут при температуре 28 С в течение 60 — 84 час.
В результате брожения получают ферментные продукты, снижающие вязкость кишечной слизи в пределе от 35 до 65 /о и в то же время устойчивые к ингибиторам трипсина. Полученные в результате брожения продукты могут быть концентрированы или очищены согласно существующим способам.
Под единицей Ансома понимается такое количество фермента, которое при инкубировании в течение 10 мин при 25 С и pII 75 в присутствии денатурированного гемоглобина освобождает из этого субстрата эквивалент
1 мкг тирозина, определяемый посредством фотометрического поглощения при 280 ммк на фильтрат, неосаждаемый трихлоруксусной кислотой, Ферментные продукты, получаемые в соответствии с изобретением, вызывают в живом организме адекватную оптимизацию слизи.
По сравнению с естественными ферментыш опти ми зирующего действия — трипсином и хемотрипсином — их оптимизирующее действие выше. Сравнение с этими ферментами проводят в пробирке при помощи теста наплавленной редукции. вязкости слизи (HPCB) .
Измерения.
В качестве субстрата используют слизь поросенка или теленка тотчас же после забоя животного, находящегося на диете в течение суток. Извлекают три последовательных отрезка киношок, длиной около 1 м каждый. Перевязывают один конец отрезка кишки и слабым надавливанием выделяют с другого конца поверхностную слизь, которую удаляют.
Более сильным давлением или соскабливанием внутренней стенки предварительно вытянутого куска кишки выбирают глубинную слизь, от которой отделяют растворимую фазу при промывании в трех объемах воды с последующим центрифугированием. Собирают примерно 50 мл нерастворимой слизи от одного животного. Эта слизь может храниться в течение многих дней при температуре — 20 С или же может использоваться сразу для вискозометрических опытов.
Для вискозометрических измерений используют конус-плату Брукфильда, которая позволяет работать с 1 г нерастворимой слизи. Угловая скорость подвижного конуса регули5
10 5
3О
4 руется преимущественно на 12 об/мин, температуру поддерживают на уровне 37 С.
Шкала, градуированная от 0 до 100, позволяет определить относительную вязкость при помощи прямого считывания. При наличии только одной слизи регулятор ставят на 100, затем добавляют 05 мл буферного раствора при рН 7,5, содержащего изучаемый ферментный продукт. Если указанный продукт является активным, то вязкость быстро понижается, и можно зарегистрировать кривую HPBC в функции от времени. Для сравнения используют высокоочищенные ферменты, содержащие соответственно 1600 и 20000 ед.А./мг.
Они вызывают редукцию вязкости, которая достигает площадки за 30 мин, а поэтому длительность теста может быть ограничена
30 мин. При концентрации 50 ед. А, на 1 г слизи они вызывают уменьшение вязкости слизи на 20%, Для концентрации 250 ед. А. на 1 г слизи уменьшение вяз кости составляет
60 и 40О/О соответственно. Впрочем, слизь теленка или поросенка меняется от животного к животному, так что и результаты могут меняться.
Имея образец слизи, определяют НРВС, вызванную 250 ед. А. изучаемого ферментного продукта на 1 г слизи. Если HPBC составляет от 40 до 60 /о, предпочтительно от 35 до
65О/о, то ферментный продукт удовлетворяет тест.
На графике, иллюстрирующем действие (ферментов на слизь, кривая 1 — HPBC для трипсина; 2 — для хемотрипсина; 8 — для папаина (не удовлетворяет тесту HPBC по недостатку); 4 — для продукта, полученного в соответствии с изобретением (точно удовлетворяет тесту HPBC); 5 — для фермента Вас.
subtilis (не удовлетворяет тесту HPBC по избытку). Ниже даны примеры получения различных продуктов в соответствии с изо бретением.
П р и мер 1. Получение продукта А.
Перебродившую среду фильтруют и концентрируют в вакууме. Получают ферментный продукт в сыром виде, содержащий не менее
50000 ед, А. на 1 мл.
Пример 2. Получение, продукта Б.
Из продукта А при атомизации получают сырой ферментный продукт в твердом состоянии с числом не менее 100 ед. А. на 1 мг.
Пример 3. Получение, продукта В.
Из продукта А при помощи солевого осаждения (сульфитом аммония) и высушивания в,вакууме получают частично очищенный продукт, содержащий не менее 1000 ед. Л/мг.
При мер 4. Получение продукта Г.
Из продукта А прн помощи последовательных осаждений сульфатом аммония и растворений в ацетоне и последующего высушивания конечного, продукта в вакууме получают ферментный продукт средней очистки, содержащий не менее 10000 ед. А. на 1 мг, и представляющий относительную электрофоретическую монодисперсию ферментной активности, 334720
Привес крыс г/сутки.
100 ед. А. на1г корма
1000 ед.
А.на 1г корма фермент без ферментов о а1 а
Контроль
Папанн партия 1 партия II партия III
Rac. subti1is
2,85 100
2,85 100
3,46 119
4,05 142
2,95 103
2,40 84
2,85 100
3,45 121
4,15 143
3,25 114
3,00 105
Из продукта Г электрофорезом в жидкой фазе или хроматографией на колонке, диализом и лиофилизацией выделяют предок!инирующий продукт с высокой очисткой, содержащий не менее 50000 ед. A. на 1 нг и имеющий абсолютную электрофоретическую моподисперсию, Все эти продукты отвечают тесту НРВС.
Их пригодность для практического применения определяется нечувствительностью трипсиновым инп!биторам, что подтверждается экспериментальны м путе и.
Испытание на крысах.
Пример 1. Белых альбиносных крыс распределяют на группы по 5 самок и 5 самцов, Экспериментальные группы получают помимо стандартного корма еще дополнительно ферментные продукты из расчета 10 и 100000 ед.
А. на 1 кг живого веса в сутки, что соответствует 100 и 1000 ед. А. на 1 г корма.
Результаты испытания приведены в таблице.
П р и мер 2. Крысы получают корм, богатый соевыми белками.
Опытная группа получает помимо корма еще и фермент по изобретению (партия
2, 100 ед. А. на 1 г корма=100000 ед. А. на
1 кг живого веса в сутки). Привес крыс составляет как в контрольной группе, так и в опытной группе 5,25 г/сутки.
В этом же опыте вторая опытная группа получает ферментный продукт с питьевой водой из расчета 500 ед. А./лил=100000 ед.А. на 1 кг живого веса в сутки.
Экспериментальная гру ппа 2 получает ту же пищу и питьевую воду, с растворенным а ней ферментом (партия II при дозе 500ед.А./
/мл=100000 ед. А. на 1 кг живого веса в сутки). Средний привес крыс составляет 7,3 г в сутки.
Отсутствие привеса в первой опытной группе по сравнению с контрольной группой объясняется тем, что ферментный продукт имеет слишком тонкий помол для соевых белков, которые при значительном содержании,в корме могут поглотить весь фермент, но при добавлении фермента в питьевую воду достигается частичное проникновение ферментов к слизи.
6
iH р и м е р 3. Испытание на курах свободногоо содержания (на земле),.
Цыплят сначала содержат .вместе на одном и том же корме. В возрасте 12 дней их разделяют на 4 группы, каждая из которых получает корм на основе кукурузы и сои при содержании белка 16%. Контрольная группа 1 (без ферментов).
Опытная группа 1 получает дополнительно ферментный продукт Б (см. выше) из расчета
4 г па 1 кг корма (100 ед. А./мг). Доза фермента составляет 400 ед. А. на 1 кг корма или
40000 ед. Л. на 1 кг живого веса в сутки.
Контрольная группа 2 получает корм на основе кукурузы и сои, но с нормальным содержанием белка 22%.
Опытная группа 2 получает тот же .корм, что и контрольная группа 1, но с добавлением фер ментов.
В возрасте 58 дней вес птиц составляет соответственно по группам 1430, 1553, 1676 и
1772 г, и отношение веса корма к весу птицы соответственно 2,30; 2,15; 2,09 и 1,98.
Пр имер 4. Куры содержатся в клетках.
Контрольная партия получает коммерческую пищу на основе сои и кукурузы, содержащей
21 /о белков, 8 мкг/кг пеницилина — прокаина и 25 лкг/кг тетрациклина. Опытная партия дополнительно получает 400 лг/кг ферментного продукта В с титром 2000 ед. Л./мг. Доза фермента составляет 800 ед. А. на 1 кг корма или около 800000 ед. Л. на 1 кг живого веса в сутки, На 30 день опыта куры обнаруживают .ка кущийся одинаковым результат в обеих группах, однако в контроле каждая курица потребила 1080 г .пищи, а в опытной партии—
903 г, что дает экономию около 16 /о.
На 40 день возникает эпидемия в курятнике, и на 60 день смертность составляет в контроле 5 /о, В опытной партии 1,6 /о.
Средний вес составляет 1319 и 1346 г и коэффициент потребления корма — соответственно 2,63 и 2,8: Экономия — 6,5%.
Положительные результаты опытов получа-! от т акж е н а телят а х.
Предмет изобретения
1. Способ получения протеолитических ферментных продуктов, предназначенных для оптимизации вязкости кишечной, бронхиальной и цервикальной слизи, включающий культввирован!!е микроорганизма-продуцента на жидкой питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральных солей, при аэрации среды воздухом, а также выделение целевых продуктов из культуральной среды и их очистку, отличаюцийся тем, что, с целью получения ферментных продуктов, снижающих вязкость кишечной слизи в пределе от 35 до 65 /о и устойчивых к ингибиторам трипсина, в качестве микроорганизмапродуцента берут Streptomyces fradiae, предпочтительно штаммы Ма 1998 и 2019 (Museun>
National d Histoire Naturelle de Paris), куль334720,ТO мин
Составитель М. Дранишников
Техред T. Ускова Корректор 3. Тарасова
Редактор А. Купрякова
Заказ 1573717 Изд. № 481 Тираж 448 Подписное
ПНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типографии, пр. Сапунова, 2 тивирование ведут до тех пор, йока конечный титр среды не достигнет 3000 ед. Ансома на
1 мл, а полученные в результате брожения продукты при необходимости концентрируют и очищают согласно известным методам.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование Streptomyces fradiae ведут при 28 С на жидкой питательной среде, со8 держащей 30 г соевой муки, 30 г глюкозы, 0,8 г динатрий фосфата, 10 г карбоната кальция в расчете на 1 л среды при рН среды
7,0 и аэрации воздухом из расчета 0,3 объема
5 воздуха на 1 объем среды в 1 мл.
3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что культивирование ведут в течение 60—
84 час.