Патент 442605

Способ получения антибиотика

 

.сЛзсц

8 се.

ЙФТАХ -1 т

@и ст

2605

<п1 44!

О ПИ-С .И Е ,,ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 12d 9/14 (22) Заявлено 26.10.72 (21) 1842080/31-16 (32) Приоритет 27.10.71 (31) 192838 (33) США

Опубликовано 05.09.74. Бюллетень № 33

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 615.779.931 (088.8) по делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 25.09.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Роберт Л. Хамил, Майкл Эдвард Хэйни (млад.) и

Вильям Макс Старк (США) Иностранная фирма

«Эли Лилли энд Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности.

Способ получения антибиотика, продуцируемого культурой Actinoplanes sp. NRRL 3884, в патентной литературе »е известен.

Целью изобретения является получение нового антибиотика, активного в отношении ряда микроорганизмов, в частности, кариогенных, а также ускоряющего рост животных. Для этого культуру Actinoplanes sp. NRRL 3884 предлагается выращивать в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли из фильтрата культуральной жидкости известными приемами.

Выращивать культуру рекомендуется при температуре 20 — 40 С в течение 2 — 10 дней.

Новый антибиотик представляет собой белое твердое аморфное вещество, (сс)о = — 66,6 (с=1%, 50%-ный водный метанол). Приолизительный элементарный состав его (в % ): углерод 53,06; водород 6,18; азот 5,79; кислород 31,40 и хлор 3,39. Антибиотик в виде хлористоводородной соли представляет собой белое кристаллическое твердое вещество с температурой плавления от 207 до 212 С; растворим в теплой воде и в 50%-ном водном метаноле; имеет четыре титруемых группы, две из них имеют значения рк от 7,0 до 9,7; рк двух других более 11, что было определено путем потенциометрического титрования в 66% -ном водном диметилформамиде; приблизительный

5 элементарный состав его (в %): углерод 55,36; водород 6,02; азот 5,73; кислород 28,99; общий хлор 4,52 и неорганический хлор 1,28; молекулярный вес примерно 1480, определяемый методом осмометрип под давлением пара; в

10 растворе минерального масла имеет следующие, явно различимые полосы спектра поглощения инфракрасных лучей: 3,0; 5,8; 6,02; 6,3;

6,62; 6,84; 7,02; 7,26; 7,32; 7,7; 8,1; 8,27; 8,52;

8,97; 9,35; 9,7; 9,8 и 10,1 мк; в водном раство15 ре кислоты и в нейтральном растворе в УФ-ой области спектра имеет максимум, поглощения

Ет С„53 при длине волны 283 ммк; в водном растворе основания в УФ-ой области спектра то, имеет максимум поглощения Ет",„60 при та длине волны 362 ммк и Ет", 53 при длине волны 362 ммк.

Антибиотик может быть выделен известными способами извлечения и очистки. Он спо25 собен как обычно образовывать соли с неорганическими кислотами, такими как соляная, серная, фосфорная и другие аналогичные кислоты, а также с различными органическими кислотамп, включающими уксусную, пропионо30 вую, малоновую, янтарную, винную, малеино3 вую, пикриновую, бепзойпую, паратоуолсульфокислоту, никотиновую и другие.

Антибиотик в виде свободного основания представляет собой белое аморфное твердое вещество, имеющее следующий элементарный состав (в /О): углерод 53,06; водород 6,18; азот 5,79; кислород 31,40 и хлор 3,39. (n)u = — 66,6 (с=1%, 50/p-ный водный метанол).

Хлористоводородная соль антибиотика, представляет собой белое кристаллическое твердое вещество:с температурой плавления от 207 до

212 С, растворимое в теплой воде и очень быстро растворимое в 50О/о-ном водном метаноле.

Хлористоводородная соль этого антибиотика стойка в растворе в пределах величины рН от

1 до 10 при температурах вплоть до 27 С, Потенциометрическое титрование хлористоводородпой соли антибиотика в воде выявляет присутствие одной группы с величиной рк 6,2 и присутствие пяти или более групп с величинами рк в пределах от 8 до 10,5. Потенциометрическое титрование хлористоводородной соли антибиотика в растворе диметилформамид— вода (в соотношении 2: 1) показывает присутствие двух групп с величинами рк от 7,0 до

9,7 соответственно и присутствие двух или более групп с величинами рк более 11.

Определение молекулярного веса осмометрическим методом под давлением пара показывает, что минимальный молекулярный вес хлористоводородной соли антибиотика составляет примерно 1480.

Средние показатели нескольких испытаний на элемептарный анализ выявляют следующий элементарный состав хлористоводородной соли антибиотика (в /о): углерод 55,36; водород

6,02; азот 5,73; кислород 28,9; общий хлор 4,52 и неорганический хлор 1,28.

На чертеже показана кривая поглощения в

ИК-ой области спектра хлористоводородной соли антибиотика в минеральном масле. Наблюдаются следующие, явно различимые максимумы поглощения: 3,0; 5,8; 6,02; 6,3; 6,62; 6,84;

7,02; 7,26; 7,32; 7,7; 8,1; 8,27; 2,52; 8,97; 9,35;

9,7; 9,8; 10,1 мк.

Спектр поглощения в УФ-ой области спектра хлористоводородной соли антибиотика в кислотном и в нейтральном водном растворе имеет максимум поглощения (при длине волны, toо

283 ммк Е ",„, 70. Хлорисговодородная соль антибиотика в основном растворе имеет максимумы поглощения при длинах волн 300 и

jo

362 мкм соответственно Е,"„ 60 и 53.

Антибиотик имеет следующие величины Rr в хроматографпческих системах (проявление на бумаге) при использовании в качестве детектирующего организма Bacillus subticis:

0,05 в бутаноле, насыщенном водой; 0,26 в бутаноле, насыщенном водой, с 2 /p п-толуолсульфокислоты; 0,84 в растворе из 19 ч. метанола, 6 ч. ацетона и 75 ч. воды; 0,40 в растворе из 3 ч. метанола н 1 ч. 0,1 н. НС1; 0,62 в во442605

Минимальная икгибирующая концентрация (мкг/мл) Испытываемый организм

15 разведение в питательном бульоне разведение в агаре

25,0

1,56

25,0

3,12

25,0

Staphylococcus aureus

Bacillus subtils

Mucobacterium

Streptococcus faccaIis

Vibrio coIi (Lowa 10)

MycopIasma gallIseptIcum

PasteureIIa multocida

Pasteurella hemolutica

65 де, насыщенной метилизобутилкетоном с l о/О п-толуолсульфокислоты.

Антибиотик оказывает ингибирующее действие на некоторые микроорганизмы, замедляя их рост. Предельные значения ингибирующего действия, предотвращающего рост указанных ниже организмов, показаны в табл. 1.

Таблица 1

Антибактериальная активность хлористоводороднок соли антибиотика

Показатель токсичности хлористоводородной соли антибиотика, определяемый на мышах и выраженный как величина LDsp, равна

350 мг/кг при внутрибрюшном введении в организм животного.

Хлористоводородная соль антибиотика, вводимая в живой организм мышей путем подкожной инъекции, оказывает противоинфекционное действие, причем LDsp при показанных ниже инфекциях имеют следующие значения

Staphylococcus aureus 3055 83 мг/кг

Streptococcus pyogenes (1 мг/кг

Diplococcus pneumortiae (5,5 мг/кг

Другим очень важным свойством антибиотика является его способность замедлять рост микроорганизмов, влияющих на околозубные (периодонтальные) заболевания. При разведении в питательном бульоне концентрация хлористоводородной соли антибиотика, равная

1,0 мкг/мл, вызывает замедление роста кариогенных организмов Odorttomyces viscosus.

Раствор хлористоводородной соли антибиотика оказывает антибактериальное действие на кариогенные организмы, как показано в следующей системе испытания.

Трубки с питательным бульоном, содержащим 5/p сахарозы, подвергали инокулированию с кариогенными микроорганизмами. Каждая трубка снабжена узким стеклянным стер>кием, помещенным в нее, и простирающимся под поверхностью питательного бульона. После инкубирования .при температуре

37 С в течение ночи на поверхности этих стержней образовывался слой негативной колонии вируса. Затем эти стержни переносили

442605

Дрожжевой - солодовый агар (ISP № 2) Агар Czapek

Агар из овсяной муки ISP № 3

Неорганические соли — крахмал (ISР № 4) 55

Глицерин — аспарагин ISP № 5

Глицерин — глицин

5 в раствор, содержащий хлористоводородную соль антибиотика в различных концентрациях, и эти стержни оставляли в контакте с указанnbIM раствором в течение различных периоjoB времени 5, 10 и 15 мин. По прошествии ограниченного периода времени стержни промывали стерильной деионизированной водой, и затем их инкубировали при температуре 37 С в течение 18 — 24 час в неинокулированной среде.

Рост организмов определяли, наблюдая изменения цвета бромтиола синего от синего ло желтого, вызванного образованием кислоты организмами.

Раствор хлористоводородной соли антибиотика при концентрации I эффективен в отношении кариогенного организма Streptococcus sp. в случае, когда этот раствор контактировал с клетками организма в течение пяти минут. Рост .другого вида кариогенного организма Streptococcus был прекращен при воздействии 1% -ного раствора данного антибиотика, находящегося в контакте с клетками организма в течение пяти минут.

Три вида карпогенных организмов Streptococcuss были ингибированы хлористоводородной солью антибиотика при концентрации

5 мкг/мл и разведении в питательном бульоне.

Другая разновидность кариогенного организма (нитевидного типа) была ингибирована хлористоводородной солью антибиотика при концентрации его 1 мкг/мл и разведении в питательном растворе.

Антибиотик способен ускорять рост животных. При добавлении хлористоволородной соли антибиотика в рацион для цыплят в количестве 45,4 r на тонну средний привес цыплят спустя десять дней составлял 154,2 г по сравнению с привесом контрольной группы кроликов, составлявшим 147 г. Эффективность превращения пищевых продуктов в организме цыплят при введении хлористоводородной соли антибиотика составляла 1,43. Эффективность превращения пищи у контрольной группы кроликов — 1,53.

Из описанных характеристик антибиотика ясно, что его можно, применять для подавления роста патогенных организмов. Так например, раствор, содержаший указанный антибиотик соответствующей концентрации, может использоваться,чля дезинфекции зубоврачебных и хирургических инструментов. стеклянных изделий и т. д. Этот антибиотик может использоваться также в растворе для дезинфекции поверхностей, например стен, полов, поверхности столов и других участков, где требуется поддержание стерильных условий, чапример в госпиталях, пои приготовлении пищи и так далее.

Ввиду активности этого антибиотика против кариогенных организмов и организмов, вызывающих околозубные заболевания, оп может быть введен в опре,челенных концентрациях в ппепараты. используемые для гигиены рта, 5

I0

Зо

6 например в зубную пасту, зубной порошок, г промывные жидкости, эликсиры и так далее.

Для ускорения роста животных его можно добавлять в питательный рацион илп растворять в питьевой воде.

В любом из перечисленных применений антибиотик может быть введен в организм либо в виде фармацевтической кислой солп, либо в виде свободного основания, причем выбор способа ввода его в организм опрелеляется физическими характеристиками антибиотика или какими-либо лругпмп факторами, а не биологической активностью, котопая является одинаковой как лля своболного основания, так и для кислой соли этого антибиотика.

Микроорганизм, используемый лля приготовления антибиотика, представляет собои разновилность Actlnoplanes из семейства актиноплантановых Actinoplanaceae. Эти актпноплантановые являются типичным сс мейством микроорганизмов типа Актпномипелатов.

Микроскопическое изучение морфологии.

Вегетативный мпцеллпй нахолптся на Li uidamber (древесная смо,ча) в виде пыльны в воде. Палисадная гифа составляет в среднем

1,3 13 мк лишь с редким возможным отклонением. Спорангп образуются на пььчьце и в среде International Streptnmx ces Project № 3 (Shirlino and Gottlieb). Спорангп ппелставчяют собой шарообразные частицы срелним,чпаметром 7,5 мк и с неолноролпой поверхностью.

Споры при рассмотрении пх в электронном микроскопе имеют шарообразную форму 1,7g

Q 1,2 мк. Они полвижны, имеют много >кгутиков.

Характеристика сред культивирования антибиотика в пезультате наблюления пос,че роста в течение 21 лня при температуре 30 С, Обозначение ISP относится к культивирующей среде International Streptomyces Project Media (Sherling and Gottlieb).

Обильи рост. Среда светло-коричневая (13 Г8) .

Отсутствие растворимого пигмента.

Обильный рост. Оранжевая срела (10 F7). Отсутствие растворимого пигмента.

Очень сильный рост, срела оранжево-желтая (11В7). Отсутствие растворимого пигмента.

Обильный рост. Коричневато-оранжевый цвет.

Светло-коричневый растворимый пигмент.

Обильный рост. Оранжевая среда (10Р7). Отсутствие растворимого пигмента.

Рост очень ограниченный. Отсутствие растворимого пигмента.

442605

Сильный рост. Серовато-красновато-оранжевый (11А8). Отсутствие растворимого пигмента.

Обильный рост. Ко- 5 ричневато - оранжевый (12В9). Коричневый растворимый пигмент.

Сильный рост. Светлосероватый желтовато-ко- 10 ричневый (13ВЗ) . Отсутствие растворимого пигмента.

Умеренный рост. Яркий желтовато - коричневый (13Н8). Коричневый растворимый пигмент.

Обильный рост. Бледный оранжево - желтый (9ЕТ) . Отсутствие раст- 20 воримого пигмента.

Очень ограниченный рост. Отсутствие р астворимого пигмента.

Случайный рост. Бледный оранжево — желтый (12ВЗ) . Светло - коричневый растворимый пигмент.

Умеренный рост. Ко- 30 ричневая среда (71.11) .

Растворимый пигмент, темный красновато-коричневый;

Среда Bennett

Томатная паста— овсяная мука

Тирозиновый агар

Агар дрожжевого экстракта

Глюкоза — аопарагин

Малат кальция

Питательный агар

Агар Эмерсона

Физиология.

Снятое молоко

Получение меланина позитивное на железопептоновом агаре (ISP № 6) спустя 24 часа.

Требования в отношении температуры: 45 глицерин — аспарагиновый агар. От умеренпого роста до обильного в интервале температур от 26 до 37 С. Отсутствие роста при 43 С.

В табл. 2 суммированы результаты испытаний с использованием углеводородов (источ- 50 ников углерода), которые осуществлялись на штамме Actinoplanes sp. МКК1 3884, образующем антибиотик.

В этой таблице использованы следующие символы: 55

+ = использование (+) = возможное использование (— ) = использование под вопросом — = отсутствие использования

Как было отмечено, можно осуществлять выращивание микроорганизмов Actinuplanes

sp. NRRL 3884 в среде культивирования, в результате чего образустс51 антибиотик. В KBiteстве среды может использоваться любая из,65

35 спустя 21 день не происходит ни коагуляции, ни осветления.

Восстановление нитрата: позитивное.

Питательный желатин: полное разжижение 40 спустя 21 день.

Таблица 2

Источник углерода

Источник углерода

РеакРеакция ция

Рамноза

d-Ксилоза

d-Мании т (+) (+) Целлобиоза

Целлюлоза

i-Инозит

Рафиноза

Сахароза ,. Мальтоза (†) (+)

Мелезитоза

D-Фрук таз а

D-Декстроза

L-Арабиноза

Лактоза муожества известных сред культивирования; однако из экономических соображений, с точки зрения максимального выхода антибиотика и легкости его извлечения предпочтительны лишь некоторые среды .культивирования. Так, например, декстроза является одним из наиболее предпочтительных источников углевода, и соевая мука — одним из предпочтительных источников азота.

Питательные неорганические соли, которые вводятся в среду культивирования, могут включать обычные выпускаемые промышленностью соли, из которых могут получаться ионы натрия, калия, аммония, фосфата, хлорида, сульфата, ацетата, карбоната и так далее. Кроме того, в среду культивирования могут быть введены вещества, способствующие ускорению роста, такие как барда, и дрожжевые экстракты, что приводит к успешным результатам. В среду культивирования необходимо также добавлять основные микроэлементы, способствующие росту Actinnplan s sp.

NRRL 3884. Такис микроэлементы ооычно вводятся в виде сл).чайных примесей и,чи в виде других составляющих компонентов среды.

Исходная величина рН культивирования может изменяться в широких пределах. Однако до осуществления инокуляции с микроорганизмом, желательно доводить величину рН среды культивирования до значения, равного от 6,5 до 7 3, в зависимости от типа используемой среды Конечная величина рН определяется, по крайней мере частично, по начальной величине рН среды культивирования, по буферу,,присутствующему в этой среде, и по длительности времени, в течение которого происходит рост организма.

Для получения значительных количеств антибиотика ферментация осуществляется преимущественно при погружении в аэробные условия в крупногабаритных емкостях. Незначительные количества антибиотика получаются при ферментации во встряхиваемых колбах, Ввиду периода задержки при получении антибиот 5ка, связанно"0 с инокуляцией в больших емкостях организмов в форме спор, желательно использовать вегетативный инокулум. Его приготовляют путем инокулирования небольшого объема среды культивирования с фраг9 ментами мицелия или с организмами в форме спор, в результате чего получают свежую, активно развивающуюся культуру данного организма. Вегетативный инокулум затем переносят в большую емкость для культивирова;шя.

Среда культивирования для роста вегетативного инокулума может быть той же самой средой, что используется для более объемной ферментации, хотя могут использоваться для этой цели и другие среды культивирования.

Организм, образующий антибиотик, может быть выращен при температурах от 20 до 40 С.

Оптимальное условие — примерно 30 С, Как и в случаях обычных процессов культивирования, при погру>кении в аэробные условия через среду культивирования продувается стерильный воздух. Для эффективного роста организма и для получения антибиотика объем воздуха, используемого в емкости культивирования для получения антибиотика, составляет преимущественно более 0,1 объема воздуva в минуту по отношению к объему среды культивирования.

Достижение активности антибиотика в ходе процесса фермептации можно проследить путем испытания образцов, питательного бульона, подвергнутого фермептации, на их антибиотическую активность, по отношению к известным организмам, чувствительным к действию антибиотиков. Одним из таких организмов, предназначенных для испытания на действие антибиотика, соответствующего данному изобретению, является организм Bacillus subtilis. Биологическое испытание может осуществляться обычным образом при использовании бумажного диска в чашке с агаровой средой.

Обычно максимальное получение антибиотика наблюдается в период в пределах от двух до шести дней при ферментации в больших емкостях или во встряхиваемых колбах. Как правило, максимальная активность антибиотика достигается в период от 48 до 96 час.

Антибиотик может быть извлечен из среды культивирования и отделен от других веществ, которые могут в нем присутствовать, способами экстракции и адсорбцпи, Согласно изобретению, процессы адсорбции для извлечения антибиотика являются наибослс предпочтиTEJlbHbIiYH, noCI(o@1hKV эти ItpolICCChl ие треб Iot использование относительно оольших объемов растворителя, что требуется в случае использования процессов экстракции. В качестве адсорбепта для отделения данного антибиотика от фильтруемого питательного бульона вполне подходящим является уголь, хотя вполне возможно использовать и другие известные в технике адсорбенты. Антибиотик, фиксированный на адсорбирующем агенте, извлекается с помощью обычных процессов элюировапия. Для дальнейшей очистки ацтиопотика используются процессы адсорбции и элюирования с применением таких адсорбирующи.;. материалов, как полиамидные смолы, окиссл алюминия, фильтрующие гели и другие веще442605

60

10 ства. Для о гистки антибиотика могут использоваться также ионообменные смолы.

Пример 1.

Фермептация антибиотика во встряхиваемой

5 колбе, Приготавливают культуру Actinoplanes sp.

МЯКИН 3884 и выдерживают ее на косом агаре, имеющем следующий состав: предварительно испеченая овсяная мука б0,0 г; дрожжи 2,5 г;

10 К.НРО4 1,0 г; исходное минеральное сырье

Czappk 5,0 мл; агар 25,0 г; деионизпроваппая вода 1 л.

Минеральное исходное сырье Czapel; имеет следующий состав:

15 КС1 100 г

MgSOt. 7Н:О 100 r

FeSO4 7Н>О 2 г (растворен в 2 мл концентрированной соля20 ной кислоты)

Деионпзированная вода 1 л

Величину рН среды культивирования регулируют до значения 7,3, используя для этой

25 цели раствор гпдрата окиси натрия. После стерилизации в автоклаве при температуре 120 С в течение 30 мпн при давлении - 800 г/см"- величина рН среды составляет б,7.

Косой агар инокулируют, используя ActinopЗО lanes sp. ККК? 3884, и инкубируют прп температуре 30 С в течение от семи до десяти дней. Выращенный мицелий покрывают стерильной дистиллированной водой, и поверхность косого агара соскабливают, разрыхляя

Ç5 микроорганизмы. Ввиду того что данную культуру не подвергают споруляции, желательно мацерировать мицелиальную пленку сплющенной остро заточенной пцокулирующей иглой для того, чтобы увеличить число потенци40 альных центров роста. Половина культуры косого агара. приготовленного таким образом, используют для пнокулирования 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав:

Глюкоза 10 г

45 Крахмал 20 г

Соевая мука 20 г

Дрожжи 2 r

СаСОз 2 г

Водопроводная вода 1,1 л

50 Инокулируемую вегетативную среду инкубируют в течение 72 час при температуре 30 С на вращающемся грохоте со скоростью вращения 250 об/мин.

Десять миллилитров ферментационной сре55 ды используют для инокулпровапия 100 мл второй стадии вегетативного роста среды следующего состава (в г):

Глюкоза

Картофельный крахмал 20

Соевая м1 ка 20

Антолизпрованные пивные дрожжи 3

СаСО> 4

65 Водопроводная вода 1,1 л

442605

11

Инокулированную среду инкубируют в течение 48 час при температуре 20 С на вращающемся грохоте (при скорости вращения

250 об/мии) . Эту вегетативную среду второй стадии используют для инокулирования 30 мл получаемой стерильной среды, имеющей следующий состав, содер>кащийся в 250-миллилитровой колбе Эрленмейера (в о/о):

Декстроза 1,0

Крахмал 2,0

Маннит 1,0

Соевая мука 1,5

Антолизированные пивные дрожжи 0,1

СаСОз 0,2

Водопроводная вода До 1 л

Инок лированную среду, содер>кагцуюся в колбе Эрленмейера, ферментируют при температуре 30 С в течение от 72 до 120 час на вращающемся грохоте, имеющем скорость вращения 250 об/мин. Конечная величина рН составляет от 7,0 до 7,5.

Емкость фер мент ации.

Описанный процесс применяют при получении вегетативной среды второй стадии.

200 мл этой вегетативной среды используют для инокулирования 25 л получаемой стерильной среды следующего состава (в о/О):

Декстроза 1,0

Крахмал 2,0

Маннит 1,0

Соевая мука 1,5

Антолизированные пивные дрожжи 0,1

СаСОз 0,2

Антипена 0,02

Вода 25 л

Величину рН этой среды регулируют, доводя ее до значения 7.3 — 7,4 после стерилизации в автоклаве при 120 С, давлении -800 г/см в течение 30 мин.

Получаемую инокулипованную среду, содержащуюся в 45-литровой емкости ферментации, ферментируют при 30 С в течение пяти дней.

В ходе ферментации осуществляют аэрирование стерильным воздухом, проходящим со скоростью половины объема воздуха на один объем среды культивирования в минуту. В ходе ферментации осуществляют перемешивание обычной мешалкой со скоростью вращения мешалки 500 об/мин.

Извлечение антибиотика.

Все питательные бульоны фермеитации, полученные в двадцатипятилитровых емкостях, выращенные в соответствии с описанным выше способом, соединяют и к ним добавляют

5 н. раствор гидрата окиси натрия с целью доведения величины рН до 10,5. Весь объем питательного раствора затем фильтруют, используя для этой цели фильтр, и мицеллярную фильтропрессную лепешку, суспензируют в воде и пепемешивяют в течение одного часа.

Мииезий фильтруют и >иицелярную фильтропрссси;ю лспси ку удаляют, Фильтраты объе5

12 диняют, в результате чего достигают общий выход объемом 66 5 л. Величину рН объединенных фильтратов регулируют, доводя ее до значения 8,0 путем использования 3 н. раствора соляной кислоты. Объединенные фильтраты пропускают через колонну, наполненную гранулированным углем в водс. Эту колонну промывают 15 л воды и удаляют выходящие из нее потоки. Затем эту колонну промывают

20 л водного раствора соляной кислоты, имеющего величину рН 2,5 и выходящий из нее поток также удаляют. Наполненную углем колонну элюлруют 4 л раствора ацетон — водя (1: 1), величину рН которого доводят до 2,0 путем добавления 3 н. раствора соляной кислоты. Величину рН элюата доводят до значения 7,5 — 8,0 путем добавления 5 н. раствора гидрата окиси натрия. Этот элюат, содержащий антибиотик, выпаривают до объема

1700 мл. Выпаренный элюат адсорбирч ют в колонне размером 7 60 см, содер>кащей промытую водой полиамидную смолу. Эт колонну, наполненную полиамидной смолой, алюируют восемью литрами воды, и элюат собирают в виде множества фракций. Эти фракции, содержащие антибиотик, объединяют и элюируют до получения небольшого объема. К выпаренному концентрату добавляют четырехкратный объем метанола, а затем добавляют равный объем эфира с целью осаждения антибиотика. Этот антибиотик фильтруют и высушивают. Выход его достигает 1,1 г.

Дополнительнос количество этого антибиотика извлекают путем элюирования содержащей полиамид колонны раствором метанол— вода (1: 1) . Элюаты, содержащие антибиотик, объединяют и выпаривают до получения небольшого ооъемя. К выпаренному концентрату добавляют четырехкратный объем метанола, и этот антибиотик осаждается путем добавления равного объема эфира. Полученный осадок извлекают путем фильтрации. Выход продукта составляет 3 r.

Пример 2. Очистка антибиотика путем использования окисла алюминия.

Для извлечения антибиотика осуществляют ту же процедуру, что описана в примере 1 пои элюировании колонны. наполненной углем. Величину рН ялк>ата доводят до 7,5 — 8,0 путем добавления 5 и. раствора гидрата окиси натрия, а затем его выпаривают до объема

200 мл.

100 мл этого концентрированного элюата, содержащего антибиотик, подают в колонну размером 2,7+8.0 см с промытым в воче окислом ялюмишля. Затем эту колонну промывают двумя литрами метанола. Выхо,чящий поток метанола удаляют. Антибиотик элюируют из колонны водным раствором метанола (1: 1), активные фракции элюата объединяют и выпаривают досуха. Высушенный осадок растворяют в 100 мл водного раствора метанола (1: 1). Полученный в результате этого раствор добавляют к двум литрам ацетона с той целью, чтобы вызвать осаждение очищенного

442605

45 антибиотика. Выход продукта составляет 2,2 г.

Пример 3.

Получение хлористоводородной соли антибиотика.

500 мл антибиотика, полученного согласно описанному выше примеру, растворяют в

20 мл 50 /О-ного водного раствора метанола.

Величину рН этого раствора доводят до 1,5 путем добавления 1 н. соляной кислоты. Полученный в результате раствор добавляют при перемешивании к 400 мл ацетона, в результате чего происходит осаждение хлористоводородной соли антибиотика. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают.

Выход хлористоводородной соли антибиотика составляет 420 мг.

Пример 4.

Получение пикрата антибиотика.

К раствору 500 мг антибиотика в 20 мл воды добавляют 20 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты. Эту смесь выдерживают в течение ночи при 5 С. Образующийся желтый осадок фильтруют, и получают

505 мг желтого пикрата антибиотика.

Пример 5.

Получение хлористоводородной соли антибиотика из пикрата антибиотика.

К раствору 505 мг пикрата антибиотика в

25 мл метанола добавляют 1 н. раствор соляной кислоты до тех пор пока величина рН не достигает значения 1,5. Полученный кислотный раствор добавляют при одновременном перемешивании к 500 мл диэтилового эфира, в результате чего получают осадок хлористоводородной соли антибиотика. Полученный таким образом осадок фильтруют и высушивают. Получают 442 мг хлористоводородной соли антибиотика.

Пример 6.

Получение свободного основания антибиотика из хлористоводородной соли антибиотика.

Раствор 500 мг хлористоводородной соли антибиотика в 20 мл воды пропускают над ионообменной смолой (ОН), содержащейся в стеклянной колонне 1)(10 см. Выходящий нз колонны поток собирают, и колонну элюируют водой. Водный элюат и исходные выходящие из колонны потоки объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Полученный осадок раство5

35 ряют в 20 мл 50 /о-ного водного метанола и добавляют к 400 мл ацетона при одновременном перемешивании, в результате происходит осаждение свободного основания антибиотика.

Осадок фильтруют и высушивают. Получают

255 мг антибиотика.

Пример 7. !

1олучение сульфата антибиотика.

Раствор 500 мг хлористоводородной соли антибиотика в 20 мл воды пропускают через колонну размером 1р,10 см, содержащую ионообменную смолу в гидроксилцикле. Эту колону промывают водой, и активные фракции объединяют и выпаривают досуха.

Высушенный осадок растворяют в 20 мл

50%-ного водного раствора метанола. Величину рН раствора регулируют, доводя ее до 1,5 путем добавления 1 н. раствора серной кислоты, и подкисленный раствор добавляют к

400 мл ацетона. Образуется осадок сульфата антибиотика, который извлекают путем фильтрации. Выход этого продукта составляет

331 мг.

Пример 8.

Получение .метилоранжевой соли антибиотика.

К раствору 500 мг антибиотика в 20 мл воды добавляют 20 мл насыщенного раствора метилоранжа в воде. Полученный раствор выдерживают в течение ночи до тех пор, пока не произойдет выпадение полного осадка метилоранжевой соли. Метилоранжевую соль антибиотика отфильтровывают и высушивают. Выход продукта составляет 521 г.

Предмет изобретения

1. Способ получения антибиотика, о т л и ч аю шийся тем, что культуру Actinoplanes sp.

МЯКИН 3884 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли пз фильтрата культуральной жидкости известными приемами.

2. Способ по п. 1, отл и ч ающи йся тем, что выращивание осуществляют прп температуре 20 — 40 С в течение 2 — 10 дней, 442605

5000 000 5000 2500 Ю:. 0 а00 i -О0 .700 200 «00 «00 ЬЪЭ . 00 й0 000 750 700 б50

tÎ0 гп

2 7 Ф 5 5 7 0 9 <0 1$ <2 <5 14 <5

Составитель Т. Головина

Редактор Т. Каранова Техред В. Рыбакова Корректор Е. Рогайлина

Заказ 2223/7 Изд. № 575 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2