Способ получения протеолитических ферментов

Способ получения протеолитических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (и) 436853

Союз Советский

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства (22I) Заявлено 23.03.72 (21) 1762279/28-13 с присоединением заявки (32) Приоритет

Опубликовано 25.07.74, Бюллетень № 27

Дата опубликования описания 24.12.74 (51) М. Кл. С 12d 13/10

Государственный намитет

Совета Министров СССР во делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15.08 (72) Авторы изобретения

М. 3. Закиров, С. С. Щелокова, Н. Н. Караваева и О. Хасанов

Отдел микробиологии АН Узбекской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной промышленности.

Известны способы получения протеолитических ферментов путем культивирования их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота..В качестве продуцентов при известных способах используют термофильные грибы, огносящиеся к виду Мисог pusillus, Myriocoe curn

albomyces и др.

Предлагаемый способ позволяет получить более термостабильные протеолитические ферменты.

Для этого в качестве продуцентов используют термофильный гриб, относящийся к виду

Torula thermophila, в частности штамм УзПТ-1.

Штамм Torula ther mophi1 a Уз ПТ-1 целесообразно культивировать на водной питательной среде, содержащей 20% спиртовой зерновой барды и 1,5 — 2% крахмала.

Предлагаемый способ заключается в том, что штамм Тоги1а thermophila УзПТ-1 культивируют на водной среде, содержащей источники углерода и азота при рН среды 5,0 — 9,0, преимущественно 5,2 — 5,5, и температуре 28—

56 С, преимущественно 40 — 50, в течение 2—

4 суток.

В качестве источника углерода в среде могут быть использованы глюкоза, сахароза, мальтоза, лактоза, маннит, глицерин, декстрин, инозит, крахмал.

В качестве источника азота может быть использован органический азот в виде пептона, 5 кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатины, казеина, гемоглобина, яичного альбумина.

Пример 1. Штамм гриба Torula thermophila Уз-ПТ-1 культивируют на водной пита10 тельной среде, содержащей 20% (объемных) спиртовой зерновой барды и 1,5 — 2% крахмала при рН вЂ” 5,5 и температуре 45 — 50 С в течение 2 — 3 суток.

Протеолитическая активность полученной

15 культуральной жидкости составила 1,5—

2,5 ед/мл.

Пример 2. Штамм гриба Torula thermophila УзПТ-1 культивируют при рН 5,2 — 5,5, температуре 45 — 50 С в течение 3 — 4 суток

20 на среде, содержащей, г:

КН2Р04 1

xgso, 0,5

КС! 0,5

FcSO4 0,01

25 Крахмал 30

Кукурузный экстракт 20.

Среда также содержит до 100 мл воды, При этом получают культуральную жид30 кость, протеолитическая активность которой

436853

Активность препарата, полученного из 1 л культуральиой жидкости, ед

Выход, % к исходной активности

Выход

Удельная активность (иа 1 мг белка), ед.

Активность на1г препарата, ед.

Белок мг/л г/л

440 10

417 10 а

250

569

6,32

Осаждеиие этаиолом

417

Осаждеиие сульфатом аммония

313

750

0,75

3 по методу Ансона составляет 600 †7 10- на 1 мл.

Из культуральной жидкости протеолитические ферменты могут быть выделены путем осаждения их этанолом в соотношении 1: 4

Способ получения препарата препарата, Из таблицы видно, что хотя выход препарата при высаливании сульфатом аммония и небольшой, активность сохраняется полностью.

Следовательно препарат получается в 8—

10 раз более очищенным, чем при осаждении этанолом.

Культуральная жидкость и ферментные препараты активны в пределах рН 4 — 12. Однако в кислой области протеолитическая активность значительно ниже, чем в щелочной. Максимум при рН 10 — 11.

При 50 С фермент утрачивает активность на 50% за 6 час и на 75% за 24 час. При 56 С активность теряется на 50% за 1 час и на 75% за 6 час. При 60 С фермент инактивируе ся на 50% за 15 мин и полностью за 1 час 30 мин.

При 65 С активность исчезает за 55 — 60 мин (опыты проведены при рН 10). Протеолитические ферменты мезофильного гриба Aspergillus

flavus (Закиров М. 3., Умирзаков Б., 1966) полностью инактивируются в течение такого же времени при 55 С (при рН 4,5).

Характерист ика штамма Torula

thermophila УЗПТ-1.

Штамм выделен из лугово-болотной почвы

Орджоникидзевского района Ташкентской области.

Растет при температуре 28 — 56 С (оптимальная температура — 40 — 50 С) и рН среды

5,2 — 5,5. На среде при рН ниже 5,0 гриб не растет, а при 8,0 — растет, но протеолитическая активность культуральной жидкости постепенно снижается.

На твердой среде Чапека с кукурузным экстрактом (2% ) и крахмалом (3% ) мицелий гриба бесцветный, ветвистый, септированный, диаметром 2 — 5 мк. Спороносные гифы мицелия распадаются на споры. Споры в цепочках шаровидные, гладкие, просвечивающиеся, темно-коричневого цвета. Диаметр их 8 — 12 мк.

Встречаются споры овальной формы размером

7,0 — 9,0)(10 — 12 мк. Колонии через 2 суток с белым воздушным мицелием, затем чернеют и через 5 — 7 суток становятся агатово-черными. или высаливанием сернокислым аммонием при

70%-ном насыщении.

Выход и активность полученных препаратов представлены в таблице.

Среда Чапека с пептоном (1%). В двухсуточной культуре колонии белые, пушистые, кольцевидные, на третьи — четвертые сутки от кольца диаметром 2 — 3 см мицелий «разбро10 сан» в виде тяжей по всей поверхности питательной среды в чашке Петри. На пятые — седьмые сутки колония становится черной.

Среда Чапека с пептоном (1% ) и крахмалом (3% ) — (сахароза исключена). Через

15 двое — трое суток колонии бесцветные, кожиетые, выпуклые, вросшие в агар. На пятые— седьмые сутки колонии становятся черными.

Края колоний неровные, поверхность бугристо-морщинистая, бархатистая.

20 С у с л о — а г а р. Через сутки начинается почернение мицелия, и в семисуточной культуре мицелий становится агазово-черным, бархатистым.

На жидких вышеуказанных средах гриб образует на поверхности черную пленку и рыхлый мицелий в толще среды. На пшеничных отрубях растет медленно. Через 8 — 10 суток отруби становятся черными.

В качестве источника азота гриб использу30 ет органический азот в виде пептона, кукурузного экстракта, дрожжевого автолизата, желатина, казеина, гемоглобина, яичного альбумина. Наилучший рост гриба и биосинтез его протеолитических ферментов наблюдается на

35 среде с кукурузным экстрактом, слабее на среде с пептоном или дрожжевым автолизатом и еще слабее на других источниках азота. Очень слабо растет на средах с минеральным азотом.

В качестве источника азота использует глю40 козу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, глицерин, декстрин, инозит, крахмал, Слабо растет на среде с арабиновой, раффиновой, р а ми озой, дул ьцитом и сор битом.

Предмет изобретения

1. Способ получения протеолитических ферментов путем культивирования их продуцен436853

Составитель П. Полянская

Техред 3. Тараиенко

Корректор А. Дзесова

Редактор А. Бер

Заказ 3460/8 Изд. № 85 Тира>к 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва. Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 тов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением ферментов из среды, отличающийс я тем, что, с целью получения термостабильных ферментов, в качестве продуцентов используют грибы Torula thermophila, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из грибов Torula thermophila используют штамм УзПТ-1.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что штамм Torula thermophila УзПТ-1

5 культивируют на водной питательной среде, содержащей 20% спиртовой зерновой бавды и 1,5 — 2% крахмала.