Патент 438683

Способ получения лактатдегидрогеназы

 

0 П И4А Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

It t) 438683

Союз Советскии

Социалистическими

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 07.06.72 (21) 1810035/i28-13 с присоединением заявки Уе (32) Приоритет

Опубликовано 05.08.74. Бюллетень Хе 29

Дата опубликования описания 28.01.75 (51) М, Кл. С 12d 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР ла делам изааретенит и атнраттий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

А. М. Ирген и А. Ф. Лидере

Латвийский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических веществ с< ИРЕА» (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способу получения лактатдегидрогеназы, применяемой в области биохимии для исследовательских работ, а также в медицине для определения молочной и пировиноградной кислот.

Известен способ получения лактатдегидрогеназы путем культивирования Escherchia

coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при рН 7,2 в аэробных условиях с последующим отделением биомассы и выделением из нее фермента.

Предлагаемый способ повышает выход и активность фермента.

Достигается это тем, что из Escherchia

coli используют штамм ВКМв-125, а в качестве источника углерода и азота применяют дрожжевой и мясной экстракты.

Целесообразно использовать дрожжевой и мясной экстракты в соотношении 1: 1, а из солей — хлористый натрий, хлористый магний, двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, хлористый аммоний в количествах соответственно равных, в г:

1 0,0; 0,2; 12,5; 5,0; 0,5; 0,5.

Культивирование осуществляют при температуре 28 — 32 С, Лактатдегидрогеназу получают путем культивирования Escherchia coli на питательной среде с добавками дрожжевого и мясного экстрактов в соотношении 1: 1, служащих добавочными источниками азота, фосфора и углерода, а также стимуляторами роста. Из Escherchia coli используют штамм

ВКМв-125, обеспечивающий высокую активность фермента, значительный выход биомассы с длительной сохранностью препарата.

Оптимальная концентрация источника угле10 рода в среде 0,6 — 0,8 /0 глюкозы, рН среды (7,2) устанавливают путем добавления

10%-ного ИаеНР04. В среду стерильно добавляют инокулят из однородных клеток с количеством сухих веществ 1 мл/мл среды мясопептонного бульона.

Инокулят добавляют с расчетом 10 мл клеточной суспензии на литр питательной среды, что составляет количество сухих веществ

20 0,01 мг/мл среды, культивирование осуществляют при температуре 28 — 32 С в аэробных условиях в течение 12 — 18 час. Концентрация клеток достигает 10 — 12.10 клеток (в мл).

После ферментации биомассу подвергают

25 отцентрифугированию и дезинтеграции ультразвуком или механической обработке с IIQследующей лиофилизацией или обработкой ацетоном. Для определения активности лактатдегидрогеназы используют метод ферри30 цианида, белок определяют по методу Лоури.

Штамм Escherchia coli ВКМв-125 получен из коллекции музейных культур Института микробиологии АН СССР в 1966 г. и имеет следующую характеристику.

М о р ф о л о г и я: имеет форму палочек с размерами 2,7)(5,2, грамотрицательный, спор не образует.

Физиолого-биохимические свойс т в а: желатин не разжижает, культура растет на синтетических средах, преимущественно использует аммонийный азот, а также на средах с пептоном, с дрожжевым автолизатом, с гидролизатом казеина, свободный азот не фиксирует.

Углеродное питание штамма характеризуется сбраживанием моно-, ди-, полисахаридов, спиртов и органических кислот. Из последних слабо использует фумаровую и виннокаменную кислоты, не использует лимонную, яблочную кислоты.

Продукты обмена штамма: образование аммиака, сероводорода, индола, восстановление нитратов до нитритов.

Культура растет при рН 5 — 9, оптимум рН роста 6 — 7, температуре 30 — 37 С, имеет дезаминирующие и декарбоксилирующие способности.

Пример 1.

Состав основной питательной среды (на

1 л среды).

Раствор А:

Мясной бульон, мл 50

Дрожжевой автолизат, мл 50

Хлористый натрий, г 10

Хлористый магний, г 0,2

Двузамещенный фосфорнокислый натрий, г 12,5

Однозамещенный фосфорнокислый калий, г 5,0

Сернокислый аммоний, г 0,5

Хлористый аммоний, г 0,5

Диминерализованная вода, л 0,9

Раствор стерилизуют при 110 С 30 мин.

Раствор Б:

0,6О/о -ный водный раствор глюкозы стерилизуют при 55 С (0,5 атм.) 30 мин.

Затем проводят выращивание микробиальной биомассы Escherchia coli ВКМв-125.

1) подмолаживание культуры — культура

Escherchia coli ВКМв-125 поддерживается на косяках МПА, пер есевается приблизительно раз в месяц. Для инокуляции используют культуру 16-часового выращивания на косом агаре. Культуру пересевают в колбу с 100 мл

МПБ на 6 час при температуре 30 С на качалках при 100 об/мин. Однородность культуры проверяют микроскопированием и посевом на чашки Петри с МПА (мясопептонным агаром). Таким образом приготовленный посевной материал используют для инокуляции ферментаций в больших емкостях.

2) Ферментация культуры Escherchia coli

ВКМв-125. Питательную среду помещают в

438683 ферментатор ЕМ-30 и при помощи 10О/о-ного

ХарНРО4 устанавливают рН среды на 7,2.

Стерильно добавляют инокулят из однородных клеток. Инокулят добавляют с расчетом

10 мл клеточной суспензии в МПБ на литр питательной среды, что составляет количество сухих веществ клеток в 0,1 мг на 1 мл среды. Ферментация культуры Escherchia coli

ВКМв-125 производят при 30 С с аэрацией

10 около 12 час. Значительные отклонения от данных инокулята влияют на развитие культуры и длительность ферментации, ускоряя или замедляя этот процесс.

Пример 2.

15 Приготовление питательной среды для глубинной ферментации культуры (на 1 л среды):

Раствор А:

Мясной бульон, мл 50

Дрожжевой экстракт, г 2,5

Хлористый натрий, г 10,0

Хлористый магний, r 0,2

Двузамещенный фосфорнокислый натрий, г 12,5

Однозамещенный фосфорнокислый калий, г

Сернокислый аммоний, г

Хлористый аммоний, г

Деминерализованная вода, л

30 Стерилизация при 110 С 30 мин.

Раствор Б:

0,8О/о -ный водный раствор глюкозы стерилизуется при 55 С (0,5 атм.) 30 мин.

Микробиальную биомассу выращивают

35 также, как и в примере 1.

5,0

0,5

0,5

0,95

Предмет изобретения

40 1. Способ получения лактатдегидрогеназы путем культивирования Escherchia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при рН 7,2 в аэробных условиях с последующим

45 отделением биомассы и выделением из нее фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, из Escherchia coli используют штамм

ВКМв-125, в качестве источника углерода и

50 азота применяют дрожжевой и мясной экстрактыы.

2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и ся тем, что дрожжевой и мясной экстракты используют в соотношении 1: 1, а из солей исполь55 зуют хлористый натрий, хлористый магний, двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, хлористый аммоний в количествах соответственно равных, в г., 10,0; 0,2; бо 1 2,5; 5,0; 0,5; 0,5.

3 Способ по п. 1 — 2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при температуре 28 — 32 С.