Патент ссср 433206

Патент ссср 433206

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОЛЙСАИМЕ

HЗО5РЕТHй WЯ (11), 433206

Союз Советских

Социалистических

Республик (Gl) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 09.06, 72 (21)I794565/30I5 (51) М Кл.

С Т2к I/04

С Х2к 5/00 с присоединением заявки Л/- —

Государственный квинтет

Совета Министров СССР ео делаи изобретении и открытий (32) Приоритет—

Опубликованй 5е Ж74 Бюллетень Л" 23

Дата опубликования описанияМ, 10, Т (. (Ьз) чдк 6I9:576. .8.097.2:576. ,876.72(088.8) (72) Авторы Юе А е МАЛАХОВУ Ие А е ЛОГИНОВ А е Не ШУПЛИКО е Ие Be ЗВ П ИН е изобретения Г,ф.ДЕНИСЕНКО,А.М.КОСИК(.)В и H,Н.ГУПИ (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ДЛЯ

ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА

2 рН 5,5-5,5 добавлением лимонной кислоты, l

Изобретение относится к спосо-! бам получения диагностических препаратов, используемых в ветеринарии для серологической диагностики инфекционных болезней.

Известные способы получения антигенов, включащие вырецивание микроорганизмов на альбуминовои питательной среде, обработку культур формалином, осаждение, очистку, например дйализом, и высушивание, не позволяют получить достаточйо активных и специфичных антигенов в необходимом количестве.

Аля получения специфических и активных антигенов после обработки культур формалином лептоспиры осаждают белком среды, который переводят в состояние rom действием трихлоруксусной кислоты с последующим сублимационным высушиванием осажденной массы, а пе ред высушиванием устанавлйвают

Способ осуществляют следующим б образом.

Берут эталонные штаммы (или их аналоги) лептоспир семи сврологических групп и готовят из них моно- и полиантигены (см. таблицу).

Перечисленные группы лептоспир взяты с учетом этиологической структуры лептоспироза, у сельскохозяйственных животных в Советском Союзе. При необходимости антигены могут быть приготовлены рекомендуемым методом из лвптоспир любых других серологичвских групп.

Полиантигены готовят в следующих сочетаниях:

I антиген: помона и тарассоВи, 433206 эталонные штаммы

3.

П антигон: гебдомадис и гриппотифоза, Ш антиген: иктерогеморрагия, каникола и батавия.

Аля приготовления полиантигенов культуры лвптоспир соответствующих серологических групп с одинаковым накоплением бактериальной массы смешивают в равных соотношениях и обрабатывают по методике, принятой для изготовления моноантигенов.

Выращивают лептоспиры на альбуминовой среде ГНКИ ветеринарных препаратов МСХ СССР при 2 (28 С в течение пяти-семи дней до максимального накопления бактериальной массы, но не менее I00 мл о микробных тел в I мл среды. Goдержание альбумина в среде0,2 г /.

Непригодны для получения антигенов культуры, загрязненные постороннеи* микрофлорой, не типичные по морфологии, лизирующиеся, с признаками самоагглютинации. зо

Серогруппы лвптоспир å å

Са.ei eo 8а.

Ролана Ыор о ррАоза.

3 ЕРй алии ;У

3a/a z ia.е

Ь а=ио ж в) на центрифуге сепараторного типа при скорости вращения ротора до I5000 об/мин производительность до 50 л/час.

Центрифу гирование проводят при I-5 Ы.

Осадок разводят дистиллированной водо" в 20-25 раз в зависимости от концентрации лептоспир в исходной культуре и помещают по

I00-200 мл в диализационные veшочки. для диализа используют

Вольфенскую вискозную кишку производства 1 ДР.

Культуры проверяют на чистоту и интенсивность роста путем просмотра баллонов в проходящем свете и раздавленных капель в темном поле микроскопа.

Охлаждают отобранные культуры до I-5 С. добавляют нейтральный формалин до концентрации 0,25/. (в пересчете на 40/-ный формальдегид), псремешивают и выдерживают в течение I8-2Ì час при 1-5 С.

Приливаю к формалинизирован ноИ культуре при постоянном перемешивании насыщенный раствор трихлоруксусной кислоты до 2,5 -ной концентрации в среде.

Отделяют осадок от надосадочноИ жидкости центрифугированием при одном из следующих режимов: а) на центрифуге с угловым ротором при 5000 оо/мин в течение 5 мин;

6) на центрифуге с горизонтальным ротором при 5000 об/мин в течение 5 мин;

Диализ ведут в проточной воде при I-l0 С в течение трех-четырех суток до перехода альбумина в состояние золя при рН 5,54,5 и последующего выпадения в осадок в изоэлектрической точке при рН 4,7-+-,8. .опустимо смещение рН до любых значений в пределах 4.,5-7,0. добавляют к полученной после диализа массе по каплям 10о-ный раствор лимонноИ кислоты до установления рН 3,3-5;5, Испытывыот приготовленные моно- и полиантигены на активность

433206

15

55

5 и специфичность с агглютинируюп1ими групповыми сыворотками в реакции макроагглютииации на стекле и на самоагглютинацию - с физиологическим раствором.

Уоноантигены считают активными, если го:,:олог1!чная cblacрpотка с титром до I:I0000 не разведенная и разведенная I:5 и раскапанная по 0,04, 0,02, O,OI и 0,005 мл вызывает во всех случаях агглютина цию не менее, чем на три креста.

Специфичность антигенов проверяют с гетерологичными лептоспирозными сыворотками. Антигены из лептоспир серологическ1 х групп тарассови, гриппотифоза, батавия и гебдомадис не дают перекрестных реакций. допустима агглютинация, как и в реакции микроагглютинации-лизиса, у антигена помона с сывороткамй каникола и иктерогеморрагия, у антигена иктерогеморрагия — с сыворотками каникола и у антигена каникола с сывороткои иктерогеморрагин. Агглютинация в этих случаях наступает в первых

I-3 каплях неразведенной сыворотки при активности реакции в I-3 креста.

Для исключения самоагглютинации каплю антигена смешивают с каплей физиологического раствора.

В этой смеси не должно быть хлопья и зернистости.

Полиантигены считают активными, если каждая из гомологичных сывороток к лептоспира11, входящим в состав антигена, раскананная по

Q,04 и 0,02 мл, агглютинирует полйантиген на 2-3 креста в обеих каплях.

Препарат, признанный активным и специфичным, разливают в ампулы по 2 мл и высушивают методом сублимации по следующим режимам: замораживают нтиген до минус 40 — минус 45 С и выдерживают заданную температуру в течение.

2-3 час; у с танав ли вают вакуум в 100мк рт.ст., включают подогрев и выравнивают температуру на всех этажах кам!- Ры; повышают температуру в камере в течение каждого часа на 2-3 С

3О

6 до температуры !»!!".нус I00Ñ на от k ë " l„",с L» До IO О. и на 2-3 С От I0 до 25ОС. досушивают при 25 С в течение 2 час.

Проверяют высушенные антигоны на активность и специфичность по той же методике, что и перед сушкой.

Хранят антигены при 0-IO С. о

Срок годностli препарата при соблюдении условий хранения не менее одного года.

1 етод;1;;а постановки и учета р еакци и с ле дующая.

Растворяют сухие антигены физиологическ -м раствором. Быораковыва!ат ампулы с неполностью растворившимся препаратом или содЕржащие хлопья.

Ставят реакцию при комнатной температуре на стеклянных пласт.. х с квадратами 9-I6 см .

Исс71сдуе!»у 0 сйворотку раскапывают в три квадрата по 0,L4 мл и добавляют к каждой кайле по 0,04- мл полиантигена. Сыворотку с полиантигено!! сме ивают стеклянной палочкой, а затем покачиванием стекла.

Учитывают реакцию в проходящем свете используя осветитель типа О, i-Л. Оценивают реакцию в крестах по четырехбалльной системе.

Ha;«äóko сыворотку, вызвавшую агглюти1-:ацию полиантйгена, исследуют с моноантигенам!!, входящими в состав данног0 полиантигена, по той же методике. Пр необходимости оп 07е л;! ть ти p сыворотки неазведен!4ую и разведенную I:5, :25 и I:125 сыворотку раскапйвают по 0,04-, 0,02, 0,0I,i 0,005 мл и добав7!яют к каждой капле по

0,04- мл антигена.

Учитывают реакцию в срок до

IO мин. Агглютинация не менее чем на два креста свидетельствует о наличии лептоспирозных антител в исследуемой сыворотке. для постановки диагноза досlàòî÷íî выявления антител в первой капле.

1i0 реакпии макроагглютинации можно исс71едОВать свежие и NGH08p

Вированные фенолом ил!! оорной кис лотой сь1воротки.

Составитель @е 1 аЛВХОВ

P„.дакторДфПИЕЧУК ТехРеДЕ ОРИ:О >Д КоРРектоР Л.ЦсЦ)ЬКОВ Г

„„,ЬВчс

Р1зд. ¹ 6 1 ТиРаж

Подписное

Ц11И11!1И Государственного комитета Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий

Москва, 113035, Раушская наб., 4/л

Предприятие <Патент», Москва, Г-59, Бережковская наб., 24

i 532(- и

ПРЕ;цМЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯ тигенов, после обработки культур формалийом лептоспиры осаждают

I. Способ получения антигенов белком среды, который переводят в для дйагностики лептоспироза, вклю- состояние геля действием т и л чающий выращивание микрооргайизмов уксусной кислоты с последующим на альбуминовой питал ной среде, 5 сублимационным высушивандем осажобработку культур формалином, осаж- "денной массы дение, очистку, например, диализом, 2. Способ по п., отл, ча и » и сублимационное высушивание, от- .ся тем что перед вы,, личающийся тем, что, с целью полу- устанавливают рН 3 3 ) 5

Ф д выстшиванивм чения специфических и активных ан- ыо нием лимонной кислоты е