Способ получения о-дифенолоксидазы

Способ получения о-дифенолоксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (1ц 436854

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СОюз СОВетских

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 04.04.72 (21) 1768525/28-13 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 25.07.74. Бюллетень № 27

Дата опубликования описания 24.12.74 (51) М. Кл. С 12d 13/10

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53 ) УДК 576.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. Н. Пруидзе и М. А. Бокучава (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-ДИФЕНОЛОКСИДАЗЫ

Изобретение относится к ферментной промышленности, точнее к способу получения о-дифенолоксидазы, играющей важную роль в метаболизме клетки чайного растения, а также в формировании таких качественных показателей чая, как вкус, цвет настоя и частично аромат.

Известен способ получения о-дифенолоксидазы, предусматривающий измельчение сырья, экстракцию фермента, удаление из экстракта нерастворимых частиц, например, фильтрацией, осаждение фермента, например сульфатом аммония, отделение полученного осадка, например, центрифугированием, растворение осадка в буферном растворе, пропуск раствора через ионообменники и элюцию фермента с ионообменника.

Предлагаемый способ позволяет получить изоферменты о-дифенолоксидазы из чайного растения.

Достигается это тем, что из измельченного сырья удаляют фенольные вещества, экстракцию фермента осуществляют буферным раствором, содержащим аскорбат натрия, теграборат натрия и хлористый натрий, рН не ниже 6,0.

Для экстракции фермента в качестве буферного раствора используют глицинатный буфер при значениях рН 9,0, в котором содержание аскорбата натрия, тетрабората натрия и хлористого натрия соответственно составляют (в молях): 0,03; 0,05 и 1,0, а для растворения осадка в качестве буферного раствора используют 0,1 М цитратный буфер при рН

5 не ниже 50. При этом элюцию фермента с ионообменника целесообразно осуществлять буферным раствором с ионной силой 0,5, а осаждение фермента — из экстракта или сульфатом аммония при 100% -ном насыщении, 10 или ацетоном при соотношении 1: 4.

Для получения гомогенных изоферментов о-дифенолоксидазы элюаты дополнительно хроматографируют на колонках с гидрок=илаппатитом и амберлитом, а жидкую фазу, по15 лученную после отделения осадка ферменга, можно использовать для выделения танинокатехинового комплекса, Пример 1. Сырье (чайный лист) измельчают в замороженном виде до максимального

20 разрушения клеток, а затем удаляют фенольные пигменты, смолы и другие вещества путем осаждения 80%-ным ацетоном (соотношение чая к ацетону 1: 4) или экстракцией измельченного сырья поликапролактамовым по25 рошком (капроном) в количестве 2 г на 1 г сырья в зависимости от содержания фенольных веществ в материале.

Белки из обработанного материала эксграгируют буферным раствором при значениях

30 рН 6,0 и выше, содержащим аскорбат натрия, 436854

Составитель М. Ларина

Текред 3. Тараиеико

Корректор А. Дзесова

Редактор А. Бер

Заказ 3460/9 Изд. кГ 85 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4i 5

Сапунова, 2

Типография, пр. гетраборат натрия и хлористый натрий, например глицинатным буфером при рН 9,0, содержащим 0,03 моль аскорбата натрия, 0,05 моль тетрабората натрия и 1,0 моль хлористого натрия.

Полученный ферментный раствор отделяют от нерастворимых частей центрифугированием или фильтрацией. Из раствора полностью выделяют альбумины, глобулины и другие белки. путем осаждения их сернокислым аммонием (100%-ное насыщение), ацетоном или другим осадителем, существенно не влияющим на активность о-дифенолоксидазы.

Таким образом получают суммарный препарат ферментных белков.

Затем осадок гомогенизируют буферным раствором при рН 5,0 и выше, например 0,1 М цитратным буфером при значениях рН 6,0.

Элюирование проводят в течение времени, необходимого для полного извлечения о-дифенолоксидазы, например до 5 мин.

Ферментный раствор отделяют центрифугированием и обессоливают.

Для разделения и получения отдельных изоферментов выделенный суммарный препарат о-дифенолоксидазы хроматографируют на колонках с ионообменником КМ вЂ” целлюлозой или ДЭАЭ вЂ” целлюлозой. Элюцию изоферментов осуществляют с увеличением ионой силы буфера до 0,5. Градиент ионой силы устанавливают добавлением к буферному раствору хлористого натрия. В результате получают до восьми изоферментов о-дифенолоксидазы. Их обессоливают и сушат одним из известных способов, например лиофилизацией.

Для получения томогенных изоферментов о-дифенолоксидазы их дополнительно хроматогра фируют на колонках с гидроксилаппатитом и амберлитом.

С целью рационального использования сырья из того же исходного материала выделяют танино-катехиновый комплекс (витамин P), отдельные катехины и кофеин. Для этого из полученной ацетоновой вытяжки перегоняют ацетон, а из остатка выделяют танино-катехиновый комплекс, отдельные катехины и кофеин одним из известных способов.

Пример 2. Сырье измельчают в замороженном виде до максимального разрушения клеток и затем экстрагируют из него белки и фенольные вещества буферным раствором при рН 6,0 и выше, содержащим аскорбат натрия, тетраборат натрия и хлористый натрий, например глицинатным буфером при рН 9,0, содержащим 0,03 моль аскорбата натрия, 0,05 моль тетрабората натрия и 1,0 моль хлористого натрия. Ферментный раствор отделяют от осадка центрифугированием или фильтра10

55 цией. Для удаления фенольных веществ раствор пропускают через колонку с сафадексом

Г-25 или Г-50, а белки из раствора осаждают ацетоном (соотношение раствора к ацетону

1: 4) или другими осадителями, существенно не влияющими на активность о-дифенолоксидазы. Последующие операции проводят аналогично примеру 1.

Предмет изобретения

1. Способ получения о-дифенолоксидазы, предусматривающий из мельч ение сырья, экстракцию фермента, удаление из экстракта нерастворимых частиц, например, фильтрацией, осаждение фермента, например, сульфатом аммония, отделение полученного осадка, например, центр ифугированием, растворение осадка в буферном растворе, пропуск раствора через ионообменники и элюцию фермента с ионообменника, отличающийся тем, что, с целью получения изоферментов о-дифенолоксидазы из чайного растения, из измельченного сырья удаляют фенольные вещества, экстракцию фермента осуществляют буферным раствором, содержащим аскорбат натрия, гетраборат натрия и хлористый натрий, рН не ниже 6,0.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора для экстракции фермента используют глицинатный буфер при рН 9,0, в котором содержание аскорбата натрия, тетрабората натрия и хлористого натрия соответственно составляет (в молях)

0,03; 0,05 и 1,0.

3. Способ по п. 1, отлича ющийся reM, что для растворения осадка в качестве буферного раствора используют 0,1 М цитратный буфер, рН не ниже 5,0.

4. Способ по п. 1 — 3, отлич а ющийся тем, что элюцию фермента с ионообменника осуществляют буферным раствором с ионной силой 0,5.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение фермента осуществляют из экстракта сульфатом аммония при 100%-ном насыщении.

6. Способ по п. 1, отлича ющийся тем, что осаждение фермента осуществляют из экстракта ацетоном при соотношении 1: 4.

7. Способ по п. 1 — 4, отличающийся тем, что, с целью получения гомогенных изоферментов о-дифенолоксидазы, элюаты дополнительно хроматографируют на колонках с гидроксилаппатитом и амберлитом.

8. Способ по п. 1, отлича ющийся тем, что жидкую фазу, полученную после отделения осадка фермента, используют для выделения танино-катехинового комплекса.