Способ выделения калликреинтрипсин-ингибитора

Способ выделения калликреинтрипсин-ингибитора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(»> 44!У!О

СОюз Сове!свих

Сойиалистичее.:IIX

Веспубпик (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 17.04.72 (21) 1774527/23-4 ! (32) Приоритет 24.04.71 (31) Р 2120088.4 (33) ФРГ Опубликовано 30.08.74. Бюллетень М 32

1 (Дата опубликова ия описания 13.06.75 (51) М. Кл. С 07g 7/026

Государственкык комитет

Совета Министров C ÑÐ по попам изо,",ретевий и открытий (53) УДК 547.964.4. .007 (088.8) (72) Автор изобретения

И по. тр а нец

Кристиан Гелькер (ФРГ)

Ипос ранная фирма

«Байер A. Г.» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КАЛЛИКРЕИНТРИПСИНИ Н ГИ БИТО РА

Изобретение отÄoc»Tся к улучшению способа выделения каллпкреинтрипсин-ингибитора.

Изгсстсн способ выделения кал.чикрс1:итр псин-ингибитора путем его присоединения и полимеру, предварительно связанному с трппсином. При этом удаление связанного каллпкреинтрипсин-ингибитора и его обсссоливание производят известными способами.

Сложность этого метода заключается в необходимости предварительного связывания полимера с трипсином.

Согласно предлагаемому изооретепию cIIoсоб выделения калликреинтрипсин-иIIãèáèòoðà из неочищенных растворов заключается в том, что неочищенный раствор калликреинтрипсинингибитора пропускают сквозь колонку, заполненную амфотерным ионообменнико I на основе полистирола, который обычно содержит аминоуксусные и(или) иминодиуксусные группы. При этом калликреинтрипсин-ингибитор адсорбируется на ионообменнике, а неадсорбированное вещество вымывают буферным или солевым раствором. Последующее элюирование калликреинтрипсин-ипгибитора обычно осуществляют при концентрации хлористого натрия 025 моль и при рН 6 — 10, преимущественно 6,2 — 8. Обессоливание производят известными способами.

Пример 1. Амфотерную ионообменную смолу последовательно промывают 1 н. NaOH, дис пллировапной водой, 0,5 í. НС1 и дистиллированной водой, 0,01М Ха/K.-фосфатным буфером со значением рН 8,0. 100 мл предвариге..ьно обработанной таким образом ионнообменной смолы вводят в колонку (2,5 + 20 см), Калликреинтрипс|ш-ингибитор, адсорбированный на кизельгуре, со степенью чистоты примерно 2000 едшшц калликреинтрипсин-ингнбитора на 1 мг экстрагпруют водой. В этом (о растворе путем поперемеш ого добавления ионоооменников (форма Н4 и ОН вЂ ) устанавливают удельную теплопроводность

0,12 м S см †. 670 мл этого раствора с 5100 единицами каллпкрепнтрппсин-ингибитора/мл

15 (общая активность 3,4 Р 10 единиц калликрешггрипсин-ингпбптора) вводят в колонку, заполненную ионообменной смолой, со скоростью 1,15 мл, мин/см - . Колонку промываю г

0,01 М фосфатным буфером и активное вещество элюпруют с помощью 2 л 0,01 М фосфатного буфера со значением рН 8,0 и 1,0 М NaC1 со скоростью 0,35 мл/мин/см путем создания линеппого солевого градиента. Активные фракции объединяют, обессоливают ионооб25 менником и раствор подвергают лиофильной сушке. Выход составляет 87 /О, удельная активность 6030 ед калликреинтрипсин-ингибитора/мг.

Пример 2. Амфотерный ионообмепник

30 готовят оппса: ным в примере 1 способох и

441710

Предмет изобретения

Составитель Я. Соколов

Техред Н. Куклина

Корректор Л. Орлова

Редактор Л. Герасимова

Заказ 1348/7 Изд. М 1284 Тираж 506 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, К-35, Раушская наб., д. 4,5

Типография, пр, Сапунова, 2 уравновешивают 0,01 М Na/Ê-фосфатным буфером со значением рН 6,2 и 0,001 М этилепдиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА) . 100 мл ионообменной смолы вводят в колонну (2,5 Q 20 см). 20 мл предварительно очищенного раствора ингибитора активностью 110000 единиц калликреин-ингибитора/мл (общая активность 2,2 )(10, единиц калликреин-ингибптора) и частотой 4000 единиц калликреин-ингибитора/мг вводят в колонну со скоростью

0,35 мл/мин/см . Колонку промывают 0,01 М фосфатным буфером и затем активное вещество элюируют с помощью 2 л 0,01 М фосфа гного буфера со значением рН 6,2 и 0,01 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 2 л

0,01 М фосфатного буфера со значением рН

6,2, 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 1,0 М NaC1 путем создания линейного солевого градиента.

Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменниками и раствор лиофплизуют. Выход составляет 86%, удельная активность 5000 единиц калликреин-ингибитора/мг.

Иммуноэлектроферрограмма показывает одну полосу наряду с сопутствующим антигеном, в то время как исходный продукт показывает большое количество полос.

Пример 3. Амфотерную иопообмспну î смолу готовят аналогично примеру 1 и уравновешивают 0,01 М 1 1а-К-фосфатным буфером со значением рН 8,0 1300 мл сырого, но еще сильноокрашенпого раствора ингпбитора с удельной активностью 7800 ед. калликреипингибитора/мл (общая активность 10,1 X 0" единиц калликреин-ингибитора) со степенью чистоты 2400 единиц калликрепн-ппгпбптора мг с 100 мл понообменнпка вводят со с»оростью 0)35 мл/мин/см в колонну (2,5 Q 20 см) . 11осле промывки 0,01 М фосфатпым буфером активное вещество вымывают, созда5 вая линейный градиент NaCl в фосфатном буфере. Активные фракции объединяют, обессоливают ионообменникамп и раствор лиофилизируют, 11олучают 1,58 г твердого вещества с удельной активностью 5500 единиц калликре10 ин-ингибитора/мг (общая активность 8,68)j10" единиц калликреин-ингибитора), что соответствует 86%. Полученный продукт оесцветен и совершенно свободен от побочных антигенов.

1. Способ выделения калликреинтрипсипингибитора из его неочищенных растворов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упроще2О ния способа, сырые растворы каллпкрепнтрипсин-ингибитора адсорбируют на амфотерной ионообменнои смоле на основе полистирола с последующим удалением неадсорбированных веществ путем промывки буферным раствором

25 5или солевым раc1 Bором, вымыванием калликреинтрипсин-ингибатора с помощью создания солевого градиента и выделением целевого продукта известными приемами.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что вымывание путем создания солевого градиента проводят при значении рН 6,0 — 10,0.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что применяют ионообменные смолы на основе полистирола, содержащие радикалы ампноуксусной кислоты, или радикалы имиподпуксусной кислоты, или их смесь.