Способ изготовления антигена для диагностики туберкулеза птиц

Способ изготовления антигена для диагностики туберкулеза птиц

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1

Сс

395084

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистимеских

Реслублик

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

Заявлено 08.Х.1969 (№ 1370515!30-15) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет—

Опубликовано 28.VI11.1973. Бюллетень № 35

Дата опубликования описания 4.XII.1973

Ч. Кл. А 61k 23 00

Государственный комитет

Совета Мииистров СССР оо делам изобретений и открытий

УДК 615.3.36(088.8) Автор изобретения

В. Н. Лапыко

Казахский научно-исследовател ьский ветеринарный институт

Заявитель

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ПТИЦ

Изобретение относится к технологии изготовле ния туберкулезного антигена для прижизненной диатпности ки туоеркулеза птиц.

Известно, несколько способо в изготовления антигена для диагности, » тубе р кулеза птиц с использованием S-фо;.м культуры общих популяций агглютинаб:альных штаммов ми кобактерий тубер кулеза, выращиваемых на различных питательных средах. Однако культивирова ние м и кобактерий тубер|кулеза этими способами на наиболее распространенных плотных питательных средах (яичные, xaipioфельные) ооходится дорого, усложняет промышленное изготовление препарата и ведет к сн иже нию качества его (за счет наличия примеси питательной среды), а при культивировании на обычных жидких питательных средах (натуральных или синтетических) S-фор мы,культур .микобактерий туберкулеза растут в виде осад ка на,дне колбы и дают малый выход, бактериальной массы, а также диссоциируют в R-форму, осооенно на средах, содержащих глицерин, He,поддающуюся гомогенизации известными методами игои способствующие аутоа гглютин ации.

Цель изобретения состоит в изготовлении антигона — специфичного и высокоактивного препа рата со стабильными свойствами для применения его прн серодиагностике.

Поставленная цель достигается путем использования менее подверженной диссоциации (рн длительном культивированин)

Л вЂ” S-формы клоновой культуры микобактерий туоеркулеза, ооладающей стабильной высокой агглютинабильностью и выращиваемой пленкой на синтетической с реле; гомогенизацией антигена до определенного размера его частиц, а также доба вленпем стабилизирующих вещеспв.

Способ осуществляют следующим образом.

Через 10 — 15 дней после выращивания на среде Моделя культуру микооактерпй пересевают на эту же среду и поокубируют в термостате при 38 — 40 С в течение 40 — 45 дней.

Выращен ную культуру проверяют на чистоту (путем окраокп мазков по Циль-Нильсену) и после тщательного встряхивания подвергают обезвреживанию н тех же колбах путем нагревания при 60 С в течение 1 час.

Убитую таким способом культуру ми коба ктерий фильтруют через обеззоленный оу|мажный фильтр, промывая одной порцией физиологического раствора iëîðèñòîãî натрия. Затем

25 фильтр с бактериальной массой помещают на сухой фильтр и отжимают. Эту манипуляцию повторяют до тех пор. пока»e,ïåðåñòàíåò выступать влага на сухом фильтре.

Отжатую бактериальную массу,по двepгают гомогенизацнн. Для этого ее помещают в агатовую или фарфоровую ступку (из расчета 6 — 7 г сырой отжатой бактериалыной массы .на 100 лл объема сту1пки) и ра."т:1рают в течение 2 — 3 час. Во время растирания оактериальную ма ссу периодичеоки (через 20 — 5

30 мин) сос кабливают со стении ступки, пестика и снова .помещают на дно ступе«и. Если бактериальная масса, становится слиш1ком вязкой, то ее слепка увлажняют добавлением песколыких i«aiiieJib жидкости. 10

К концу гомогени заци и,к 6 — 7 г бактер«альной массы постепенно добавляют 60 мл раствора, содержащего 0,4% формалина (c содержа нием 38 — 40% формальдегида), 0,4% г IIIIKQ

После 30 — 40 мин отстаивания взвесь микобактерий осторожно с,llHIBaioT в ценгрифужные пробирки (объемо м 100 мл, диаметроеи 4 сл), а осада к BHîâü растирают 10 — 15 мин, с мы- 20 вают 30 лл,распвора и сливают в те же центр1ифуж ные пробирки. Гомоге низ Iiuiiio влажной ба ктериалыной массы с таким же у1спехом можно,п ровод ить IB фарфор овой шг ровой мельнице (iHaIIIpmviep типа 1 Е-101 ве11герс1кого 25 производства) .

B сосуд емкостью 900 лл помещают 10—

15 г отжатой бактериальной массы и растирают ее в течение 3 — 4 час при вращении сосуда со с коростью 100 — 120 об/мин. Конс истен- 30 ция ба ктериальной массы не долж на препятство1вать свободно му перемещению шариков.

Это достипается добавлением жидкости.

П р и готовл е н ную та(кии о ор а з огм взрыве с ь подвергают цент1рифугиро1ванию в течение 35

30 — 32 мин,при 600 — 700 об/мин. Оставшуюся пену удаляют, Hagосадочную жидкость с содержащимися в ней микобактериями осторожно сливают и используют,в качестве антивена.

Концентрацию МТ в,антигоне доводят до 40

3% путем учета отжатого осадка, оставшегося,после центрифупирова н ия (из расчета на отжатую сырую ба ктериалыную массу), а рН вЂ” до 6,6 — 6,7 (c помощью 1%- ного раст вора углекислого калия или раствора лимонной кислоты та кой же 1концентраци и).

Приготовленный антиген проверяют на гомоген н ость .путем измерения частиц его под м1икрос кэпом с погмощью виHòoBo ãо о1кулярмикроиетра. Для этого антиген разводят 50

1: 15 — 1: 20 раетйо1ром описанного выше состава, гото1вят из hei.o мазки и окрашивают по Циль-Нилысену, Раз1мер частиц не должен цревышать 8 — 10 мк.

Стерильность проверяют путем посева ан- 55 тигена на среду Гельберга, МПЛ и булыон

Китт-Тароцци. Антиген считается стерильным, если МПА и в бульоне Китт-Тароцци в течение 3, а на яичной среде в течение 10—

15 суток (с проведением слепого пересева на 50 пятые сужи после, посева) с момента посева

IIe будет обнаружено никакого роста бактерий.

Активность и с1пециф11чность антп1ена проверяют постановкой РЛ на стекле, применяя для этих целей .грел ку-качалку с сыворот1ками крови (питр не ниже 1: 50) 2 больных и 2 здоровых кур, разведе1;.ым;1 1: 10, и с кровью

l0 бсльных туоергкулезом и 5 здоровых кур.

Лнтиген считается активным и епецифичны11, если с cbiiBoðoTKQH и кровью болыпых туберкулезом кур он дает четко полож11тельную,реакцию в течение 1 лин, а с сывороткой и кроВью aiIopolBbix — отрицательну10.

Проверенный ацтиген расфасовывают зо флаконы объемом 10 лл, закрывают резиновыми пробками и заливают сургучом или обкаты вают металлт1чеокой пластинкой.

При хранениями анти гена,во флаконах образуется осадок серовато-белого цвета, легко разбивающийся при встряхивании и образующий гомогенцую взвесь. Если этого не происходит (для убедительности,каплю а нт игена наносят на предметное стек10 и просматривают на грелке-качалке), то такой флакон с антигоном бракуют.

Хранить а нтиген следует .при 3 — 6 С. Срок его годности 1 год,с момента изготовления.

Замороженный и оттаянный антиген теряет исходные качества и не годится для использования.

Туберкулезный антитан, приготовленный по описанному способу, представляет собой го могенную, се ровато-белого цвета взвесь убитых наг реваБием микобактерий туберкулеза птичьего тила из высо коапглютинабилыного субштамма 235/7 — 3 и пре1д на зна1ен для постановки серологичеоких реакций, среди которых практическое значение для диагностики туберкулеза птиц имеют РА и особенно

ККРЛ.

Предмет .изобретения

1. С пособ .изготовления антигена для диагности1ки туберкулеза, птиц путем механ ического измельчения и последующего центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью повышения активности, специфичности и предотвращения аутоагглютинации антигена, убитую нагреванием ба ктериальную взвесь клоновой культуры микобактер ий туберкулеза, на пример, су бштамма 235/7 — 3 (PiHJIbTpvIO T, отжимают, го могенизируют до размера частиц анти гена 8 — !О мк, доба вляют в жидкую основу препарата поверхностно-активное вещество.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве исход|ного матер нала используют культуру микобактерий туберкулеза птиц с преобладанием R-формы, обладающую эуго1гическим характером роста на синтетической питательной сведе.