Способ очистки -аспарагиназы

Способ очистки -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (»1 4435l5

Союз Советских

Социалистических

Республнк (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 18.12.68 (21) 1290716, 28-13/

1389869. 23-4 (51) М. Кл. С 07g 7/02 (32) Приоритет 06.04.68 (31) P 1767158.8;

P 1767157.7 (33) ФРГ

Опубликовано 15.09.74. Бюллетень № 34

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) A ДК 547.964.4.05 (088.8) по делам изобретений н открытий

Дата опубликования описания 30.05.75 (72) Авторы изобретения

11ностранн ы

Отто Вагнер, Клаус Бауер, Вильфрид Кауфманн, Эрих

Рауенбуш, Альфред Аренс и Эккарт Ирион (ФР1 ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ L-АСПАРАГИHA3bI

Изобретение относится к ферментной промышленности и представляет собой способ очистки L- аспарагиназы.

Известен способ выделения ферментов из сыворотки или плазмы при действии полиэтиленгликоля.

Предлагается способ, согласно которому перед осаждением полиэтиленгликолем к водным растворам L-аспарагиназы добавляют амиды, например мочевину, которые разлагают водородные мостиковые связи. Было найдено, что чистоту L-аспарагиназы можно повысить, если осаждать фермент у изоэлектрической точки.

В предлагаемом способе достигается такая степень чистоты L-аспарагиназы, которая до сих пор была невозможна в технических масштабах.

Кроме того, растворяющее действие, например, мочевины позволяет работать с водными растворами L-аспарагиназы повышенной концентрации, что упрощает технологический процесс.

Пример 1. 5 кг сырой аспарагиназы подают при комнатной температуре в 40 л дистиллированной воды. Значение рН медленно образующегося раствора устанавливают при помощи 1,5 л 1 н. NaOH на уровне 8,5 — 8,9. Затем добавляют мочевину до концентрации приблизительно 3 моль/л. Температура раствора

5 снижается при этом приблизительно на 10 С.

Размешивают еще 1 ч, а потом выдерживают образующийся раствор в течение 16 — 24 ч прп температуре 4 С. По истечении этого времени осаждают фракцшо 1 путем добавления 25—

10 30 л 50 /о-ного раствора полнэтилснглнколя, затем фракцию 1 удаляют. Фракцию II осаждают с добавлением еще 15 л 50%-ного раствора полиэтпленгликоля. Фракция II получает главную активность. Путем добавления еще

15 15 л раствора полиэтиленгликоля к остатку от фракции 11 получают фракцию III, которая имеет 20 — 25% активности сырой аспарагиназы. Фракцию II подают .приблизительно в

2,5 л дистиллированной воды. В результате

20 добавления 250 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля осаждается фракция 1 а, а путем добавления еще 250 мл раствора полиэтиленгликоля осаждается фракция II а. Аналогичным способом получают фракции III a

25 и IV а. Достигаемые при таком фракционировании степени чистоты и выходы приведены ниже в таблице.

443515! ! Единицы/мг од

% ферментативной активности, нз расчета на исходную сырую аспарагиназу (одноминутные единицы) Фракция

1а

Ца

П1а

1Ча

0,3

8,0

31,2

11,5

4,6

1,6

8,1

23,0

16,2

I8,9

19,4

100,0

164,0

74,0

25,0

Итого

55,6

Пример 2. Работают аналогично примеру 1, но повышают концентрацию мочевины приблизительно до 6 моль/л. После этого раствор выдерживают только 2 ч. Выходы почти совпадают с выходами примера 1.

Пример 3. Работают аналогично примеру 1, но вместо мочевины добавляют гидрохлорид гу анидина до концентрации приблизительно 2 моль/л. Раствор выдерживают

2 ч. Выходы соответствуют выходам примера 1.

Осаждение ведется из изоэлектрической точки.

Пример 4. 100 г 1.-аcпaparинaзы с удельной активностью приблизительно 100 Ь/мг протеина растворяют в 1000 см дистиллированной воды при комнатной температуре. Во время растворения устанавливают значение рН при помощи 1 í. NaOH на уровне 8,5 — 8,9.

Нерастворимый остаток удаляют в течение

10 мин путем центрифугирования при

6000 об/мин. Значение рН оставшегося осветленного раствора доводят в ледяной ванне медленно до 7 — 8. Образующийся маслянистый осадок удаляют в течение 25 мин путем центрифугирования при 6000 об/мин. Остающийся после центрифугирования осветленный раствор доводят при помощи 1 и. НСI до рН

5,2. Потом последовательно подают по 25 мл

50%-ного раствора полиэтиленгликоля и каждый раз центрифугируют в течение 10 мин при 6000 oo/ìèí. Таким образом получают приблизительно 5 — 6 фракций, причем фракции III — V имеют главную активность с самой высокой удельной активностью.

Выход 60 — (О jo.

Пример 5. Работают аналогично примеру 4, но вместо полиэтиленгликоля четырьмя порциями добавляют холодный ацетон до 20% объема раствора.

Выход соответствует выходам примера 4, Пример 6. Работают аналогично примеру 4, но вместо полиэтиленгликоля пятью порциями добавляют этиловый спирт до 20% объема раствора. Выходы соответствуют выходам примера 4.

П р и и е р 7. 100 г L-аспарагиназы с удельной активностью 140 U/ëã протеина растворяют в 500 мл воды; значение рН раствора устанавливают при помощи 1 í. NBOH na

1О

55 уровне 8,5. I-Iерастворившийся материал удаляют в течение 15 мин путем центрифугировалия при 6000 об/мин. 2начсние рН осветленного раствора уcTHHBBëèâàþò при 4 С и при помощи 1 и. HCl, равным 6,8, а образующийся при этом осадок удаляют путем центрифугирования. Остающийся после центрифугирования раствор при помощи 1 и. НС! медленно доводят до рН 5,.0 —,1 и выдержив"".þò несколько часов при температуре 4 С.

Образующийся при этом осадок удаляют путем центрифугпровапия. Этот осадок содержит L-аспарагиназу с выходом 60 — 80% исходной активности и с максимальной удельной активностью до 190 U/ìã протеина.

Пример 8. 200 г сырой аспарагиназы с активностью 97 Е/нг растворяют в 4000 мл гликоколевого буфера при рН 8,5 и в течение 30 мин нагревают горпиями до 60"C. При этом коагулируется неактивный протеин, а фермент остается по-прежнему в растворенном состоянии. Исходную смесь центрифугируют при 6000 об/мпн и фракционируют при помощи ацетона. Ооразующийся в результате добавления 40 — 45% ацетона осадок содержит 16,4 г /.-аспарагиназы. О» имеет активность 863 Е/,нг.

9,3 г э ой концентрированной аспарагиназы растворяют в 190 мл раствора, содержащего 3 моль мочсвипы»а 1 л, устанавливают при помощи раствора едкого патра значение рН 8,5 и фракционируют при помощи полиэтиленгликоля (50% -пый водный раствор) .

Получаемую после добавления 22 — 30 мл фракцию выделяют и обрабатывают обычным способом. Выход 2,1 г, активность 3130 Е/мг.

Раствор из 4,0 г этой пробы в 40 мл дважды дистиллированной воды доводят при помощи 1 и. НС1 до рН 5,2 и фракционируют при помощи раствора полиэтиленгликоля.

Образующийся после добавления 12,5—

15 мл осадок удаляют после 20 мин стояния при комнатной температуре путем центрифугировапия и после 2 ч стояния под ацетоном промывают еще ацетоном.

Выход 1,2 r, активность 6110 Е/мг. Осадок состоит из кристаллов в виде плоских призм, окрашен в коричневый цвет при 225 С, спекается, начиная с 260 С, вспепивается, начиная с 270 С, и полностью разлагается, начиная с 274 С.

Полученные таким образом кристаллы перекристаллизовывают из водных растворов путем добавления органических растворителей, например ацетона или спирта, или путем добавления полиэтиленгликоля.

Предмет изобретения

Способ очистки L-аспарагпназы из водных растворов путем осаждения полиэтиленгликолем, отл ич а ю щи йся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, к исходному раствору L-аспарагиназы добавляют амид, например мочевину.