Патент ссср 403133
Иллюстрации
Реферат
ОПИСАН И Е
ИЗОБРЕТЕН Ия
403I33
Союз Советских
Социалистинеских
Республик
Зависимый от патента Ы
Заявлено 22.11.1972 (¹ 1750701/31-16)
Приоритет 25.II.1971, М 118674, CILIA
М. Кл. А 61k 21/00
С 12с1 9/02
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Опубликовано 19.Х.1973. Бюллетень ¹ 42
У д К 615.779.931(088.8) Дата опубликования описаиия 16.111.1974
Авторы изобретсиия
Ицостранць1
Р. Л. Хамил, В. М. Старк и Д. К. Делоцг (Соедипеш1ые штаты Aiivpiiкп) Иностранная фирма
«Эли Лилли эид Компани» (Соедицеппые Штаты Америки) Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
1,0
3,0
1,5
Изобретение относится к области медицины, к производству яптиоиотиков.
Способ получения антибиотика А-4696, ранее в патецтпой литературе це описанный, заключается в том, что культуру Kctinoplancs
sp. АТСС 23342 выращивают в аэробпык условиях на среде, содержащей источники углерода азота и минеральные соли при температуре 20 — 40 С и при рН 6,5 — 7,8 в те !сппе
4 — 6 jl,!!ей, а из фильтрата культуряльцой жидкости и щслочпогO водного экстракта миIic;III5I выделяют целевой продукт copoIIHollными методами и очищают известпымп приемами.
Аптибиотик А-4696 активен в отношении ряда микроорганизмов и, в частности, подавляет развитие микроорганизмов, вызывающих околозубцые или зубные заболевания, например кариес.
Пример. Культуру Actinoplanes sp. ATCC
23 выращивают на скошенном агаре в течение
6 дней при 30 С.
Агаровая среда имеет следующий состав:
Обжареццая овсяная мука 60 г
Дрожжи 2,5 г
КеНРО4 1,0 г
Барда 5,0 г
Минеральная среда Чапека 5,0 мл
Агар 25,0 г
Депо!1пзпрогаппяя вода 1 л
Миперс!г!ьп IH сред» с1»пека содержит 100 г
КС1, 100 г М О4 (Н»О> 2 г ГсЯО.! 71 I O (ря5 створяется в 2 мл коццецтрировяппой НС!), 1 л д IIOII iiall pOB»1111014 воды.
Суспензисй культуры, смылoi с агярового косяка, ппо! у IIlpsiol 100 мл стерцлсл!Ой cpc;ibl, имсющсli С.1е.ц ющпй cîñò»â (г): глюкоза
10 5,0, декстрин 20,0. соевая ы к» 15,0, 1рож>кевой эксl р !! 1 2,0, угле! пс:li>III кя Iblillii 1,0, Водогlровод11 151 ВО,!» 1 л.
B»ip
48 час, при встрлкпвя!!ии, со скоросгью вря15 щения 250 об/мп!!.
10 !
20 250 oo/ì i ø.
Четыре дссятык мл полученной ку1ь1ур!1,1ьпой жидl ОсTII перс! IОс51т в колоbl, содсржящие по 100 мл ферментной стерильш1й среды, содержащей ьещсс1в», взятые в еле;li IOII!Ilx
25 COOTIIOIIICIII!5IX, О1! .
Декстроза
Декстрпц
Пептои
403l33
Соевая мука 0,5
MgSO4 7Н20 0,2
Черная патока свекольная 1,5 жидкость от замочки кукурузы 0,5
Бетаин 0,1
KJHPO4 0,05
Деионизироваииая стерильная вода 25 л рН среды доводят до 7,5 добавлением 5 и. раствора гидроокиси натрия перед стерилизацией. После стерилизации рН приблизительно
6,9, Ферментацию ведут при встряхивании в течение 96 час при 30"С на круговой качалке со скоростью вращения 250 об/мин. рН в конце ферментации около 7,2.
25 л описанной ферментативной среды с добавкой 0,02О/О антипеиного вещества стерилизуют при 120 С в течение 30 мии, помещают в 40-литровый ферментер и засевают одной сотой миллилитра предварительно полученной культуральной жидкости. Инокуляцию ведут в течение 4 дней при 30 С при аэрации стерильным воздухом в количестве 1/2 объема воздуха к объему среды, пропускаемой за
1 мин и перемешивании со скоростью вращения, необходимой для полного перемешивания пропускаемого воздуха со средой. рН культуральной жидкости постепенно возрастает с 6,9 до 7,2.
После окончания ферментации культуральную жидкость фильтруют. Мицелий промывают 32 л воды. Затем мицелий заливают еще
32 л воды и р Н смеси доводят до 10,5 добавлением 5 и. раствора гидроокиси натрия, перемешивают в течение 45 мии и фильтруют.
Полученный фильтрат и промывную воду сливают с фильтратом культуральиои жидкости и рН доводят до 4,0 добавлением Н,504.
Подкисленную смесь пропускают через угольную колонку с 1 кг активироваииого угля. Колонку промывают до тех пор, пока вытекающая жидкость ие потеряет свою окраску. Активный А-4696, адсорбировапиый на угле, элюируют с помощью 1 /о-ного раствора Н250< в смеси ацетон: Н20 (1:1); элюат, содержащий активный А-4696, обрабатывают насыщенным раствором гидроокиси бария.
Смесь фильтруют и осадок сульфата бария удаляют. Фильтрат, содержащий активный
А-4696, концентрируют и выпаривают под вакуумом. Сухой остаток, заключающий в себе активный А-4696, составляет приблизительно
80 г.
Приблизительно 80 r активного А-4696 помещают в 5 л воды и затем производят обработку 500 г активировашюго угля.
Смесь перемешивают 1 час и затем фильтруют. Фильтрат удаляют. Угольный фильтрованный осадок, содержащий активный Л-4696, промывают 1 л воды и промывочную воду удаляют. Угольиьш осадок еще раз промывают 1 л
0,05 и. водного раствора соляной кислоты и
45 промывочную воду также удаляют. Промытый угольный осадок подвергают элюированию перемешиваиием в течение 30 мии с 500 мл водного раствора соляной кислоты и ацетона (0,05 и. ICI: ацетон=7: 3). Смесь фильтруют и фильтрат оставляют.
Элюироваиие активироваииого угля повторяют четыре раза и каждый фильтрат оставляют. Пять элюатов, содержащих активный
А-4696, сливают. Смесь элюатов концентрируют выпариванием под вакуумом до объема приблизительно 100 мл. К концентрату, содержащему активный А-4696, добавляют
200 мл метанола. К этому водно-метаиоловому раствору добавляют 2 л ацетона. В полученной смеси образуется осадок, состоящий из сырого соляиокислого А-4696. После фильтрации и высушиваиия осадка выделяют 60,9 г сырого солянокислого A-4696.
25 г солянокислого А-4696 растворяют в
20 мл воды.
Раствор соляиокислого А-4696 пропускают через промытый водой слой полиамидиои с»олы, заключенной в стекляшкой колонке (приблизительно 7 60 см). Пропущенный раствор оставляют. Колонку с иолиамидиой смолой промывают водой при скорости тока приблизительно 8 — 10 мл/Mèè, Антимикробную активность пропущенной жидкости измеряют соответствующим методом. Пропущенные жидкости, содер>кащие антимикробиый компонент, смешивают и концентрируют высушиваиием под вакуумом. Сухой ocTBTQK растворяют смесью 25 мл воды и 50 мл метанола. Этот водно-метаиоловый раствор соляиокислого А-4696 подкисляют
5 и. НСI до рН 2,0. К водно-метаиоловому раствору добавляют 1,5 л ацетона для осаждения соляиокислого А-4696.
Смесь профильтровывают и осадок соляиокислого А-4696 отделяют от иее.
Осадок, содержащий соляиокислый A-4696, растворяют в минимальном количестве воды.
Затем к раствору добавляют двойной объем этаиола и смесь нагревают приблизительно до 60 С. Затем смесь охлаждают, полученные кристаллы А-4696 отфильтровывают и просушивают. Выделяют около 9 г кристаллического соляиокислого А-4696.
Предмет изобретения
Способ получения антибиотика, отличааи(ийся тем, что культуру Actinopianes sp.
АТСС 23342 выращивают в аэробиых условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре
20 — 40 С и при рН 6,5 — 7,8 в течение 4—
6 дней, а из филырата культуральиой жидкости и щелочного водного экстракта мицелия выделяют целевой продукт сорбционными методами и очищают известными приемами.