Способ получения новых пептидов

Способ получения новых пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

386508

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз СоветскиЪ

Социалистимеских

Республик

Зависимый от патента №вЂ”

Заявлено 2il.Х.1 970 (№ 1486904/23-4)

Приоритет 22.Х.1969, № 15786/69, Швейцария

Опубликовано 14.VI.1973. Бюллетень № 26

М. Кл. С 07с 103/52

Гасударственный комитет

Совета Мнннстрав СССР па делам изобретений н открытий

УДК 547.964.4.07 (088.8) Дата опубликования описания 9.Х.1973

Авторы изобретения

Иностранцы

Макс Бруггер, Бернхард Риникер и Вернер Риттель (Швейцария) Иностранная фирма

<. ЦИ БА — ГЕЙ ГИ АГ» (Швейцария) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПЕПТИДОВ

il

Изобретение относится к области получения новых пептидов, обладающих высокой гипокальциемической активностью.

Предлагаемый способ позволяет получать по оптимальной схеме аналоги человеческого тиреокальцитонина, представляющие собой новые, ранее неизвестные пептиды. Предлагаемый способ получения новых пептидов заключается в том, что пептиды общей формулы

СН,— S ,б1 2 3 4 8 6 7 8 9

R-CH-CO-ГЛ и-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис-Х - Лей10 11 12 13 14 16 16 17 18 19

Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Аон-Лиз - Фен20 21 22 23 24 26 26 27 28 29

Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре — Ала-Иле-Гли-Вал30 31 32

Гли-Ала-Про-МН2 получают конденсацией фрагментов 1 — 10 и 11 — 32 с последующим удалением защитных груп И и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитивных солей или комплексов известными пр иемами.

При этом R — Н, NH2 или ацил-NH, Х вЂ” остаток 1 -метионина, 1 -валина, 1 -норвалина, 1лейцина, L-изолейнина, L-норлейцина или 1.=а аминомасляной кислоты> а B положениях 11, 12,16, 17, 19, 20, 22 и 24 по меньшей мере одна из ами нокислот замещена другой, а 2 имен но L-треонил"-L-лизином, 1 -тирозин 21 -лейцином, 1 -фенила-ланин"-1 -лейцином, 1аспарагиновая кислота 7-L-гистидином, 1-фенилаланин"-лейцином, 1-гистидин20-1 - глютамином, 1-фе11илаланин22- -тирозином и 1-глютамин"-1 -аргин ином, П р и м ер 1. Z - Тре(ТБу) - Тир(ТБу)

Про-ОН.

Н-Тир (тБу)-Про-ОН, полученный из 11,75 г то Z-Тир (тБу) -Про-ОН, растворяют в 39 мл диметилформамида, прозрачный раствор охлаждают в ледяной BBiHHB, после чего добавляют

2,81 мл N-метилморфолина и 12,2 г твердого

Z-Tpe (тБУ) -ОСУ. Полученный раствор на

23 час оставляют при комнатной температуре упаривают, полученное желтокоричневое масло растворяют в этилацетате, и трижды промывают разбавленным раствором лимонной кислоты, затем водой до нейтральной реакции. После высуши вания сульфатом натрия этилацетатную фазу упаривают. Образуется белая пена, которую подвергают противоточному распределению.

Т. пл. 90 — 94 С (сс)20 = — 23 (с=1 метаноле)

Пример 2. Z-Tpe-(тБу) -Про-Глн-Тре (Тбу) -Ала-Иле-Гли-Оме.

4,94 г Z-Tpe(тБу)-Тир(тБу)-Про-ОН растворяют в 40 мл диметплформамида, затем до88N08

65!

3 бавляют 3,95 г Н-Глн-Тре(тБу)-Ала-Иле-ГлиONe и 1,07 г N-гидроксисукцинимида, полученный раствор охлаждают в ледяной ванне до 0 С, после чего добавляют 2,07 г твердого дициклогексилкарбодиимида. Раствор на

15 час оставляют при ком!натной температуре, отфиль!ровывают от выделившейся дициклогексилмочевины, в фильтрат добавляют воду, отфильтровывают осевший осадок. Бго промывают простым эфиром и переосаждают из этилацетата,— петролей ного эфира. Образуется порошок с т. пл 187 — 188 С, Пример 3. Н-Асн-Лиз(БОК) -Фен-.Гис-Тре (тБу) - Тир (тБу)-Про-Глн-Тре(тБу) -Ала-ИлеГли-ОН.

1,34 г Z-Асн-Лиз(БОК) - Фен - Гис -КНМН растворяют в 6,2 мл диметилформамида, раствор охлаждают до — 20 С, затем добавляют

1,40 мл 3,0-í. НС1 в диоксане и 0,252 мл. третбутилнитрита. Раствор на 15 мин оставляют при — 15", затем,до бавля!от 0,724 мл К-этилдиизопропилами на, охлаждают до — 20 С и добавляют раствор в 24 мл диметилформамида

1,12 г Н-Тре(тБу)-Тир(тБу) - Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Иле-Гли-ОН, !получен!ного из защищен ного октапептида (см. Пример 2). Раствор оставляют на 16 час при +5 С, потом ynatpuвают и добавляют простой эфир. Образовавшийся осадок дважды обрабатывают простым эфиром. Получе нный порошок отфильтро!вывают, промывают водой до удаления хлорида, растворяют в 70 /о-!ном ацетонитриле и добавлением абсолютного ацетонитрила снова осаждают. Для дальнейшей очистки его подвергают прот!.воточному распределе!нию. 930г полученного продукта растворяют в 110 мл

80 /о-ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 100 л!г Pd/Ñ. Затем фильтруIoT, фильтрат упаривают, добавляют ледяную уксусную кислоту и лиофильно высуши!вают.!

Пример 4, Z-Tpe - (тБу) - Тир (тБу) - Тре (тБу) - Глн-Асп (ОтБу) -Фен-Асн-Лиз(БОК)

Фен - Гис - Тре(тБу) -Тир(тБу)-Про-Глн-Тре (тБу) -Ала;Иле-Гли-ОН.

770 мг Z-Тре (тБу) -Ти р (тБу) -Тре (тБу) -ГлнАсп (ОтЬу), Фен-МНКН растворяют в 3,2 мл диметилформамида, слепка мутный раствор охлаждают до — 20 С и добавляют 588 мкл

3,0 — н, НС1 в диокса не н 98 мкл трет-бутилнитрита. Раствор оставляют на 15 мин при — 15 С, затем добавляют раствор 778 мг описанного в примере 3 продукта в 14 мл диметилформамида и 0,303 мл N-этилдиизопропиламина, размеши!вают полученный раствор

5,5 час !при охлаждении льдом. В течение этого времени добавляют 0,076 мл N-этилдиизопропиламина. Раствор на 15 час оставляют при +5 С, затем медленно выливают в простой эфир, полученный белый осадок растворяют в диметилформамиде и с нова выливают в охлажденную до 0 С 0,02-н-соляную кислоту (в которую на 100 мл объема добавляют

10 мл насыщенного раствора поваренной со10

25!

4 ли) ..Полученный при этом .продукт растворяют в 80 -ном ацетонитриле, за тем осаждают водой при 50 С. В целях дальнейшей очистки продукт переоса>кдают из диметилформа мида простым эфиром, а также из ацетонитрила водой.

Пример 5. Н - Тре (тБу) - Тир (тБу)-Тре (тБу) - Глн-Асп(ОтБу) -Фен-Асн - Лиз(БОК)Фен-Гис - Тре(тБу) - Тир(тБу) — Про-Глн-Тре (тБу) -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МН

755 мг описанного в !примере 4 продукта растворяют в 8 мл диметилформамида, в раствор при комнатной температуре добавляют 139 мг Н-Вал-Гли-Ала-Про-NH, 47 мг Nгидроксисукцинимида и 84 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 18 час при

45 С. Затем раствор медленно выливают в простой эфир, осаждеп!ный белый порошок подвергают противоточному распределению.

233 мг полученного продукта растворяют в

80О/о-ной уксусной кислоте и гидрируют в,присутствии 40 мг Pd/Ñ в течение 18 час при комнатной температуре. Затем фильтруют, упарпвают почти досуха, растворяют в ледяной уксусной кислоте и лиофально выс IIIHBBют.

Пример 6. !

БОК-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер (тБу) -Тре(тБу) !

Цис - Мет - Лей - Гли - Тре (тБу) — Тир (тБу) - Тре (тБу) - Глн - Ас п (ОтБу) -Фен-АснЛиз (БОК) - Фен-Гис-Тре(тБу) -Тир (тБу) -Про1лн - Тре(тБу) - Ала-Иле - Гли-.Вал-Гли-АлаПро-NH>.

171 мг описа!нного в примере 5 докозапе!птидамида и 83,5 мг защищенного декапептида !

БОК - Цис - Гл и-Асн-Лей-Сер (тЬу) -Тре (тБу)I

Цис-Мет-Лей-!Гли-ОН растворяют в 1,16 мл диметплформамида при нагревании, после чего при комнатной температуре добавляют

15,9 мг твердого N-гидроксисукцинимида и

21,4 мг дициклогексилкарбодиимида, затем

3,5 час перемешивают при 45 С. Потом раствор по ка!плям добавляют в 23 мл свободного от перекиси простого эфира, ai полученный в виде осадка белый порошо!к подвергают для очистки противоточному распределению.

Пример 7.

I I

Н - Цис - Гли - Асн - Лей - Сер - Тре-Цис

Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре - Глн - Асп - ФенАсн - Лиз - Фен-Гис-Тре-Тир Про-Глн-Тре-АлаИле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-NHg, Тир"-кальцитонин М. !

50 мг БОК - Цис-Гли-Асн-Лей-Сер (тБу) -Тре ! (тБу) -Цис - Мет-Лей-Гли-Тре(тБу) -Тир (тБу)Трет(тБу) - Глн - Асп-(ОтБу) - Фен-Асн-Лиз (БОК) - Фен - Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу)-,ПроГл!н - Тре(тБу) — Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-АлаПредмет изобретения

Составитель В. Кривцов

Техред Л. Грачева

Редактор Л. Новожилова

Корректор Е. Миронова

Заказ 331203 Изд. № 1610 Тираж 523 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, iK-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Про-NH2 растворяют при 0 С в 1,2 мл концентрированной соляной кислоты, помещают в атмосферу азота и на 10 мин оставляют при 0 С.

Затем замораокивают сухим льдом и при медленном повь1ше нии температуры до 0 С раствор концентрируют в глубоком вакууме.

После добавления 2 мл воды лиофильно высушивают, остаток растворяют в 1 мл воды и, чтобы превратить в ацетат, медленно фильтруют через уравновешенную 0,02-н уксусной кислотой колонку (диаметр=7,5 мм; Н100 мм) слабо основного ионообменника (Мерк

No 11). Затем промывают 0,02-н уксусной кислотой до отрицательной реакции IHa реактив Фолина, к0HLентрируют элюат до 2 мл и лиофильно высу шивают..Полученный таким образом ацстат Тпргг — кальцитонпна М представляет собой аморфный, белый порошок.

Аналогично получают Лей г" "-кальцитоНИН M ЛИЗ11 - АрГ24 — КаЛЬцнтОНИН Ч 1 НС17Лей 9-Глнга - калы1итонин М, Вал -Тиргг-кальцитонин М, Вал"-Лей"" "-кальцитонин М, Дезамино-Лей"" 9-кальцитонин М, Дезамино-Тиргг - кальцитонин М, Дезамино - Вал Лей г " " - кальцитонин М, Лей" " "-Три гкальцитонин М, Вал -Лей""" — Тиргг - кальцитонин M Дезамино - Вала-JIe1412,16 19 Тир- г-кальцитонин М, Лей" - кальцитонин М, Лей 6кальцитонин М, Лей"-кальцитонин М.

Способ получения новых пептидов формулы

СН,— S

4 5 6 )7

R - СН вЂ” СО-Гли-Асн-Лей-Сер-Три-Цис-Х-лей10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Гли - Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Асн-Лиз-Фен20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала - Иле-Гли,-Вал30 31 32

Гли-Ала-Про-NH2 где R — Н, NH2 или ацил-NH, Х вЂ” остаток 1 -метионина, 1 -валина, 1 -норвалина, 1-лейцина, 1-изолейцина, 1-норлейцпна или =-сг-эми номасляной кислоты и где по

15 меньшей мере одна пз аминокислот замещена в положениях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и 24 другой аминокислотой, а именно 1 -треонин"1 -лизином, 1 -тирози 2-1 -лейцином, 1.-фенилаланингв-1 -лейцином, 1 -аспарагинова я кисло20 та"-1 -гистидином, 1 -фенилаланин 9-1 -лейцином, 1 -гистидин20-1 -глютамином, 1 -фенилаланингг-1 -тирозином и 1 -глютамин" - 1 - аргинппом, отл11ча7ощпй1ся тем, что указанные пептиды получают конденсацией известным

25 методом, на пример карбодиимид ным, фрагментов 1 — 10 и 11 — 32 с последующим удалением защитных групп и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитпвных солей или комплексов извест30 .ными приемами.