Способ получения комплексных полинуклеотидов

Способ получения комплексных полинуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ПАТЕНТУ! щ 421202

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента (2) ) Заявлено 10.05,71 (21) 1657112/31-16 (32) Приоритет 15.05.70 (31) 37896 (ЗЗ) США

Опубликовано 25.03.74. Бюллетень ¹ 11

Дата опубликования описания 14.08.74 (51) М. Кл. С 12k 5/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР во делам изооретений и открытий (53) УДК 615.739.6 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Джордж Петер Лэмпсан, Альфред А. Тптелл, Артур Кирк Филд н Морис Ральф Хнллеман (США) Иностранная фирма

«Мерк энд Компани, И Н К» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН ИЯ КОМПЛ ЕКСН ЫХ

ПОЛИ НУКЛ ЕОТИДОВ

Изобретение относится к области медицины и касается получе препаратов комплексных полинуклеотидов.

Известен способ получения комплексных полинуклео1идов из поли С и поли 1 путем их соединения в чувствительной системе.

Однако препарат, полученный таким способом, обладает повьш1снной токсичностью и пониженной интсрферониндуцирую!цей способностью. .Предлагаемый способ отличается тем, что поли С и поли 1 до соединения или после образования комплекса обрабатывают рибонуклеазой или ультразвуком.

Пример 1. Растворы комплексного соедпIICI11lя полнp!10011нозинов01! Кнслоть! (ПО 1!Ip!1боц11тпдиловая кислота г1„: rC„); объемом приблизительно 200 мл и кснцснтрац11сй

1 мг/мл подвергают при охлаж 10111111 действгпо звукового излучснпч в течение различных Ilcриодов 13рсмецп, используя для этого генера10 тор звукового излучения.

Результаты обработки приведены в табл. 1.

Таблица 1

Относительная чувствительность рибонуклеазы

Продол1кительность звукового излучения, гвин

Средний мол. Ве с

Гипархроматичность

Относительная вязкость

Е (265 мк) Т„, C

820 Ч

7,8Х10

4,2Х10

2,3Х10"

1,2Х10

7,4Х10

5,6Х 10

4,6Х10

2,8Х10

0,5

1,0

3,0

4,0

6,0

12,0

16,0

3,9

2,1

1,7

1,4

1,3

1,2

1,1

1,05

21,1

16,9

13,7

11,1

9,3

8,5

7,9

6,7

63,5

62,5

62,0

62,5

61,5

61,0

60,0

58,5

71,2

70,7

71,7

67,0

67,0

67,0

59,0

49,0

114

117

129

143

147

220

139

139

139

143

145

421202

Таблица 2

Сопротивляемость мышей заражению вирусной пневмонией (PVM) Ипдуцирование пнтерферона в организ-, ме кроликов

Используемое комплексное соединение rl,: rC„

Минимальная эффективная доза, вызывающая сопротивляемость живых клеток заражению вирусной пневмонией мышей, мкг/мл избыточное количество выживших мышей по сравнению с контрольной обработкой

Действие звукового

Доза на одного кролика.

Относительная вязкость

Титр иптерфедоза на одну мышь, Средний мол, вес излучения, рона мкг

:!! и и

ыкг

3,9

7,8Х 10"

:. 640, 320

160, 320

4,0

1,0

0,25

94

0,002 вЂ,004

4,2Х 10"

0,5

2,1

4,0

1,0

0,25

1,7

1,0

2,3Х 10

4,0

1,0

0,25

47

1,4

3,0

1,2Х10

4,0

1,0

0,25

42

1,3

4,0

7,4Х 10

4,0

1,0

0,25

45

4,6Х10

12,0

4,0

1,0

0,25

16,0

1,05

2,8Х10 (640, 320

5, 80

0,008

4,0

1,0

0,25

24

12

Контрольный образец (5, (5

0,0

П р и м ер 2. 1 аядый из частично деполимернзовянных продуктов гI„:гС„ (с относительньгми вязкостями 1,05 — -2,1), .полученных и резулыяте действия звукового излучения ня комплексное соединение г1„: rCÄ. сравнивяюг

Пример 3. Раствор полинуклеотидпого комплексного соединения (г1„: гС„) концентрацией 1 мг/мл подвергают действию ззукового излучения до относительной вязкости 1,3, пропускают через колонку, заполненную

4п е-ной агаровой в виде шаровидных частиц (Сефароза В.), и элюируют сульфатно-соляным буферным раствором (0,006 М фосфата натрия, 0,15 М хлорида натрия, рН 7), используя объем элюата (Ve), избыточный по отношению к объему пор (Vo).

B результате такого хроматографнчсского разделения получают девять отдельных фракций, которые после действия звукового излус пеобработанны vI комплексным соединением

rI„: гС„, имеющим относительную вязкость

3,9.

Рсзульта-!ы опыта приведены в табл. 2. чсния включангг комплексное соединение

rI„: гС„, имеющее средний молекулярньш вес в пределах от 6,0;х,10" до более 10 .

Резулыяты опыта приведены в табл. 3.

Пример 4. Растворы отдельных гомополинуклеотидEIbIx полирибоцитидиловых кислот

rC„(Sw, 20=9,2) подвергают действию звукового излучения в течение 5 — 15 мин, Необра15 ботапная гI„и гС„, имеющая более низкий молекулярный вес, полученная .в результате действия звукового излучения, образуют комплекс с соединением rI„(Sw, 20=9,2).

20 Результаты опыта представлены в табл. 4.

421202

Таблица 3

Активность по отношению к фракции 1

% (сопротивляемость вирусной пневмонии в клетках) Доза на одного кролика, мкг

Титр иитерферона сыворотки кролика

Фракция

Измеренный мол. вес

80, 160

640, 160

320, <5

20, 80

20, 20

<5, 160

<5, <5

<5, <5

Таблица 4

Индуцирование интерферона в организме кроликов (доза на одного кролика), мкг

Сопротивляемость заражению вирусом визикулярного стоматита (доза, мкг/мл) 1

Титр интерферона

Продолжительность действия звукового излучения, мин

Относительная вязкость соединения

rI„:гС„

0,002 — 0,004

3,0

0,001 вЂ,002

1,7

0,002 вЂ,004

1,5

Контрольный (возбудитель отсутствует) с необработанной rI„(Sw, 20=9,2) в эквимолярных количества.:. (Добавление раствора

rI„тотчас же прекращает разложение гС„под действием рибонуклеазы) .

П р и мер 5. Раствор rC„(Sw, 20=9,2), содержащий 1 мг гС„на 1 мл, обрабатывают панкреатической рибонуклеазой концентрацией 0,01 мкг/мл в течение 0 — 30 мин и фракции гС„,,полученные при разложении рибонуклеазой, образуют комплексное соединение

Результаты опыта сведены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты биологического анализа комплекса

rI: rC

Результаты физического анализа комплекса г1,: г С, Вирус визикулярного стоматита в клетках кролика

Время обработки, Минимальная доза, вызывающая сопротивление вирусной пневмонии мышей, мкг/мл

Относительная вязкость

Ег„.

Гипохромициты, % мин относительная активность, о «:Ф,о минимальная эффективная доза, мкг/мл (248 мк) е) Минимальная доза (в мкг/мл), которая защищает не менее 40% обработанных мышей от неизбежного заражения вирусной пневмонией, ЗОЬОее е ) Приводится сравнение с нулевой пробой.

2,5

5,0

7,5

10,5

15,0

20,0

30,0

2

4

6

8

Контрольная

4,1

1,64

1,44

1,31

1,25

1,18

1,12

1,08

>10е

6,4Х10е

4,4Х10е

2,8Х10е

2,0Х 10е

1,2Х10е

1,0Х10

7,0Х104

6,0Х10е

127

131

136

167

179

196

39,7

38,0

35,8

31,5

26,7

20,8

15,3

7,1

2

2

2

2,8

1

4

>16

20, 320

10, 40

320, 640

5, 160

320, 640

160, 640

<5, <5

12,5

0,001 вЂ,002

0, 001 вЂ,002

0,001 вЂ,002

0,002 вЂ,004

0,004 вЂ,008

0,008 вЂ,015

0,03 — 0,06

0,13 — 0,25

13

3,3

0,8

421202

Табл!(ца 6

Компоненты г С,, Компоненты г1„

Относительная активность клеток (сопротивляемость в,!pycttoity заражению визпкуляриым стоматитом), ",,;! ( средний

Svr, 20 мол. ве(. ! среднее количество молекул нуклеотида среднее количество! молекул нуклеотида средний мол. вес

&>>, 20

1,9Х 10"

3,7Х10

2,1 10!

1,7Х10

1,9Х105

1,9Х 10

1,9Х 10

9,2

4,0

3,0

9,2

9,2

9,2

9,2

9 2

9,2

92

6,0

1,9Х10

1,9Х10"

1,9Х10"

1,9Х 10

7,8Х 10

2,1Х 104

1,1Х10

560

< 0,05

20 — 50

Контрольная

1 ..

:>1ен ьш(.

1

Меньше

Таблица 7

Сопротивляемость мышей инфекционному заражению вирусной пневмо!зней

Константа седиментации доза на Количество вь|жившпх мь(шей одну мы пь, ! о>(1 . ь(- Ilo отношению мкг к ооп!ему количеству !

Избыточное количество выживших мышей по отношению к контрольным,, гС,, 19, 20

17, 20

7, 20

9,2

1

0,25

9,2

88,3

78,3

78,3

1

0,25

3,0

16, 19

17, 20

5,20

9,2

87,5

78,3

68,3

8, 20

5;20

2 20

1

0,25

9,2

3,0

33, 3

18,3

3,3

3>0 4

6 20

5 20

1,20

3,0

23,3

18,3

0,25

Контрольный

4j60

Пример б. Гоз!Опол!!меры различных молекулярных весов г1„и гС„синтезируют посредством регулируемой ферментативной ï»IHIt(.pH33 llHH дифосфата инозина и днфГсфата питиди(га, соответственно, испо. ьзуя в качес- вс катализа гора полинуклсотидн кз фосфоПример 7. 1(, 250 мл раствор l> содсржяпего 1 мг>мл t C„(Sw, 20 — 9,2) !i ф»сф:Ii!!осо 15! II»II буферном ряс гворс, состоящем 113

0,00б М фосфята, 0,15 M хлоридя натрия»itcющегÎ рН 7,0 добавляют 0,1 м". раствора, со.с.ср5кящсH0 0,25 tiH - !IHIIHp(IHI !t Iccкой ри loll% I(,"еазы Л. Этот раст!зор тщательно псреме;пинаютт и подвергя!От фсрментативной обработке в течение примерно 90 мин, B резуль:-тс чего получают соединение rC„(Së> 20 — 2>5). Пр-1. ерно 250 мл раствора, содержяп,-.r» 1 0!7 . "л высокомолекулярного гомополимера г1„в фосфатно-соляном буферном растворе добавляют непосредственно к раствору рязлот(ивШЕГОСЯ ПОЛИМЕРа ГСп (СОДЕР>иаЩСГО ЭНЗИМ р i1 1 а 3 у. П О,.I x ч е н! 1 bi c в p c 3 > л ь я (. меры i1„ i гCÄ pa3личных молекулярных весов образуют .(омп ">åêc, iûå соедине11ия в эквимоля 11ы(количеспзах с выcoêОмолекуляр:1ы5 м I 11Г>ли .,!с1зат!и I С;, и Г1п, coo l вс с! В(".! .Io.

1 C> IbTII I i>I Olil ITH сведен!1 H яб т» H 7, рпбону;(леязы), и тщательно перемепшвают, 1! П с.1",, ь 1 tl I с 1 с го» I с I I> () l>1 cT p О О с л !1 бл Я с! с 5!

IIктИВ110СТ1> рИОО!1 „ кче(IЗЫ И 061>ь13у(! Ся козl

10 г!лскснос cîc5(HI.*åiiHå г1,,-. и p 13ложив:пегîc51

1С». К раствору, содержащему комплексное сведиl:åïèå г1„разложившийся гС„, д»бавлiiют 111011:!ые обьемы охлажден(»г» (д»

20 С) аосол1от11ого этанола, и 3!у смесь BLI15 держивают в "ечепие приолизительно 15 час при температуре — 20"-С, осадок отделяют (снтриф(-прова Hcit, промывают 200 мл этан» а It высушивают, в результате чег» полу lHCTCH lip H0ëÈçèÒÑËÜÍ0 500 ltil COC3HHCIIH5 .

20 г1„: разл»живппн .ся гС„в виде белой волокiii.стой массы.

421202

Таблица 8

Защита мышей от инфекционного заражения вирусной пневмонией

Токсичность

Комплексное соединение высоко молекулярного г1„ с одним из следующих соединений число выживших мышей по отношению к обработанным число выживших мышей по отношению к обработанным избыток вышивших мышей по сравнению с контролем, % приблизительно

1-050, !к/к! общая доза на одну мышь, мкг общая доза

r1„: г С„ на одну мышь, мкг

Разложившийся r С„

15/20

16/20

8/20

1

0,25

30,4

20/25

25/25

25/25

25/25

1

0,25

Высокомолекулярный r С„

20/25

25/25

25/25

25/25

4,65

1

0,25

0,5

0,25

0,125

0,063

13/20

16/20

9/20

Контрольный раствор (фосфатносоляной буферный раствор) 3/60

Составитель Т. Головина

Техред А. Камышникова

Корректор М. Лейзерман

Редактор II,. Пинчук

Заказ 1813/15 Изд. № 664 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская паб., д. 4!5

Типография, пр. Сапунова, 2

Эту волокнистую массу (в количестве примерно 500 мг) растворяют в 100 мл фосфатносоляного буферного раствора, и добавляют к ней 0,1 мл 0,1 М раствора МдС1з (конечная концентрация 0,01 М МдС12), в результате чего получается раствор, содержащий примерно

5 мг/мл комплексного соединения rI„: гС„.

Способность этого соединения, содержащего

Следует отметить, что по сравнению с высокомолекулярным комплексньгм соединением г1„: гС„ комплексное соединение г1„ (разложившийся гС„) сохраняет неизменную невоспреимчивость к заражению вирусной пневмонией мышей, но значительно снижает токсичность. Данные, рассчитанные по LDq!!, показывают значительное преимущество примерно в 6,5 раз (в отношении токсичности) комплексного соединения г1„(разложившийся гСп по сравнению с высокомолекулярным комплексным соединением), в то время как активноразложившийся гС„защищать мьццей от инфекционного заражения вирусной, пневмонией по сравнению с соединением г1„: гС„, полученным при использовании высокомолекулярных

5 гомополимеров как гIпч так и гСп, а также сравнительные токсичности этих двух комплексных соединений, приведены в табл. 8. сти этих соединений как возбудителей интер10 ферона почти одинаковы.

Предмет изобретения

Способ получения комплексных полинуклc отидов путем соединения поли С и поли 1 в

15 чувствительной системе, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности и повышения интерферониндуцирующей способности, поли С и поли 1 до соединения или после образования комплекса обрабатывают рибо20 нуклеазой или ультразвуком,