Патент ссср 411125
Патент 411125
Классы МПК
Патент ссср 411125
Иллюстрации
Реферат
! Всесо озн в;пентв, . - ..-=нею
О Й е а аь
Союз Советских
Социалистических
Республик
Зависимое от авт. свидетельства №
М, 1(л. С 12d 13/10
Заявлено 20.И.1972 (№ 1775219/28-13) с присоединением заявки №вЂ”
Приоритет
Опубликовано 15.1.1974. Бюллетень № 2
Дата опубликования описания 1 VII.1974
Государственный комитет
Совета Министров СССР оо делам изооретений и открытий
УДК 577 15 08(088 8) Авторы изобретения
Л. А. Люблинская, Л. С. Яновская, А, Я. Стронгин, E. Д. Левин и В. M. Сгепанов
Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Заявитель
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ЩЕЛОЧНОЙ ПРОЧ ЕИ НАЗБ1 В РАСТВОРЕ, СОДЕРЖАЩЕМ КОМПЛЕКС ФЕРМЕНТОВ
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам определения количества щелочной протеиназы в растворе, содержащем комплекс ферментов.
Известен способ определения количества щелочной протеиназы в растворе, содержащем комплекс ферментов, предусматривающий введение раствора в предварительно приготовленную реакционную смесь, содержащую трис-НС! буфер, хлористый кальций, и субстрат, с последующим инкубированнеM полученнои смеси и введением реагента, останавливающего протеиназный гидролиз субстрата, С целью повьппения точности и упрощения процесса определения количества щелочной протеиназы по предлагаемому способу в качестве субстрата в реакционной смеси используют и-нитроанилид карбобензокси-глицилглицил-L-лейцина, а количество протеиназы определяют по количеству выделиьшегося в процессе гидролиза fl-нитроанилина с последующим расчетом, например, по калибровочной кривой.
В качестве реагента„оса анавливающего протеиназный гидролиз субстрата, используют
2 М цитратный буфер, а рН крис-НС! буфера устанавливают равным 8,5.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Сначала пригот авливают реакционную смесь, содер>кащую трис-! !С! буфер, хлористый кальций и субстрат, и вводят в нее раствор, содержащий комплекс ферментов.
В качестве субстрата в реакционной смеси используют и-ннтроанплид карбобензокси-глицил-глицил-L-лейцина, Далее полученную смесь ннкубируют и вводят реагент, останавливающий протеиназный
l0 гидролиз субстрата, в качестве которого используют 2 М цптратный буфер, при этом рН трпс-НС! буфера устанавливают равным 8,5, (оличес1во протеиназы определяют по количеству выделившего в процессе гидролиза и1 нитроанилина и затем расс итывают по калибровочной кривой.
Способ апробирован в лабо!заторных условиях и поясняется примером его выполнения, Пример. Испытания проводят с оиопра20 зой — препаратом субтнлизина SP so Na garse.
Нерастворимый наполннтель, содержащийся в препарате биопразы, перед испытанием отделяют центрпфугированпем при 3000 об/мин в течсние I0 мин. В надосадочной жидкости
2S определяют концентрацию белка по поглощению при 278 нм, используя коэффициент молярной экстинкцни 11,7, Затем 2 мл 50 мМ трис-НСI буфера при рН 8,5, содержащего 2 мМ СаС!2, помещают
411125
Составитель А. Бражникова
Техред Г. Васильева
Редактор В. Блохина
Корректор Н. Торкина
Заказ 1213/3 Изд. № 1237 Тираж 456 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2 в термостат при 40 С. Через 10 мии добавляют 0,5 мл 3 мМ раствора хромогепного субстрата в диметилформамиде.
Хромогеиный субстрат и-питроанилид карбобензоксиглицил-глицил-L-лейцица получают конденсацией карбобеизоксиглицил-глицица с и-иитроаиилидом У.-лейцина.
После добавления субстрата смесь инкубируют несколько минут при 40 С, после чего добавляют при тщательном перемешивации
0,5 мл раствора биопразы с конечной концентрацией в пробе 10 — 100 мкг/ мл и инкубируют
30 мин.
Затем реакцию останавливают добавлением
1 мл 2 М цитратного буфера рН 5,0.
Контролем определения служит проба, в которую цитратный буфер добавляют перед введением раствора биопразы для подавления активности фермента, При взаимодействии субтилизина с субстратом образуется п-нитроапилин, количество которого пропорциопальпо количеству активного субтилизииа, содержащегося в биопразе.
Количество субтилизина определяют по калибровочной кривой, осью ординат которой служит значение поглощеиия растворов пнитроаиилииа, а осью абсцисс — значение концентрации субтилизина в мкг/мл, определяемое из зависимости поглощения белка при
278 нм от его концентрации, т. е. по поглощению выделившегося и-иитроанилина при
410 нм определяют количество субтилизииа, которому соответствует это поглощепие.
Предмет изобретения
1. Способ определения количества щелочной протеиназы в растворе, содержащем комплекс ферментов, предусматривающий введение раствора в предварительно приготовлеи10 и реакционную смесь, содержащую трисНС1 буфер, хлористый кальций и субстрат, с последующим иикубпровапием полученной смеси и введением реагента, останавливающего протеипазный гпдролиз субстрата, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения процесса определения, в качестве субстрата в реакционной смеси используют и-нитроап карбобензокси-глицил-глицил-У.-лейцица, а количество протеиназы определяют по количеству выделившегося в процессе гидролиза и-и с последующим расчетом, папример, по калибровочной кривой.
2. Способ по п. 1, отл пч а ющ ийс я тем, что рН трис-НС1 буфера устанавливают равпым 8,5.
3. Способ по п. 1, отл и ч а ищи йся тем, что в качестве реагента, останавливающего протеиназиый гидролиз субстрата, используют
30 2 М цитратный буфер.