352469 - Способ получения антибиотического комплекса

Способ получения антибиотического комплекса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

О П И С А Н И Е 352469

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соки Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента ¹

ФМ

М. Кл. С 12d 9!16

Заявлено 23.1V.1968 (№ 1238501f30-15)

Приоритет 28.IV.1967, № 15470 А/67, Италия

Комитет по делам иаобретеиий и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 615.779.931(088.8) Опубликовано 21.IX.1972. Бюллетень № 28

Дата опубликования описания 9.Х.19?2

Авторы изобретения

Иностранцы

Джузеппе Кассинелли, Эрнесто Котта, Паоло Пеннелла и Ремо Фаустини (Италия) Иностранная фирма

«Сосиета Фармацеутики Италиа» (Италия) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛ ЕКСА

Изобретение относится к биологическому способу получения антибиотиков.

Известный способ включает культивирование продуцента из класса Streptomycetes в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, при рН 5 вЂ” 8,8.

С целью получения комплекса либаномицина, состоящего из либаномицина А, либаномицина В и либаномицина С, в качестве продуцента берут Streptomyces libani n. sp. культивирование ведут в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, при 22 вЂ” 37 С в течение 72 вЂ” 160 час и выделяют антибиотический комплекс известными приемами.

Для культивирования используют штаммы

S. libani Г.1. 2343, F.I. 2399, F.1. 2501 и Р.1.

2521, зарегистрированные в Institute of Microbiology of the Rutger University (США) под номерами I.М.R.U. 3915, 1.МЯЛ). 3916, 1.М.К.11.

3917 и 1.М.К.11. 3918 и в Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Кеъ, Serrey (Великобритания) под номерами 1.М.I. 130777, I.М.I. 130778, I.М.1. 130779 и 1.М.1. 131233.

Было обнаружено, что во встряхиваемой жидкой глубинной культуре они продуцируют антибиотический комплекс либаномицина.

Штамм F.1. 2343 был выделен из образц; почвы, взятой в г. Библосе (Ливан), штама

F.1. 2399 вЂ” из образца почвы, отобранной ( рисового поля в Пьемонте, штамм F.1. 2501вЂ” из образца почвы, взятой в Нидер-БеербахЗексгейме (ФРГ).

Морфологические признаки вЂ” общие для всех штаммов, в то время как культуральные

10 у отдельны.; штаммов несоклько отличаются.

Мор фол огп чес кп е п р из н а к и

В обычных культуральных средах вегетатнвный мнцелпй состоит из более плп менее тонких, длинных, обильно ветвисты.; гиф толщиной 0,4 вЂ” 0,8 мк, образующих более толстые гнфы толщиной 1 вЂ” 1,5 лтк, На этих гпфах имеются короткие боковые и густые спиральные ветви, чередующиеся пли расположенные zpyi против друга с монополиальным ветвлением.

Эти небольшие ветви в дальнейшем превращаются в цепи спор, которые в начале связа25 ны, а потом свободны. При наблюдении под электронным микроскопом споры имеют гладкую поверхность, которая бывает овальной Нпи тйпичной почковидной, а зачастую и сфериче ской.

30 Размеры спор (1,2 вЂ” 1,6) Q(1,2 вЂ” 2,4) лтк.

Таблица альные свойства

Культур

Ш тамм

Среда

2343

2399

2521

2501

Рост

Вегетативный спереди сзади

Обильный налет

Лимонный

Обильный налет

Соломенно-лимонный

Лимонно - винный

Агар

Беш|ета мицелий

Лимонно-охристожелтый

Бело-ореховый

Воздушный мицелпй

Растворимый пигмент

Шоколадный

Винный

Отсутствует

Рост

Вегетатнвный спереди сзади

Порядочный налет

Соломенный

Порядочный налет

Бесцветный

Агар

Чапека

Соломенно-лимонный

Гладкий, бельш

Соломенный

Винный

Воздушный мицелий

Растворимый пигмент

Ореховьш, шоколадный

Винного цвета

Хлопковидпый, кремово-белый

Отсутствует

Порядочный налет

Бесцветный

Соломепньш

Соломенно-лимонный

Белый - бело-ореховый

Винный

Хлопковый, серокоричневый

Гладкий, виннокоричпевый

Воздушный мицелин

Отсутствует

Винного цвета

Отсутствует

Растворимый пигмент

Обильный налет

Охристо-желтьш

Обильный налет

Охристо - желтьш

Обильный налет

Охристо-желтый

Обильный налет Охристо-желтый

Агар

Эмерсона

Сильно - охристый

Гладкий, белый

Сильно-охристый

Гладкий, белый

Сильно-охристый

Гладкий, белый

Сильно-охристый

Гладкий, белый

Отсутствует

Обильный налет

Бесцветный

Обильный налет

Винно-охристый

Обильный налет

Соломенно - желтый

Обильный налет

Соломенный

Крахмал, соли и агар

Хлопковидный, ореховый

Гладкий, ореховый

Светло - коричневый

Отсутствует

Растворимый пигмент

Винпьш

Отсутствует

Обильный налет

Лимонный

Обильный налет

Винно-коричневый

Обильный налет

Лимонный

Обильный налет

Лимонный

Картофельный агар

Сильно-лимонный

Беловато - светлокоричневый

Отсутствует

Винно-коричневын

Сильно-ореховый

Сильно-лимонный

Коричневый - светло-серый

Отсутствует

Охристо - желтый

Беловато - коричнево-ореховый

Отсутствует

Винньш

Обильный налет

Бесцветный

Обильньш налет

Соломенный

Обильный налет

Соломенный

Агар вЂ” овес

Обильный налет

Соломенный

Серый - светло-коричневый

Отсутствует

Винно-коричневый

Бежево-светло-коричневый

Каштановый

Лимонный

Гладкий, ореховый

Бесцветный

Хлопковый светло-коричневый

Отсутствует

Asap Рост аспарагино - глю- Вегетативный козовый " спереди

- мнцелий сзади

Рост

Ьегетат ивный спереди мицелий сзади

Воздушный мицелин

Растворимый пигмент

Рост

Вегетативный спереди мицелий сзади

Воздушный мицелий

Рост Вегетативпый спереди мицелий сзади

Воздушный мнцелий

Растворимый пигмент

Рост

Вегетативный спереди мицелий сзади

Воздушный мицелий

Растворимый пигмент

Обильный налет

Соломенно-лимонный

Лимонно-охристожелтый

Орехово-серый

Порядочный налет Порядочный налет

Соломенный Соломенньш

Порядочный налет Порядочный налет

Бесцветный Бесцветный

Соломенного цвета

Хлопковидный, свет.по - коричневый

Отсутствует

Светло-зеленый

Хлопковидный светло - коричневый

Отсутствует

Обильный налет

Соломенно-лимонный

Лимонно - светлоохристый

Бело - коричневосерый

Отсутствует

Соломенный

Бело-бежево-серьш

OTCVTCTBVCT

Порядочньш налет

Бесцветный

352469

Продолжение

Культуральные свойства

Штамм

Среда

2399 2501

2343

2521

Обильный налет

Винно-розовый

Обильный налет

Соломенный

Глицерин аспарагин, агар

Рост

Вегетатнвный спереди мнцелий сзади

Обильный налет

Соломенный

Обильный налет

Соломенный

Винный

Винно-коричневый

Винный

Чнмонный

Соломенный

Лимонно - соломенный

Хлопковый, светло-коричневый

Отсутствует

Хлопковый, серокоричневый

Отсутствует

Воздушный мнцелнй

Растворимый пигмент

Беловато - светлокоричневый

Отсутствует

Обильный налет

Охра желтая

Обильный налет

Лимонный

Обильный налет

Лимонный

Дрожжевой экстракт, глюкоза, агар

Рост

Вегетатнвный спереди мнцелнй сзади

Воздушный мнцелнй

Растворимый пигмент

Обильный налет

Охра желтая

Белый с корнчневымн оттенками

Отсутствует

Охра желтая

Ореховый

Охра желтая

Серо - коричневый

Охра желтая

Светло - коричневый

Отсутствует

Культуральные и биохимические свойства

В табл. 1 приведены культуральные свойства каждого рассматриваемого штамма, выращенного в пробирках и в чашках Петри при

28 С. Наблюдения производят через 6,15 и 25 дней после инокуляции. Культуральные признаки мало различаются у отдельных штаммов.

Воздушный мицелий довольно гладкий у штамма F.I. 2343, а иногда и у штамма F.I.

2501, и наоборот, хлопковидный в результате образования очень длинных спорофорных гиф у штаммов F.I. 2399 и F.l. 2521.

Цвет воздушного мицелия белый у всех штаммов на одних органических средах и преимущественно светло-коричневый на других органических и синтетических средах, однако на последних штаммы F.l. 2399 и F.l. 2521 могут иметь также оттенки серого цвета. Кроме того, штамм F.l. 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что производит пигмент красно-розового цвета, обусловливающего в известной степени также цвет вегетативного мицелия и, следовательно, цвет воздушного мицелия. ,Помимо этого, штамм F.l. 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что усваивает

1-арабинозу и не разжижает желатину.

Рассматриваемые штаммы не восстанавливают нитраты до нитритов, не производят ни меланина, ни сероводорода. Они гидролизуют крахмал, сжижают желатину и используют тирозин. Штаммы F.I. 2343 и F.I. 2521 пептонизируют и коагулируют молоко. Штаммы F.l.

2399 и F.I. 2501 коагулируют молоко но не пептонизируют его.

Для выращивания штаммов применяют глюкозу, сахарозу, d-ксилозу, мезоинозит, d-маннозу, d-фруктозу, мальтозу и рафинозу.

Рамнозу и 1-арабинозу не употребляют, хотя

F.1. 2501 усваивает l-арабинозу.

Все четыре штамма не растут при 50 С и не производят склероциев, в глубинной и встряхиваемой среде они производят антибиотический комплекс либаномицина.

Идентификация штаммов

По приведенным свойствам рассматриваемые микроорганизмы можно отнести к роду

Streptomyces, Waksman et Henrici (Bargey s

Manual of Determinative Bacteriologi, 1957, 744 вЂ” 745; к разделу «Spira» по Рг1сйат ef al.

35 (Appl. microbiol., 1958, стр. 5) . Однако эти штаммы нельзя отнести ни к какой из серий и, следовательно, ни к какому из видов, перечисленных в этом разделе. В действительности, в этом таксоне серия, включающая вид с воз40 душным мнцелием коричневого цвета, характерного для штаммов F.l. 2343, F.l 2399, Г.1.

2501 и F.l. 2521, не предусмотрена. Эти микроорганизмы нельзя отнести ни к какой из систематических групп, предложенных Waksman

45 (The Actinomycetes, 1961, 2, 111 и 117), а также ни к какой из групп, предложенных Baldacci (Giorn. Nicrobiol, 1958, 6, 10), потому что в этих таксонах серии или группы, включающие вегетативный мицелий желтого цвета и воз50 душный мицелий коричневого цвета, отсутствуют. По той же причине, они не могут быть отнесены как ни к систематическим группам, предложенным Flaig und und Kutzner (Arch.

МйгоЫо1, 35, 1960, 105 вЂ” 138), так и ни к ви55 дам, описанным Кргссильниковым (Руководство для идентификации бактерий и актиномицетов, 1949 г., Моксва).

Рассматриваемые микроорганизмы следует

60 отнести к новому виду, для которого предлагается название Streptomyces libani n. sp.

Для последовательных посевов микроорганизмы хранят в подходящей твердой среде для нли посредством лиофилизации их спор в мо65 л оке.

352469

Таблица 2 д1;;

1 см

Среда

1 мах

Метанол

0,1 н. NaOH в метаноле

0,1 н. НС1 в метаноле

244 и 284

245 и 283

100, 107

100, 102

284 перегиб при 255

101

Источником углерода могут служить глюкоза, декстрин, крахмал, мука (соевая, кукурузная, пшеничная и т. п.), меласса, кукурузный экстракт, различные растительные масла и другие вещества, обычно применяемые для процессов брожения. Кроме вышеупомянутых комплексных азотсодержащих веществ, источником азота могут служить казеин, гидролизат казеина, барда и аммонийные соли, например сульфат, фосфат, хлорид аммония, и другие вещества, обычно применяемые для этой цели.

Выбор минеральных солей зависит от используемой среды. Углекислый кальций почти всегда применяется. Могут быть добавлены также хлористый, сернокислый илп фосфорнокислый натрий, соли калия, магния, железа, цинка и меди.

Брожение можно проводить в колбах Эрленмейера, в лабораторных, заводских ферментерах различной емкости.

Комплекс либаномицина состоит из трех веществ, обладающих очень сходными между собой физико-химически ми и биологически ми свойствами. Этим веществам присвоены назва-ния либаномицин А, либаномицин В и либаномицин С.

Антибиотическую активность бульонов и сы рых продуктов определяют на чувствительном микроорганизме и сравнивают с активностью образцов, содержащих значительные количества антибиотика.

Содержание антибиотика в сырье определяют также спектрофотометрированием метанольных растворов при 284 ммк.

По окончании брожения антибиотический комплекс либаномицина, находящийся преимущественно в мицелии, экстрагируют подходящим растворителем, например спиртом или водным ацетоном, и осаждают, Полученный осадок антибиотического комплекса очищают и разделяют на либаномицины А, В и С с помощью хроматографии.

Например, мицелий экстрагируют спиртом или водным ацетоном, концентрируют экстракты до небольшого объема, осаждают сырой продукт, который промыгают водой, сушат хлористым кальцием и промывают безводным ацетоном. Всплывающий слой и промывные воды после промывки сырого продукта приливают к профильтрованным бульонам, для выделения активного продукта из которых используют бутиловый спирт при рН 7,5 вЂ” 8,5 нли катионообменную карбоксильную смолу в

Н-форме. Полученные бутанольные экстракты после промывки водой и упаривания до небольшого объема обрабатывают ацетоном или диэтиловым эфиром, получая активный сырой продукт. При использовании смол после адсорбции и промывки смолы водой и 0 5 í. раствором аммиака активный продукт элюируют водно-спиртовым раствором соли, например

3%-ным раствором хлористого натрия в метаноле (1: 3) .

Антибиотический комплекс получают из активных элюатов после упаривапия, экстрагирования бутиловым спиртом при рН 7,5 вЂ” 8,5 и осаждения экстракта ацетоном. Полученный сырой продукт (концентрация

50 вЂ” 70%) растворяют в низкомолекулярном спирте и хроматографируют на колонке, заполненной нейтральным активированным глиноземом или силикагелем. Для элюирования используют спирт. Сначала получают либаномицин В, а затем либаномицины A и С. Из элюатов выделяют антибиотики в виде белого аморфного порошка, содержащего 90 вЂ” 95% активного ингредиента.

Для анализа образцы антибиотиков дополнительно пропускают через колонку, заполненную порошком целлюлозы, элюируя смесью бутанол вЂ” пиридин вЂ” вода (6: 4: 3) .

Либаномицин А представляет собой аморфный порошок, т. пл. 152 вЂ” 154 C (разложение); (а) =+62,5 (c= 1, метанол) . В УФ-спектре антибиотика обнаружены полосы поглощения, перечисленные в табл. 2.

Найдено, %: С 63,12; Н 8,05; N 6,49.

Реакции с FeC13, KMIIO<, Br, положительны.

В присутствии конц. серной кислоты антибиотик имеет синий цвет, который переходит в фиолетовый.

Реакции Фелинга, нингридрина и Сакагучи отрицательны. При хроматографии на бумаге антибиотик выявляют реагентами Буртона для фенолов и энолов, и реагентами Пан-Дутчера для амидов.

С реагентами Эрлиха он дает желтое окрашивание, Либаномицин А хорошо растворяется в водных спиртах, водном ацетоне, пиридине, ДМФА и ДМСО; растворяется в метаноле (20 мг/мл) и этаноле (4,5 мг/мл) и плохо растворяется в воде (1 мг/мл при 20 С и 5 мг/мл при 50 С). Он не растворяется в ацетоне, хлороформе, бензоле, этиловом эфире и петролейном эфире.

Этот продукт быстро активируется в кислотах, стабилен при нейтральном или слабощелочном рН, на свету, при комнатной температуре.

Либаномицин В представляет собой белый аморфный порошок, т. пл. 155 вЂ” 160 С (разложение); (a) D3 =+72 (с=1, метанол).

Найдено, %: С 64,34: Н 8,42; N 6,77.

УФ-спектр и дру1гие физико-химические свойства либаномицина В такие же, как и у либаномицина А за исключением растворимости в этиловом спирте, которая выше для либаномицина В и составляет 10 мг/мл.

352469

2,000

0,800

0,950

0,400

Обезвожеиная люцерна

Дикальцийфосфат

Углекислый кальций

Хлористый натрий

Габбомикс P без антибиотиков

dl-Метионин

0,500

0,032

%):

11,78

3,75

2,72

5,07

Таблица 3

Величина Дг для 10 либаномицинов

Система растворителей для хроматографии

В С

0,73 0,40 15

0,65

Бутапол вЂ” пиридин вЂ” 3n;la (6: 4: 3)

Бутанол, насыщегп ый буферным фосфатным раствором (1/15 М) при рН 3, «а бумаге, содержащей тот >ке буфер

То же, но с буфером при рН 5,4

То же, но с буфером при рН 7

То же, но с буфером при рН 8

55,93

0,96

0,72

0,85

0,60

Продолжительность опыта 30 дней. Резуль20 таты опыта приведены в табл. 5.

0,75

0,55

Таблица 5

0,90

0,75

0,90

0,50

0,30

Привес, оо

Вес, кг

Номер группы

25 цыпля т петушки куры куры петушки

Антибиотик либо в виде комплекса либаномицина, либо в виде одного из трех его компонентов вЂ” либаномицина А, либаномицина В и либаномицина С, очень активно воздействует на животных и его целесообразно добавлять 30 в корм.

0,481

0,511

0,510

0,492

0,515

0,534

-1-6,23

+6,02

+4,67

+8,53

Пример 1. Две колбы емкостью 300 лл заполняют 60 лл среды, содержащей (в %):

Декстрин 3,00

Казеин 0,50

35 Кукурузный экстракт 0,30

Углекислый кальций 0,40

Сернокислый аммоний 0,10

Дикалийфосфат 0,01

Вода водопроводная До 100

40 Колбы стерилпзуют 20 лип при 120 С. рН среды после стерилизации 6,8 вЂ” 7, В каждую колбу вносят 2 лл суспензии спор, образующейся при промывке 5 лл дистиллированной воды налета культуры, полученной из 20-днев45 ного F.1. 2343, выращенного на смеси картофель вЂ” глюкоза вЂ” агар в пробирке с косым срезом.

Колбы, размещенные на ротационном встряхивателе (эксцентриситет 3 с.и, скорость

50 225 об/лан), термостатпруют 48 час при 28"С и 2 лл культуры инокулируют в другие колбы емкость.о 300 лл, содержащие 60 лл продуктивной среды следующего состава (в %):

Крахмал 10,000

55 Сернокислый аммоний 0,300

Углекислый кальций 0,300

Обезжиренная соевая мука

Чонокалийфосфат

60 Хлористый натрий

Сернокислый магний

Сернокислый цинк

Сернокислое железо

Сернокпслая медь

65 Вода водопроводная

Таблица 4

Диаметр пятен ингибирования, я.и

Микроорганизм

S. aureus

В. subtilis

Е. coti

P. vu1garis

Nycobacterium sp., штамм 607

Mycobacteriurn ph! ei

Candida albicans

8,000

0,750

0,250

0,100

0,001

До 100

УФ-спектр либаномицины С не отличается от соответствующих спекторов либаномицинов A и В. При хроматографии на бумаге при комнатной температуре антибиотики выявляют биоавтографией на Вас. sttbtilis. Используемые реагенты и Rt для соответствующих либаномицинов приведены в табл. 3.

Фармакология

В табл. 4 приведены значения микробиологической активности комплекса либаномицина (в растворе 1000 лкг/мл) в твердой среде.

Токсичность либаномицина для мышей

1 г/кг при перроральном введении и 25 лг/кг при внутривенном введении.

Активность либаномицина определяют опытным путем на 180 цыплятах при содержании в клетках. Цыплят делят на три группы по

30 кур и петушков в каждой. Первая получает основной корм, вторая вЂ” основной корм и

1 г/ц либаномицина, третья вЂ” основной корм и 2 г/г1 либаномицина.

Состав основного корма (в %):

Кукуруза 62,118

Соевая мука (44 /в-ная) 31,200

Рыбная мука 2,000

Химический состав корма (в

Вода

Сырой протеин

Клетчатка

Зола

HpçàçîTèñ Tûñ экстрактивные вещества

Кальций

Фосфор

352469

Раствор стерилизуют 20 мин при 120 С, После стерилизации рН 5,8. Культуру термостатируют при 28 С со встряхиванием, как указано в примере 1, через 120 час получают

150 лкг/мл продукта. 10 л сброженного бульона фильтруют через 2О/о-ный Суперсел, промывают водой и промывную жидкость приливают к профильтрованному бульону.

Влажный мпцелий экстрагируют сна гала

3 л метанола, а затем 2 л 80%-ного водного м".Tàíoëà.

Смешаннгяе экстракты концентрируют в г,акууме до 1/10 (500 ял) первоначального обье»а. Осадок отделяют, промывают водой, высугпнвают в течение ночи в вакууме над хлористым кальцием при 20 С и в течение 4 ис при 56 С над фосфорным ангидридом, Взвесь желто-коричневого порошка в безводном ацетоне фильтруют и осадок высушивают. Получают 1,2 г 70%-ного комплекса либаномиципа.

Профильтрованный бульон подщелачивают до рН 8,5 10%-ным углекислым натрием, встряхивают 1 час, фильтруют и фильтрат (11 л) дважды экстрагируют 1 об. бутилового спирта. Экстракт промывают водой, концентрируют в вакууме до 50 лл с прибавлением

10 об. ацетона. Полученный осадок промывают ацетоном и высушивают.- Из профильтрованного бульона получают 0,500 г 70%-ного активного сырого продукта.

Пример 2. Повторяют те же операции, что и в примере 1, но продуктивную фазу проводят на среде, содержащей (в %):

Декстрин 4,00

Казеин 1,00

Кукурузный экстракт 1,00

Сернокислый аммоний 0,20

Углекислый кальций 0,50

Дикалийфосфат 0,01

Вода водопроводная До 100

Раствор стерилизуют 20 мил при 120 С, После стерилизации рН 6,7 вЂ” 7. Раствор термостатируют при 28 С со встряхиванием, как в примере 1. Через 120 час получают 120 икг/нл продукта.

Пример 3. Порядок операций такой же, как в примере 1, но продуктивную фазу проводят на среде, содержащей (в %):

Крахмал 2,00

Барда 1,75

Хлористый натрий 0,25

Обезжиренная соевая мука 3,00

Соевое масло 0 8,п.

Вода водопроводная До 100. рН доводят до 7,2 едким натром, после стерилизации рН около 6,7.

Раствор стерилизуют 20 мин при 120 С, термостатируют при 28 C со встряхиванием, как в примере 1. После 120 час ипкубации получают 100 мкг/мл продукта.

Пр имер 4. В колбу на 2000 .мл с тремя углублениями снаружи, образующими три ребра внутр колбы, и боковой шейкой для пно5

12 куляции заливают 500 лл среды, указанной в примере 1 для вегетативной стадии, и стерилизуют ее 20 лин при 120 С. После охлаждения колбу инокулируют суспензией спор, полученной промыванием стерильной дистиллированной водой налета трех культур в пробирке.

Колбу термостатируют при 28 С и встряхивании (скорость 120 об/лик, эксцентриситет

45 ял) в течение 38 час, 50 лл полученной вегетативной культуры инокулируют 3 л среды, залитой I-; 5-литровые стеклянные ферментеры и имеющей следующий состав (в %):

Декстрин 4,0

Казепн 1,0

Кукурузный экстракт .(50",н ь!,.„ .)

1,0

Углекислый кальций 0,5

Сернокпслый аммоний 0,1

Дикалнйфосфат 0,1

Вода водопроводная До 100.

Бульон встряхивают со скоростью 400об/яин и продувают 1 об. воздуха на 1 об. среды в

1 лин при 27 C в течение -24 час. В конце этого периода отбирают 3 л мицелиевой суспензии и инокулируют в 50 л сбраживаемой среды, которая содержит (в %):

Крахмал 4,0

Казеин 1,0

Соевая мука 3,0

Свекольная меласса 0,2

Углекислый кальций 0,4

Сернокислый магний 0,1

Вода водопроводная До 100.

Среду стерилизуют 30 лия при 121 С и после пнокуляции встряхивают со скоростью

200 об/мин и продувают 0,7 л воздуха на 1 об. среды в 1 мин при 28 С в течение 110 чпс. Получают 110 лкг/лл антибиотика. 50 л полученного сбраживаемого бульона фильтруют через

2%-ный Суперсел. Влажный мицелий экстрагируют 15 л метанола и 10 л 80%-ного водногс метанола. Экстракты упаривают до 4 л.

Осадок отделяют, промывают водой, высушивают, суспендируют в безводном ацетоне, фильтруют и высушивают. Получают 11,30 г

60%-ного сырого продукта.

Маточные растворы и промывные воды приливают к профильтрованному бульону, Кальций удаляют, доведя рН раствора (55 А) до

6 едким натром и прибавляя углекислый натрий до рН 9,2. Смесь встряхивают 1 час, прибавляют 100 г ипфузорпой земли и фильтруют для удаления углекислого кальция. После этого рН фильтрата доводят до 6 хлористым водородом, пропускают через колонку, содержащую 2 л Лмберлита IRC в хлористоводорсдной форме. Смолу промывают 5 л воды, 5,z 0,5 и. раствора аммиака и 5 л воды.

Элюировапие проводят смесью 3 об. метанола и 1 об. 3 <-ного водного раствора хлористого натрия. Получают 6 л активного элюаза, который упари,;ают до 1,5 л в вакууме, доя.дят р1! до 8,5 еяким натром, экстрагиру13 ют дважды 1 об. бутилового спирта. Экстракт промывают водой и концентрируют до 100 лл.

После прибавления 10 об. ацетона отделяют образующийся осадок, промывают, высушивают и получают 3,25 г 60%-ного сырого продукта.

В 200 лл метанола суспендируют 14,40 г сырого продукта. Осадок неактивной фракции (1,40 г) отделяют, фильтрат пропускают через колонку, содержащую 300 г нейтрального глинозема, взвешенного в метаноле, промывают

3 л метанола и элюируют 80%-иым водным раствором метанола. Собирают фракции по

100 мл, следя за элюированием по спектрофотометру (отсчет показаний при 244 и 284 млк), а затем анализируют методом хроматографии на бумаге, применяя в качестве растворителя смесь бутанол вЂ” пиридин вЂ” вода. Для проявления активных компонентов используют метод биоавтографии на Вас. subtilis.

Первые 20 фракций содержат либаиомицин

В (Кг 0,78), а фракции от 21 до 30 содержат смесь либаномицииов А и В (Rr 0,65 и Rr 0,78).

Фракции от 31 до 50 содержат либаиомицины А и С (Rr 0,65 и Rr 0,40).

Каждую группу фракций выпаривают отдельно в вакууме досуха. Остаток растворяют в этиловом спирте, фильтруют, концентрируют до небольшого объема и осаждают 10 об. ацетона. Осадки высушивают в вакууме при 56 С над фосфорным ангидридом, Получают 1,80 а либанмицииа В (90%-ный), 1,70 г либапомицинов В и А (90%-ный) и 3,80 г либаиомицииов А и С (90 lo-иый).

Раствор 1,40 г либаномицина А, содержащего также либаномицины В и С, в этиловом спирте (96 ) пропускают через 25 г порошка целлюлозы, высушивают в течение ночи в вакууме над хлористым кальцием и помещают в хроматографическую стеклянную колонку, содержащую 225 г порошка целлюлозы. Смесь элюируют смесью бутанол вЂ” пиридии вЂ” вода (6: 4: 3), собирая фракции по 10 л г, которые анализируют хроматографией на бумаге, проявляя активные компоненты биоавтографией хроматограмм на пластинках агара, инокулироваиного Вас. subtilis.

Фракции 5 вЂ” 7 содержат либаномицин В, фракции 8 вЂ” 16 либаномицины Л и В, фракции

17 вЂ” 24 либаномицин Л, фракции 25 вЂ” 40 либаномицип А и следы либаHомицина С и фракции 41 вЂ” 45 либаномицин С. К каждой группе фракций приливают дистиллированную Boëó и петролейньш эфир. Водную фазу экстрагируют 1 об. петролейного эфира, повторяя операцию три раза, добавляют этиловый спирт, упаривают досуха, растворяют остаток в этиловом спирте, полученный раствор фильтруют и концентрируют до половины первоначального объема. Добавляя 10 об. безводного ацетона, осаждают антибиотики в аморфном виде.

Осадок отфильтровывают, промывают безводным ацетоном и высушивают над фосфорным ангидридом в вакууме при 56 С. Получают

30 мг либаномицина В; 120 мг либаномицина

352469

А, содержащего следы либаномицина В, 640 ягг либаномицина А, 150 лг либаномицина

А, содержащего следы либаномицина С, и

5 мг либаномицина С.

П ри мер 5. В 80-литровый ферментер из нержавеющей стали вливают 50 л среды, описанной в примере 4, и стерилизуют 30 лин при 121 С. При 27 С ферментер засевают

500 лл вегетативной культуры, выросшей на той же среде в колбе, описанной в примере 4.

Ферментер продувают 0,7 об. воздуха на

1 об. среды и встряхивают 25 час. 3а это время рН доводят до 6,7 и получают бульон, готовый для засева.

Состав сбраживаемой среды (в %):

Крахмал 5,0

Глюкоза 0,5

Углекислый кальций 0,5

Соевая м ка 4,0

Сернокислый магний 0,1

Вода водопроводная До 100

Предмет изобретения

1. Способ получения ангибиотического комплекса, включающий культивирование продуцента из класса Streptomycetes в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содер65 жащей источники углерода, азота и минераль500 л среды стерилизуют 20 лия. при 121 С, после охлаждения до 27 С засевают 25 л вышеописанной вегетативной культуры, полученную смесь встряхивают со скоростью

210 обилии и продувают 0,65 об. воздуха на

1 об. среды в 1 лик в течение 87 час. Получают 120 лкг/л.г антибиотика.

450 г бульона фильтруют па фильтр-прессе с использованиеAI 3%-ного Суперсела. Промытый водой, ио еще влажный мицелий (86 кг) экстрагируют дважды 360 л 90 rp-rroão водного метанола. Экстракты концентрируют до 100 л в вакууме при 40 вЂ” 45 С. рН полученного концентрата доводят до 8,5. Концентрат экстрагируют сначала 70,г, а затем 20 л бутилового спирта. Смешанные экстракты промывают во40 дой и концентрируют до 8 л в вакууме. Осадок фильтруют, промывают ацетоном и высушивают. Получают 180 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С.

Дальнейшее концентрирование полученного

45 бутанольного экстракта до 1 л и последующее осаждение 10 г ацетона позволяет дополнительно получить 208 г 20%-ного сырого продукта, состоящего из смеси трех антибиотиков.

Профильтрованный бульон и промывные во50 ды (500 л) смешивают, доводят рН до 8,5, экстрагируют два раза 280 л бутплового спирта, полученный экстракт промывают водой и концентрируют до 25 л в вакууме. Неактивный осадок отделяют, фильтрат концентрируют до

55 2 л, прибавляют 10 об. ацетона, полученный осадок промывают ацетоном, высушивают и получают 75 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С.

l5 ных солей, при рН 5 вЂ” 8,8, отлича ощийся тем, »со, с целью получения комплекса лпбаномицина, состоящего из либаномицпна А, лпбаномицина В и либаномицпна С, в качестве продуцента берут Ягер1оп1усез libani и. sp,, а культивирование ведут при 22 вЂ” 37 С в тече352469

16 пие 72 вЂ” 160 час и выделяют антибиотический комплекс известнымп приемами.

2. Способ по п. 1, o7,ãè÷àþùèéñÿ тем, что используют штаммы Streptomyces libani F. l.

5 2343, F. l. 2399, Г.1. 2501 или F. l. 2521 (Societa Farmaceutici Italia).

Составитель М. Дранишников

Редактор T. Шарганова Техред Л. Евдонов Корректор Л. Бадылама

Заказ 3224717 Изд. М 1330 Тираж 406 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений н открытии при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ получения антибиотического комплекса

Патент 352469