Способ получения -аспарагиназы

Способ получения -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

А Й-И ОПИС ЕИЗОБРЕТЕНИЯ

-и 11 438684

Союз Советскии

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 02.04.73 (21) 1904191/31-16 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 05.08,74. Бюллетень № 29

Дата опубликования описания 27.01.75 (51) М. Кл. С 12d 13/10

Государственны| комитет ьовета Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изобретения

P К. Озолинь, П. П. Гривинь, Ю. О. Якобсон, Л. Ф. Гарькавая, Р. И. Гвоздяк, М. М, Левитов, А. Н. Мешков, Л. Д. Штоффер, П. М. Бычкова, В. Н. Игнатов и О. И. Прокофьева

Институт микробиологии им. А. Кирхенштейна и Всесоюзный научноисследовательский институт антибиотиков (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к области медицины и касается ферментных препаратов.

Известен способ получения 1-аспарагиназы путем культивирования Erwinia carotovora на средах с высоким содержанием определенной фракции дрожжевого экстракта (5 %

G1ntex) в качестве источника аминного азота и глутаматом натрия в качестве источника углерода. Средняя удельная активность клеток 4 — 6 МЕ/мг сухих клсток.

Целью изобретения является интенсификация процесса биосинтеза фермента.

Для достижения поставленной цели культивирование осуществляют на среде, содержащей до 0,5% аминного азота; 0,1 — 1,0% неорганической соли аммония; 0,5 — 2% органической кислоты, например лимонной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магния, при рН 6,5 — 7,5 и температуре 28—

42 С.

Способ получения 1 -аспарагиназы заключается в следующем. Культуру ЕгМп1а carotovora 268 поддерживают на скошенном МПА (или рыбном агаре, картофельном агаре), пересевают один раз в месяц, сохраняют при температуре +4 +-1 С. Для получения инокулята используют свежепересеянную 18-часовую культуру, выращенную при 28 — 37 С.

Размножают культуру в колбах емкостью

750 мл со 150 мл среды состава, аналогичного ферментационной среде при 28 — 37 С в течение 18 — 24 час.

Для засева фермснтационной среды используют 0,005 — 0,01% посевного материала (по сухому весу) . Ферментацию осуществляют в ферментерах объемом 100 л с рабочим объемом ферментационной жидкости

10 75 л. Среду стерилизуют 40 — 60 мин при

1 атм. Пеногаситель вводят или одновременно со средой или по ходу ферментации. Ферментацию ведут при 28 — 42 С, аэрации 20—

75 л/мин, работе мешалки 250 — 400 об/мин.

15 Продолжительность выращивания 8 — 18 час.

В ходе ферментации контролируют рН, прирост биомассы, удельную активность 1— аспарагиназы.

По окончании ферментации биомассу сепа20 рируют и используют для выделения фермента. Выделение 1 -аспарагиназы из клеток может осуществляться одним из известных способов.

Пример 1. Посевной материал в количе25 стве 0,01% используют для засева колб, емкостью 750 мл в 150 мл среды следующего состава (в %): КеНР04 0,7; КН2Р04 0,31

MgSO4 0,02; NH4PO4 0,5; яблочная кислота

1,0.

438684

Предмет изобретения

Составитель С. Щеиева

Корректор Н. Учакина

Техред Г. Васильева

Редактор Т. Каранова

Заказ 3701/9 Изд. № 131 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская иаб., д. 4/5

Типография, пр, Сапунова, 2 рН среды после стерилизации 6,8 — 7,0, Условия выращивания: температура 30 С, скорость качалки 220 об/мин, продолжительность выращивания 18 час. В конце ферментации удельная активность клеток составляет

8 МЕ/мг сухих клеток, съем 12,5 ME/мл культуральной жидкости. Лналогичный выход 1аспарагиназы дает замена яблочной кислоты на янтарную, аспарагиновую кислоту или глицерин.

Пример 2. Биосинтез по примеру 1 проводят на среде (в /о): К НР04 0,7; КНзР04 0,3;

MgSO4 0,02; NH4PO4 0,3; яблочная кислота

1,0; дрожжевой экстракт 0,3 (по аминному азоту).

При изготовлении сред с дрожжевым экстрактом экстракт предварительно растворяют при нагревании, осадок отделяют центрифугированием и добавляют требуемые компоненты, рН среды после стерилизации 6,8—

7,0. Продолжительность ферментации 8—

12 час, температура 39 — 42 С, аэрация 280—

300 об/мин.

Получают клетки с удельной активностью

8 МЕ/мг сухих клеток, съем 50 МЕ/мл.

П р и м ер 3. Посевной материал в количестве 0,01 используют для засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава, указанного в примере 2. Пеногаситель — силикон ЭПО-40 в количестве 0,01 /о. Условия ферментации: температура 37 С, аэрация

75 л/мин, мешалка 250 об/мин, продолжительность ферментации 8 час (до достижения стационарной фазы). Получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток, съем 33 МЕ/мл.

Пример 4. Посевной материал в количестве 0,005 /о используют для засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава (в % ): сульфат аммония 0,1; кукурузный экстракт 0,1 (по аминному азоту); ферментный гидролизат казеина О,1 (по аминному

5 азоту); молочная кислота 0,5; рН перед посевом 7,0.

При приготовлении сред с кукурузным экстрактом используют экстракт с содержанием не более 4%, углеводов (на сухой вес), рН

10 среды доводят до 7,5 40%-ным NaOH, осадок отделяют, добавляют остальные компоненты среды. Молочную кислоту добавляют с учетом ее количества, вносимой в среду с кукурузным экстрактом.

15 Условия ферментации: температура 28—

30 С, аэрация 20 л/мин, мешалка 400 об/мин, продолжительность выращивания 18 час.

В конце ферментации получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток, 20 съем 17 МЕ/мл, Способ получения 1 -аспарагиназы путем

25 аэробного глубинного культивирования культуры Erwinia carotovora на средах, содержа щих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фер мента, отличающийся тем, что, с целью

30 интенсификации процесса биосинтеза фермента, культивирование осуществляют на среде, содержащей до 0,5 /о аминного азота; 0,1—

1,0 неорганической соли аммония; 0,5—

2,0% органической кислоты, например лимон35 ной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магния, при рН=6,5 — 7,5 и температуре 28 — 42 С.