Патент ссср 415293
Патент 415293
Классы МПК
Патент ссср 415293
Иллюстрации
Реферат
ОПИСАНИЕ 415293
ИЗОБРЕТЕН И Я
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Соаетских
С04иелиютицеских
Республик
Зависимое от авт. свидетельства №
Заявлено 29.05.1972 (№ 1790604 28-13) М. Кл. С 12с 11 26
G Оlп 33,:16 с присоединением заявки №
Гасударственный комитет
Совета Министров СССР па делам изобретений и открытий
Приоритет
Опубликовано 15.1Е1974. Бюллетень № 6
Дата опубликования описания !9Л1.1971
УДК 661.715.(088.8) Авторы изобретения Э. H. Казанцев, Г. H. Максимова, E. В. Щекина и Г. И. Воробьева
Всесоюзный научно-исследовательский институт белковых веществ
Заявитель биосинтеза
*
t !
Ф®4 - .1-:1 " -
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В ДРОЖ)КАХ
Известен способ количественного определения содержания углвводородов в дрожжах, выращенных на углеводородных фракциях ,нефти.
Известный способ состоит в том, что в продукт вводят растворитель, отделяют растворенные углеводороды, заем разделяют углеводороды и растворитель и рассчитываю количество углеводородов, содержащихся в продукте.
Однако известный способ требует значительных количеств дорогостоящих химических реактивов, посуды, оборудования и весьма трудоемок.
Цель изобретения — ускорение и упрощение процесса количественного определения содержания углеводородов в дрожжах.
Для этого по предложенному способу приготавливают суспензию исследуемых дрожжей, измеряют в ней микроскопированнем линсйныс размеры дрожжевых клеток и липидных включений в клетках, затем рассчитывают объемы липидных включений и дрожжеBbIx клеток и соотношение их объемов и по полученным данным определяют содержание углеводородов, например, с помощью градунровочной кривой.
На чертеже показана градуировочная кривая зависимости содержания углеводородов в клетках дрожжей от соотношения суммарного объема включений лнпидной природы в
100 клетках к суммарному объему 100 дрожжевых клеток (%).
Способ реализуется следующим образом.
Пробу дрожжей, например Candid quilliermondii НП-4, выращенных на парафинах, например фракций: С,ю — Спь С1,— Cig, С,з—
С т в ферментерах, колбах, взятую непосредственно нз ферментеров, колб или из прессованной свежей биомассы разводят водой до концентрации порядка 10 клеток/мл с целью приготовления цитологического препарата.
Затем суспензию дрожжей наносят на предметное стекло таким образом, чтобы получить однослойный препарат с отдельно расположенными клетками дров жей по 20—
30 клеток в поле зрения микроскопа.
Препарат помещают на столик микроскопа (например Reicher, Zeisv-Nu МБИ-З, МБИ-6) с фазово-контрастным устройством, обеспечивающим увеличение порядка 1000 раз (например, объектив 100, окуляр 8).
Для точного определения линейных размеров измеряемых включений липндной природы в клетках и линейных размеров дрожжеBbIx клеток используют окулярный микрометр и объект-микрометр.
Готовят 2 — 4 препарата дрожжевых клеток
30 и с помощью микроскопа выбирают 4 — б по41(>" 93 лей зрсш(я, так чтобы обшсе коли fecT«o кл>ток было ис мсисс 100.
Проводят фотосьсмку «I!(i()a»I(1!к прсплрлтов. На фотоси им ка к «п редел ((ют л и исй иы- раз, (сры включении лини!t!io>i ириро (f,f В
КЛЕТКа;(I(If(i!el(I((>te P >33 3teP f 1 ((aej O!; (il l!> I )
По (((j.!fy>!,f(fl(>t 3(линейным p;13мсра,f (с (10мошью таблиц определения ооьемов ио лииейllI-.1М РВЗХIЕРам) Ol)PCJC;I>i!01 ООI.С.;(Ы Вl .>10>1>— ний лииидиой природы в ОО клс !как (по фо(зму.>!е д.af! (jog>egta cфсры) !(00 ь()f1>1 ) ОО дрожжевых клс(ок (1(o формуле дл;! об.ьем.l эллипсоида вра(цсния), затем «i I !исл;>ют cd отношение (,, >) суммарногÎ 0() I ема Вкл!о !сиий at(((fig!to» природы в 100 клетках (. >(км ) к сум (арно(((у объему 100 дрожжевых клеток (мкм ) Ifo форму.(е:
> VJ00><ë >3 I(IIoчгни,> 1»>3»;!I>oii нриро>(К; = > ! J,0 >(()O)I(I(C HI>l (J(.»CTOI( (1e >(— >I acTI> об f>c j, 1 дрож;к(>1)L3» занимаемая вкл(очеииими лини,>iidй (J))I! t>0;(ы (в %).
Если опр«деления про«од;и по мсиьшс ily
КОЛИЧСCT«y КЛЕТОК (ПаИРИМЕР «оО), РС:>У)>ЫГ;1 »» их(с(о! м llьшую тОчиос if>. Соиоса л«ляя с<3«тИОИIСИИ я (% ) Суз»!»(ар ИОГО 0(j f>e Tt a L>lwл!(> I e>ll it I I липидиой природы в 100 клс !клх к суммлриому Об I> (ly 100 дрож>кс()ык IC>JCTOI C, (>I>!II Iми ио опрсдслеии!о угле«();fop«;toi! извесi (ы, спосооом, сос 1 (1«л )иот 1 л> бл и цъ .> и 1>и(.ихl(>(. Гl I
»(СЖДУ СОД(. P>l! «1111(У(ЛСl30,(O)>ОД«13 13 Кл> Т К(13 (% к сухов(у весу) и с«отiloif>(l>i,::jf cy.l ; >((!ОГО 00 f>(". (а !3(с I!oч ll I Ill . I l> I > «, la l(j > I; P 1> 1> «,, I.I 13
1ОО клеткаi к сум)ларио;>у о«> ему !00 д, .Ожжсвы» клсток (c >t. т(10л. 1) .
Зл(3иcих(оcз « .",>с>t(,py co (e, )it! (>IIIIC)I родов в дрож>клк («% к сухому весу) ll сооJ>(to!(lett! суммарного об!>(>3!л вкл(()чс(!»й липиди()й природы в 100 клетках к су 1!f;lpl(0 (>ty oo> c.:(ty 100 Про>к>жсвы;. к,>0701! Il)j(. (стл«лсиа в табл. 1. а блина 1
С(>отн<)шгние суммарного (бъеиа вклк>чеиий лииидной >p»po, (U в 100 клетках к су;>марному объему
100 др(>жже в ь>х и леток> ".„
Содержание углеводородов (в ", к сухому весу), опредглеин(>е извес т>3»>) > с п особом
ПП
2
5
7
9
11
12
13
14
0,20
0,30
0,42
0,83
0,91
1,09
1,23 о0
1,45
1,71
2,!1
4,06
4,13
5,60
6,60
7,40
0,32
0,31
0,42
0,70
0,80
1,01
1,31
1,27
1,41
2,06
1,80
1,90
2,19
2,88
4,04
5,70 Таблица 2 » О
Я О
Ч
С>
A о.
Г(O
O. o ..«O : o
» о.
>>>
<о д 2 „>(з
:О
> о> о .
»
>> о(>
Д ,о <> ад о
ы . » о>- !
50 до 1,, св»330 1 " до 4ч свыше 4 ",, 1 —.:>1
60 — 86
18 — 74
94 — 218
234 †2
3 — 23
22 — 62
89 — 96
105 †1
Ориси)ировочиое определение со,cp;E ания
yÃ)feÂ0äo)joäo J3 В аро>1 "жл х запил! аст ?0—
30 ) f 11(i, П р и е р !.,(>рожжи Ca(lj(!;3 ()и!1).сппоп()(1
60 (1! I >! «и >ill>if 1> лн)г и 00 литрово>и ферм(IITep(,:(лтс!f перс««д:и В,(о:)рсва > ель и через
3,5 Ia(! с(париру(«г, прох(ывают и отбирают пробу су!.Jle!13)!11 д)>о>к>к(3!i, i!oTopyio раз«Валя!от Водой до коицеичрации примерно
65 10 кг(еток>(3(л. Затем готовят 4 цитологичеПо таблице !)лес>пi; !лглют козфф(шиеи r
l>O;>J)e l I!till . >!С;;.:;!j С(>де". :!i >1! ИС .,l уГ.(СВОдор«;1,«!3 !;0 f Cj .",О. !у ьч)су), <)ир«дел«i!!Il.:м ",!l!eCтu лм cll()0000..>I в проба:, 1 соо>пои(синем суммариог«о)ъсмл «клю иий ilillll иой прироВ ОО 1, зет" а" к с лхlìajjt(0>fic объс иу
) 00 лрожжсВ)lк 1 :ic 0((% ), 13 Ti . < ж(проол. :.. (к 0 3 ()> ()> 13 и, и с и т к 0 р р е 1 я и и 1) а В с (! О, 9 6.
Для оирсделс>(и;i сс,, !е)>;клиия углсво>п:po10,!Оп и и,!e!>;aх .(ро>f!;:-,.e! По длпиым тлб,(. 1
" роят г> адуир«во (((у!«кр>и,ую .)лви(им«с)(! с«гсржаии,> у(г>с«одор«дов 13 кл; как дро>кжсll ol с«оi tошe!:,!и cy >I.!В> ного ооъ<=ма вкл о >(. Пий,;1 пи(l!1()il flplfpoi(>(В )00 !(летн а» и су»(к(ар пол(у oi !.сх(100 (j>o«!>f!e«t;;.(t(леток (%) (с. e11е-к). ! )а основании,ct a(!0«ëelllloll закоио.,! plloci!t;(ля более быстрого !)t(p!::!с..>ения с«;ep!! al!11 I УГ,((3>3«дОРОдоl3 13 ())()жжл» Il 3 -! пРс ил20 рл так, со 3epii! a!! > их ОО и. lс! 01:, «и >ул li>!Jo по, (cч>гг ll>filo! ко, ичсст(ю клеf()ê с «ил(он >illfl! j!!l .! >пи !II«JI природы (%), колич(с:«о «клн>чеJlif>I,>иииди(и природы I! клс1 клх (% 1, коif! IсeCj i3u 13к, !1<> Ill>l! !ilillll ill(>li 1!)>lijjo;l! 1;(пахl(I—
25 р«. > б(>, » lll> 1,,км I! 100 клс и Ix, 1Io клжд, il ll 3 II 1!I l(.Ill I »! Х И«К;1 3;1 ГС, < II I IOC, I<. («("I;113 l(Il II>> 1 (1 б>. I ll! I » f . a!311(,и хl(>(1 II )((>к>()> CO (! J> !! c1 ill!e 3! угл(>«о;(«;:>«;lo>3 (% к су>:сл!у «есу), (>пред(>.л(иным !">всст((ым clioc«()«)л, ll )>lljlil пока.)л30 1 (., >i )I I(oj) и(. и I JI)>
»!>с угл!««;I(>р«д(>в в кл<,клх. .1>1>3 И СИ 3(«СТ!> Хl< Ж (у (O (Срж Л 301(о)! ТГЛ С«О;(O) > O Л i > I 3 (>а 1(С » 0 >! >> !3 С С у ), O I I >) д (. Л > ! l I i >l i(И 30/
«(>("1 il!>I,I СГ!Ос(>(>«Х(> II I!O, i! Ii>CÑ! ««3f К, >С! «К С
35 и .-iI(»Ict!!l;13>1l .(и«(t (Ifol ; I>!>l!»О (l,i (%), количсс;! «х! Вк >fo>ieIItift л lti!13!t(>i! прир(>ды (% ), ко,, I l и ((! 1 3 (> 1> (13 <, (> О > i " : ! 1 ! (И 1 I I; (I (!j 1 П Р И Р О 1 1 >l 1 1 - (в
:>(строх(свыше 1 мкм в 100 клс>клх приведlla В T;1>jo. 2.
Таблица 4
Количество включенп(й липпдной природы чил((етроч более 1 (5(кт(0
0
0
1
4
100
3
3
1
5! 95
252
105
Таблица 3
Т, o ао ( A
"o
t4 ttt
lo
O z
o = ( о: —.„
Р
Ж
О; т5
5 о а
И
5"
o -, ((Q) A — .» ая t»
g а
М 5o t" а2
),-(Х т; o
Р
Х з(= o о а (-
ttJ
Д Я
3» (::т
2,8
5,0
4,8
4,6
6,0
5,4
8,49
42,00
48,60
18,90
32,20
32,80
2
4
100
2,4
4,0
4,4
2,8
3,2
3,4
0,52
0,52
0,27
0,52
1
0
0,8
1,0
15,50
1920,4 ских препарата. Для этОГО суспензиlо дрожжевых клеток наносят па предметное стеклo и пакрывают покровиым стеклом, таким ооразом, чтобы получить однослойный препарат с отдельно расположенными клетками.
С помощью фотоиасадки иа микроскоп
Reichert с фазовым контрастом проводят фотосъемку препаратов.
Чувствительность пленки 90 ед. ГОСТ, выдержка 1 сск.
На Jot-octitt)ft< с известным увеличением, определяе.лым ио фотос tttxl«ам обьскт-микрометра, проводят измерение линейных размеров (диаметров) в(:, !Оче()и!! липид:toil природы в 100 кле)кях и линейных размеров (больш, о и меньшую Ocll эллипса) 100 дро?кжсвь1х клеток. По заранее построенной таблице (см. т; бл. 3) определяют объемы Вкл!очеиш1 липи1но,"(природы в 100 клетках и Объемы
100 дрож?кевых клеток.
С помощью счет пой машины cóммиру!от объемы вклк)Пений липидиой природы в
100 клетках — - 110.3)"1310T BC . 1115!H!I ) 1,),0 )1к>1", затем суммируют объемы 100 дрож?кевых клеток — получi! 0) I!(. .)ичи13у 1920,4 мк Р. По найденным величинам определяют отношение суммы объемов включений липидиой природы в 100 клетках к сумме объемов 100 дро?ки<евых клеток (%). Опо равпо 0,81%. По заранее построенному градуировочиому графику определяют, ITo этой величине cooiветс)вуег
COttBP?I<31!iI(3 УГЛЕВОДОРОДОВ В ДРО;К?К ЯХ, PQBиое 0,90% сухого веса дрожжей.
Определение соотношения объемов Включений липидиой природы в 100 клетках к обьс(мам 100 дро?К?кеВых 1<.теTОК приВсдеl!ы В табл. 3.
Соотпошсиис объемов включе п!11 липидиой природы В 100 i<лстках и объемам 100 дров<жевых клето(< составляет 0,81.
Пример 2. Дрож?ки С 113(i!cia <1111! llci
I31oI)c11i НП-4 (8 р;1за) B.:1ращива)от IfPitj)L pt.li3 ным способом в фсрмептере объемом 30 т, Отбирают с:.-;:c; Bèþ дрожжей, сспарируюг, отмыв: о (;; б11;)a .от пробу;13 orlj)e,aeлсиис углеводородов В дрож?кa.;. Для этого дрожЖИ P33B07FIT ВОДОИ ДО КОИЦС11ТРЯЦИИ ПОРЯД!<3
10 клеток (:ië). Готогят 4 питологичеci<èx. препарата, для чсго суспеизию дрожжевых клеток ияпосят 113 пред?:етиос стек,10 if ttaкрывают покровиым стекло;I таким образом, чтобы подучить ол tocëcéííé препа(! T с от10 де 11;i10 pacitoло?1:сllпы.,111 taft t i;a .Iи. 11Я прсп 1P 3T3X ПОДС !;IТL!!) 3!ОТ 1)P(! IIL ltT 1 ., 1Е 5 ОК С 3I< 1 K)ЧЕИИЯ tiff Л1!ППДI!Oii . t )!IРОДЫ, ПРОПСIIТ В!;ЛIОЧ( ний лпп! Дl!Ой lip llpo.l л в лс i <3?:, кол !ес ТВО
ВКЛЮЧЕИП, ) IIÃB П(Ои Прпроды )ПГЯМСтрОМ
15 oo,lьшс 1 1,,! 1< (c 110:tiof! .В.О oi<т л j)!1010 )itfI
О р и с и t l j) 0 B t) (B o c U f с р О е О и р е.тел !111 L c одсржаии,(углегю t,;одоп в дрожж;;х привс20 дено В табл. 4.
Клетк;; с вклю- Кол((честно IL! I I I II XI l I ВКЛЮЧЕН(5!5 липидной attn!(дной прин/и
IIj)l:ðîäIi, -- роды в клетке !
По 5 ао 1 2 t! 3? Од я 1, 1 О сО !Op;;ъa 1.151(5 Г1
ВОДОродов В дро:1: I<:I. < l!j!L Вып!2(. T 4 "ti, КО!!АР О, I b i t o L. o B j I c, с. 1 е ! и е с,) . I L P ? t< a i I t t I > Г, I L ii 1 О Р О д()В д,а .10 1 с lit(и!! 5,0,() От c) :<()Ão Вес 1 дро?кжеи.
Пре,1мс! Изоорстеиия
CI1Gc0o кол!(ч с-венного опрсдслеИ coдср50 жани 1 угле!50д((ро 100 В,дро?к?ках, B151p;!lllспII LtX 112 (. Г, 1(. ВО 10 0 !!I Ь(Х фРЯ К111! Л Х Ilефтl!, О Т, I и ч 2 10!t!, и ii с Я i c 51, i (О, с це.1ьlо Уско))еllии и упрошсl;ия 11potrtccca, пр11Гдтяв, lиВлlот суc1I С НЗ И!0 П С С Л L ДУ L ) Ы Х Д P Î:1< Ж(. И, И 3 . i L P 11 10 T 13
55 ltt ll .,tlil
ДРожжеви1Х КЛ -с К И tllillIДПЫ. . В1;3!Оноltlitt З
К, C) КЯ. :, ЗЯ те l t!BCС (11 i LII3!!Oт (!O ЬС55Ы .1ИИ11, 115 ы Г>1. л О ч с; (1, t t i .1115 0 ж ?к (В ь1: 1< л с т 01< I с <) О . llOlttC II II,. И 0(»,С 5, С В liO П: 5 I(. t! C!I ii) t)f -I,. 1 Ч;1! 1
60 oi pcac,att!ÎT cu,; j!:I
415293
Составитель М. Ларина
1 едз«тор М. 1Чакарова
Текред Е. Борисова
Корректор Е, Сапунова
Заказ 1:!01,7 Изд. ЛЪ 1287 Тираж 456 Подписное
LIHHIIHII Государственного комитета Совета Ь!иипстров СССР
ii0 делам изобретений п открытий
Л!осква, jI«-35, Раушская иаб., д. 4/5
Типографии, ир. Сапунова, 2