Сссрзависимый от патента № — заявлено 17.iv.1968 (№ 12; зэ3513/3'1-16) приоритет 18.iv. 1967, № 15056—а/67, италия опубликовано 17.iv.1973. бюллетеиь № 18 дата опубликования описания 15.vi.1973-и ^'•^«^o^-xjr, ;fw,.,._*•* -!'яля :биолиslil^bisaм. кл. с 12d 9/14а 61k 21/00удк 615.779.а31(088.8)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

378О26

ОflИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Йоюз Соввтскик

Социалистическил

Республик

Зависимый от патента №

М, Кл. С 12d 9/14

А 61k 21/00

Заявлено 17.1Ч.1968 (№ 1233363 31-16) Приоритет 18.IV.1967, № 15056 — А/67, Италия

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 615.779.931,(088.8) Опубликовано 17.IV.1973. Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 15ХГ.1973

Авторы изобретения

Иностранцы

Федерико Аркамоие, Джузеппе Кассинелли, Аурелио Ди Марко и Марчелло Гаэтани (Италия) Иностранная фирма

«Сосиета Фармацеутики Италиа» (Италия) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДРИАМИЦИНА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам получения антибиотиков, в частности адриамицина.

Способ получения адриамицина в л1итературе не описан.

Целью изобретения является получение противоопухолевого антибиотика. Эта цель достигается тем, что культуру Streptomyces

peucetius F.i. 106 инкубируют в аэробных условиях на жидкой среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в течение 3 — 7 суток при 25 — 37 С и начальном рН 6,5 — 7,0, культуральную жидкость или в отдельности мицелий и нативный раствор экстрагируют органическими растворителями и из экстракта выделяют целевой продукт и подвергают его очистке известными приемами.

Пример 1. Приготовляют две колоы Эрленмейера емкостью по 300 мл, содержащие

60 мл культуральной среды для вегетативной стадии. Состав данной среды берут следующий: пептон — 0,6%, сухие дрожжи — 0,3%; гидратный нитрат кальция — 0,05%; водопроводная вода, Величина рН после стерилизации составляет 7,2. Стерилизацию осуществляют нагреванием раствора в стерилизационном автоклаве при 120 С в течение 20 мин. В каждую колбу вносят количество мицелия мутанта F, i, 106, соответствующее /5 суспенз ии в

Стерильной воде мпцелия из десятидневной культуры, выращенной в большой пробирке и в среде следующего состава: сахароза — 2%; сухие дрожжи — — 0,1%; дикалийфосфат — 0,2%, 5 азотнокислый натрий — 0,2%; сернокпслый магний — 0,2%; агар — 2%; водопроводная вода. Koëáû, поставленные на ротационной мешалке с эксцентричностью 30 мм и скоростью 220 00/мин выдерживают в термостате

lO при 28 С в течение 48 час. Так выращенную вегетативную среду вносят в количестве 2 мл в 300-миллилитровые колбы, содержащие

60 мл среды для продуктивной стадии. Сосгав данной среды следующий: глюкоза — 6%; су15 хие дрожжи — 2,5%; хлористый натрпй—

0,2%; дикалийфосфат — 0,1%; углекислый кальций — 0 2%. сернокислый магний — 0 01% сернокислое железо — 0,001%; сернокислый цинк — 0,001%; сернокислая медь — 0,001%;

20 водопроводная вода. При этом получают рН равное 7. Этот раствор стерилизуют при 12!) C в течение 20 мин; глюкозу стерилпзуют раздельно тоже в течение 20 мин при 110 С. Полученныи pacTHop at t pepi

25 при 28 С и в том же режиме взбалтывают, как для вегетативной среды.

Наибольшую концентрацию антибиотик" достигают на шестой день брожения. Количе. ство продуцируемого адриамицпна в этом воз30 расте соответствует концентрации 15 мкг/s о.

378026

П р и и е,р 2. Этот пример отличается от предыдущего тем, что посевную культуру выращивают в следующей твердой среде: 200 г очишенного картофеля варят в 500 мл воды в течение 20 мин; объем доводят до первоначального значения и профильтровывают через марлю. Добавляют 2% глюкозы, 0,1% дрожжевого экстракта Дифко и 2% агара. Объем доводят до 1 000 мл и смесь стерилизуют прп

120"С в течение 20 мин; рН равно 6,8 — 7.

Наибольшая концентрация адриамицина—

11 мкг/мл и получена в 140-й час обработки.

П р и м ер 3. Этот метод отличается от предыдущего применяемыми вегетативной и продуктивной средами, состав которых берут следующий: Вегетативная среда; крахмал — 3%; углекислый кальций — 0,4%; барда — 0,3%; сернокислый аммоний — 0,1%; казеин — 0,5%, дикалийфосфат — 0,01 %; водопроводная вода.

После стерилизации в автоклаве при 120 С в течение 20 мин рН равно 7. Продуктивная среда: крахмал — 5%; углекислый кальций—

0,8%; кукурузный экстракт — 0,6%; казеин—

0,5%; сернокислый аммоний — 0,1%; дикалийфосфат — 0,01%. После стерилизации рН составляет 7. Стерилизацию проводят в том же порядке, как для вегетативной стадии.

Максимальное производство получают на седьмой день с концентрацией 6,5 мкг/мл, При мер 4. Культуру мутанта Г.i.106 в твердой среде, как описано в примере 2, инокулируют в 500 мл жидкой среды вегетативной стадии, описанной в примере 1, и содержащейся в колбе из стекла пирекса емкостью

2000 мл. Поставив колбу на вращающийся взбалтывающий прибор, работающий со скоростью 120 об мин и эксцентричностью 3,5 мм, смесь выдерживают при 28 С в течение 48 час.

Затем 100 мл так полученного культурального бульона инокулируют в 3000 мл той же жидкой среды, содержащейся в 5-л ивровом ферментере из нейтрального стекла.

Этот прибор должен быть снабжен винтовой мешалкой, трубой подачи воздуха для борботера, установленного под винтовой мешалкой, волноломом, трубой для инокуляции, выпускной трубой воздуха, аппаратурой для контроля температуры и устройством для периодического или непрерывного добавления при стерильных условиях.

Выращивание проводят при 28 С с расходом воздуха продувания 3 л/мин и скоростью

400 об/мин перемешивающих винтов. После

24 час 300 мл так выращенного культурального бульона израсходуют для посева 6 л продуктивной среды, описанной в примере 1 и содержащейся в 10-литровом ферментере из нейтрального стекла, обладающем вышеописанными характеристиками. Во время брожения, проведенного со скоростью перемешивапия 350 об/мин и при продувании воздухом

5 л/мин, добавляют небольшое количество силиконового противовспенивателя.

1-! аиболыпая продукция, полученная за

150 час брожения, соответствует концентрации адриамицина 6 мкг/мл.

iI р и м е р 5. Культуру, полученную, как описано в примере 1, инокулируют в 2000миллилитроьую колбу, содержащую 500 мл среды следующего состава: пептон — 0,6%; зерненные сухие дрожжи — 0,5%; азотнокислый кальций в воде — 0 05%. Среду перемешивают на вращающемся взбалтывающем приборе в течение 48 час прп 28 С, Полученную культуру засевают в 50 л вышеуказанной среды, содержащейся в 80-литровом ферментере, и перемешивают со скоростью 230 об/мин и с расходом продуваемого воздуха 0,7 л/л среды/мин при 27 С. После 4 — 5 час культуральпый бульон готовят для посева 500 л культуральной среды в 800-л итровом ферментере. Состав сбражцваемой среды следуюншй: глюкоза — 7%; путовая мука — 6,65%; углекислый кальции — 0,2%; хлористый натрий—

0,2%; дикалийфосфат — 0,1%; гептагидрат сернокислого магния — 0,02%; гептагидрат сернокислого железа — 0,00068%; гепта гидрат сернокислого марганца — 0,001%, сернокислая медь — 0,002 %; водопроводная вода. Среду стерилизуют при 120 С в течение 30 мин, охлаждают до 27 С и после засева перемешива101 со скоростью 250 oo/ë èí и продувают при расходе воздуха 0,4 л/л среды/мин, После 145 час в культуральном бульоне содержится 6,5 мкг/мл адриамицина.

Пр им е р 6. 60 л культуральной жидкости, полученной брожением, как в примере 4, отфильтровывают от мицелия с помощью Суперцел (зарегистрированная фабричная ма рка) с получением лепешки и фильтр ата, которые экстрагируют отдельно; затем полученную лепешку суспендируют в ацетоне, разбавленном

0,1 н. водяным раствором серной кислоты (4: 1) и перемешивают в течение 2 час. После этого фильтруют жидкость, а лепешку перемешивают дважды, Полученные экстракты собирают и нейтрализуют, а ацетон испаряют в вакууме. Концентрат, в котором содержится около 0,25 г адриамицина, подкисляют до рН 3 с помощью соляной кислоты, после этого экстрагируют хлороформом для удаления процента примесей. )Кидкую фазу доводят до рН 8,6 1 н. раствором едкого натра, а затем экстрагируют смесью хлороформ-метанол (9: 1). Эту операцию повторяют до полного обесцвечивания жидкой фазы. Экстракты хлороформ-метанол промывают водой до доспинсения рН 8,6, а затем опять экстрагируют

0,01 н. раствором соляной кислоты до окрашивания жидкой фазы кдаспым цветом. Хлороформпую фазу удаляют, а жидкую — фильтруют и доводят до рН 8,6 посредством 1 н. раствора едкого натра и, наконец, экстрагируют при помощи смеси хлороформ-метанол (9: 1). Экстракт, в котором, помимо разных примесей, содержится 0,15 г адриамицина, промывают водой до достижения рН 8,6, затем высушивают безводным сернокислым натрием, 378026

5 фильтруя>т и концентрируют под пон иженным давлением до малого объема. Прибавив к этому 10 объемов диэтилового эфира, получают осаждение 1,00 г сырого продукта, содержаииего 0,12 г адриамицина.

Всего получают 0,320 г адриамицина в виде сырого основания.

ll р и м е р 7. В 10 смв / в М фосфатного буферного раствора с рН 5,4 растворяют 0,500 г сырого продукта, содержащего около 15 "/о ядриамицина. Раствор адсорбируют на 10 г целлюлозного порошка (Ватман CF 11), высушивают в вакууме безводным хлористым кальцием в течение ночи, а затем помещают в хроматографическую стеклянную колонку (высотой 100 см и диаметром 4 см), содер>кащею

225 г целлюлозного порошка (Батман CF 1!), пред»арительно смешенного с /д М фосфатного буферного раствора при pl-1 5,4. После этого все высушивают в вакууме через безводный хлористыи кальций. Раствор эллюируют смесью пропанол-этилацетат-вода (7:1:2) и с помощью автоматического собирателя собирают фракции по 25 мл. Разные фракции подвергают хроматографическому анализу на бумаге (Батман № 1), рН которой доводят до

5,4 с помощью применения в качестве растворителя для элюирования смеси, используемой для элюирования колонки. Фракции 40 — 60 содержат адр иамицин. Эти фракции собирают и концентрируют до 50 мл. Осажденные соли фильтруют, а к фильтрату прибавляют 200 мл воды и pl-1 доводят до 7 при помощи 1 н. раствора едкого патра, затем раствор концентрируют дu 50 мл под пониженным давлением, рН концентрата — до 8,6, после чего экстрагируют хлороформом. Эту операцию повторяют три разя, я потом хлороформенные экстракты собирают и промывают водой с рН 8,6 и водой, обезвоживают безводным сернокислым натрием, а. затем фильтруют. Полученный фильтрат концентрируют до 5 мл под пониженным давлением и к нему прибавляют 0,15 мл 1 н. раствора безводной соляной кислоты в метаноле, а потом охлаждают. После нескольких минут наблюдают образован не кристаллического осадка хлоргидрата адриамициня, который ф ильтруют и промывают холодным хлороформом и безводным

;и;этиловым эфиром.

Таким образом получают 50 мг продукта, который перекрнсталлизовывают из этанола с получением 30 мг чистого продукта с температурой плавления 204 †2 С, Из маточных растворов дополнительно рекуперируют 15 мг некрпсталлического продукта с 90%-ной чистотой.

6

Пример 8. 0,077 г хлористоводородного адриамиц ина растворяют в 4 мл 0,5 н. раствора соляной кислоты и нагревают при 100 С в течение 1 час. Вследствие этого получают аморфный осадок темно-красного цвета, который, пройдя охлаждение, собирают путем фильтрации. Полученный продукт, после промывки водой до нейтральной реакции промывной воды, высушивают в вакууме через гидроокпсь калия в течение одной ночи, а фосфатным ангидридом при 56 С в течение 6 час.

Таким образом получают 47 г аглпкона адрпампцина, температура плавления которого

223 †2 С и оптическая активность (а)0=

=+156 (диоксан). Эмпирическая формула данного продукта: СыН вОв

1 lосле осаждения агликона в почти бесцветном воднокислом растворе содержится соединение, восстанавливающее жидкость Феглинга и проявляющее положительную реакцию с нингидрином. Нейтрализацию раствора (pH 6) осуществляют путем перколяции его через обменную смолу Доуекс 1+8 (в виде б икарбонатa). Гlосле этого смолу фильтруют, а фильтрат лиофплизуют.

Белый осадок состоит пз аминосахара, обладающего теми же свойствами хлоргидрата дауносаминя.

l1pH хромятографировании на бумаге в системах бутанол — уксусная кислота — вода (4:

: 1: 1 и 4: 1: 5) и бутянол †пирндпн †(G: 4: 3), а также Ври тонкослойпой тографии па Ллюзиле в системе пропанол— этилацетат — вода — 25 О/о -ный водный раствор аммиака (6: 1:3: !) данный аминосахар не отделяется от дауноцами.

Г1ро:ц KT нингидрипового реагента и фталата анилина на бумаге, а с помощью анисового альдегида и серной кислоты — в тонких слоях.

Предмет изобретения

Способ получения адриамицина, отличаюrquuca тем, что культуру Streptomyces peucetius Г. i. 106 (Streptomyces peucetius var. caesius) инкубпруют в аэробных условиях на жидкой среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в течение 3—

7 суток прп 25 — 37 С и начальном рН 6,5 — 7,0, культуральную жидкость или в отдельности мицелий и ьативный раствор экстрагируют Ор ганпческпми растворителями п пз экстракта выделяют целевой продукт и подвергают его очистке известными приемами.