Способ получения убихинона-9

Способ получения убихинона-9

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О Il (ЪФ 1 %3ь

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 401180

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ С®ИДИТВДЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву(22) Заявлено11.10.71 (21) 1705684/28-1Э с присоединением заявки №вЂ”

2 (51) М. Кл.

С 12 3 13/10

Гасударственный нюмнтет

Сената Инннютрюю СССР пю делам нзююретеннй н ютнрмтнй (23) Приоритет— (43) Опубликовано25.10.77.Бюллетень ¹ 39 (53) УДК 577.15. .08(088.8) (45) Дата опубликования описания 27,11.77

Н. В. Тарасова, Е. А. Обольннкова, А. Д. Гололобов, Г. И. Самохвалов, С. В. Чепиго, Г. И. Иванова и В. М. Куликова (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (71) Заявитель.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УБИХИНОНА-9

Изобретение относится к микробиологи= ческой промышленности.

Известен способ получения убихинона-9 путем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы и омыления. ее с последующим выделением убихннона-9 иэ неомыленной фракции.

Целью изобретения является одновременное получение наряду с убнхиноном-9 биошрота. !О

Достигается это тем, -что перед омылентеем биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением цри этом бношрота и биолипндов, биошрот удаляют, а полученнные биолипиды омыляют. 15

Кроме того. в качестве продуцентов убихииона-9 используют вид Стйда дт Ял тотт3т, иэ которого берут щтаммы НП-4, Н-542

Предложенный способ осуществляют следующим образом. 20

-Вначале культивируют продуценты убихинона-9. B качестве продуцентов используют культуру вида Сапййа риИ аг лопЖв виде штаммов НП-4 и H-542. Выращивание ведут непрерывным или периодическим способом

2 при интенсивном перемешивании и аэрированнн среды воздухом.

В качестве источника углерода используют фракции парафнновых углеводородов, содержащие Н-алканы с 10-24 атомами yr» лерода, а также нефтяные дистнлляты, содержащие 10-40% комплексообразующих углеводороДов.

Водную минеральную среду используют следующего состава: сульфат аммония, фосфорная кислота, хлористый калий, сернокислый магний и смесь микроэлементов.

Выращивание культуры вида С@ттйдсе рйИтегтпопй1 проводят при интенсивном перемешивании и аэрировании среды воздухом при рН 4-4,5 и температуре 28-36 С.

Биомассу из культуральной жидкости выделяют сепарированием и удаляют нз нее с помощью жирорастворнтелей (гексан, ацетон, петролейный эфир, экстракционный бензин) остаточные углеводороды, липнды и другие вещества. Твердую фракцию отделяют фильтрацией и высушивают под вакуумом, получая белково-витаминный концент401180 з рат-биэшрэт, который удаляют. Затем фильтрат, содержащий растворитель и экстрагируемые им вещества, выпаривают под вакуумом, при этом сухой остаток состоит из смеси липидэв, стерэлов, жирорастворимых витаминов и остаточных углеводородов. При этом убихинэн, обладая липидными свойствами, также находится в этой смеси, которая в дальнейшем называется биожирэм. Выход биэжира сэставляет 5-30% от веса сухой

1О биомассы.

Убихинэн содержится в биожире в количестве 0,05-0,2%.

Выделение убихинона из биожира проводят в несколько стадий. Вначале биэжир эм««««яют метанольным раствором едкого KBли в присутствии пирэгаллола при постояно нэм перемешивании при 90-100 С. Затем отделяют фракцию неомыленных липидов путем экстракции растворителем, причем в качестве пэследнегэ используют серный или пэтрэлейный эфиры или гексан. Далее удаляют раствэритель, экстракт сушат и из него, сэдержашегэ неэмыленные липиды, углеводороды ««другие вещества, выделяют убихи- 5 нэн путем хроматографии на окиси алюминия.

Убихинон выделяюг кристаллизацией из аб сэлютнэгэ этанэла; выход егэ составляет

60-70%о эт веса концентрата.

II р и м е р 1. Культуру вида СапйсЬ д в«И«е«п«оп&«НП-4 выращивают на среде следующего состава (Г/ «) ° (М}} ) РО 03

К((4 4 (Мд- SO 0,25

М аС-е 0,006

Fe.50 0,012

М ««50+ 0,012

Z 50 0,012

Очищенные жид40 кие парафины

1о 24)

Азот (в вице сернэкислэгэ аммония или аммиачной воды) 0,7 при рН 4,0 — 4,2 и температуре 32-36 С.

Процесс ведут непрерывно в опытно-промышленных ферментерах емкостью 750 м с аэрацией и перемешиванием при степени разбавления О, 15 час

Полученную биомассу выделяют сепарацией

У высушивают в распылительной сушилке и экстрагируют бензинэм, Выхэд биэжира 5 эт веса сухой био- 55 массы.

Далее провэдят омыление, для чего помещают 10 мл биожира в колбу, снабженную мешалкэй и соединенную с холодильником, и приливают в негэ 20 мл 10%-ного

Д метанольного раствора едкого кали, содержаI щего 0,2 г пирогмйола.

Процесс омыления ведут в течение 30 мин при 90-100 С. Неомыленную липидную фракцию извлекают, проводя трехкратную экстракцию по 50 мл серным эфиром. Эфирные экстракты сливают вместе, промывают водой до нейтральной реакции и отгоняют растворитель. Затем остаток из колбы переносят на колонку с окисью алюминия П степени по

Брокману (размеры колонки, см: высота 15, диаметр 2, высота слоя окиси алюминия 10).

Элюацию убихинона проводят смесью петролейного и серного эфиров (9:1), общий объем 300 мл. Содержащую убихинон фракцию отделяют в виде желто-оранжевой полосы. Элюат упаривают на роторнэм испаэ рителе при 45-50 С и остаток взвешивают.

Вес остатка 25 мг, содержание в нем. уби.хинона, определенное пэ модифицированному методу Кревена, 22 мг или 2,2 мг на 1 мп биожира.

Затем для получения кристаллического препарата остаток растворяют в 0,5 мл абР сэлютнэгэ этанэла и оставляют на сутки для э кристаллизации при 0 С, причем после одной

««ерекриста «лизаиии выделяют 13 мг убихинона.

Пре««драт имеет следующую ф««з««кэ-.х««ми«ескую х;;: «ктег«««стику; т:.м««ерату}ы ««««авле««и««43,6- 4,4 С; этан J, «(экисленный)

272 «:м; ., ) 80; эт;«нэл (вэсстанэв1./, ленный«2 ;Мэ нм; „„50,5; массо..экт}« . 794; (М+") 796; (М-15) 779; «,«,;х«с г/е - 35 и 197% на тэнкэслэй«««,«х с..л«ка«левых пластинах в системе ацетэнвода (95:5) 0,31; пэлэжение пятен соответствует кристаллическэ«,«у препарату убихинэна- = ", испэльзуемэгэ как метчик.

На оснэвании полученной физико-химической характеристики препарата установлено, что культура Сапйс3а g u tf å«.«ïînô1 }}П-4 при росте на среде с очищенными жидкими парафинами синтезирует убнхинэн — 9.

Пример 2. Культуру вида Сам&««ц с«««И«е««««откол Н-542 выращивают на среде следующего состава (г/л): (И Н ) 5О 087

Н3 PO4 (70%-ная) 1,75

КС1 1,14

Ng .50 .7Н О 0,55

Få6Î+ 7Н О 0045

Mm 5О ° 4Н О 0,031

Z> 50,} 7Н О, 0,033

Си 60 5Н О 0 004

В качестве источника углерода в среду добавляют нефтяной дистиллят из нефти Мангышлакского месторождения в количестве

15%, что соответствует 4% пэ содержанию комплексообразующих углевэдорэдэв.

401 180

Составитель А. Бражникова

Редактор Н. Спиридонова Техрец Н. Андрейчук Корректор А. Кравченко

Заказ 3356/4 Тираж 541 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выращивание культуры проводят периодическим способом в ферментере емкостью

30 л при постоянном перемешивании и аэрации. После сепарации и сушки получают

170 r биомассы, из которой путем экстракции бензином получают 28 мл биожира. Омыление проводят таким же образом и при тех же условиях, как указано в примере 1.

Затем экстракцию неомыпенной фракции проводят петролейным эфиром (фракция 40- pg

-60 С), отгоняют растворитель и хроматоо графически на окиси алюминия выделяют концентрат убихинона, который составляет

32 мг; содержание убихинона в концентрате, определенное по методу Кревена, состав-1s ляет 27,5 мг.

Таким образом, содержание убихинона в биожире, полученном из культур, выросших на среде с фракцией нефтяного дистиллята, составляет 1,1 мг/мл биожира. 20

Из 25 мг концентрата после кристаллизации из абсолютного этанола получают

15 мг кристаллического препарата .с температурой плавления 43,8-44,5 С.

При хроматографическом анализе на се- 25 ликагелевых пластинах в системе ацетонвода в соотношении 95:5 положение пятен вьщеленного препарата соответствует метчику 0 и образцу убихинона-9, выделен9 ного из культур вида опййи gè 66eãòîíé ; зо (-! П-4.

Пример 3. Культуры вида Catvd da ря1ВИе ръопй1 Н-452 выращивают на среде того же состава что и в примере 2, Способ выР

35 ращивания непрерывный, степень разбавле-1 о ния среды 0,2 час нри 30-32 С.

Выделение биожи а проводят из сырых культур путем экстракции ацетоном с последующим переводом жирорастворимых компонентов в гексан. При этом из 170 г дрожжей при их влажности 817, получают 7,5 г биожира. Омыпение биожира, получение неомыленной фракции и вьщеление из нее убихинона проводят так же, как в примере 1.

После хроматографической очистки получают 10 мг концентрата, содержащего

6,96 мг убихинона. После кристаллизации из абсолютного этанола выделяют 4,08 мг убихинона-9.

Формула изобретения

1. Способ получения убихинона-9 путем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы, омыления ее с последующим выделением убихинона-9 из неомыленной фракции, о т л и ч а ю— шийся тем, чтo, е целью одновременного получения наряду с убихиноном-9 биошрота, перед омылением биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением при этом:биошрота и биолипидов, биошрот удаляют, а полученные биолипиды омьияют.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве продуцентов убихинона-9 используют вид Caedida

f è Юймгзпопбт.

3. Способ по пп 1 и 2, о т л и ч а юшийся тем, что из вида Ca d da

gutMieptnwdia используют штаммы НП-4, Н-542.