Способ получения ковалентно связанной с носителем пенициллинацилазы

Способ получения ковалентно связанной с носителем пенициллинацилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП И

Н3О6

Союз Советских

Соцналистимесккх

Республик

1) 44697I

К (6I) Зависимш (22) Заявлено2?.

1) М. Кл.

С 07 7/02 с присоедин

Государственный кокнтет

Совета Мнннстров СССР оо делам нэооретеннй н открытий(32) Приоритет2 (331 ФРХ

Опубликовано1. з) Удк577. I5.0I (088.8>

Дата опубликов остранвц

Фриц Хюпвр (Фрт) Иностранная фирма (72) Автор изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОВАЛИ1ТНО ЩЯЗАННОЯ

С НОСИТЕЕ2М ПИП4ЦИИЛИНАЦИЛАЗИ

Иаобретение относится к ссссо: бу получения нерастворимой в воде пвнициллинацилазы, ковалвнтно свяаанной с носителем в виде слабо сшитого смешанного полимериаата акриламида, малеиновой кислоты. и N,N -метиленбисакриламида.

Изобретение мохвт найти применение для ферментативного получения

6-аминопенициллановой кислоты иа . пенициллинов.

Известно применение для получения 6-аминопенициллановой кислоты пенициллинааы, фиксированной на носителе в виде линейного полимера .ангидрида этиленмалеиновой кислоты ЕМА — смола). Этот полимер является, однако, очень неоднородным и после гидролиза группы ангидрида карбоновой кислоты при нейтральном или щелочном значении рН растворим в воде .

Этот полимер только в реаультате свяаи с ферментом и другими, свя2 ванными как сомономвры в нескольких местах ди-или полиаминами обрааувт поперечныв свяаи и вследствие этого становится раствори5 мым в воде. Ниэкомолвкулярные и частично растворимые в воде фракции не могут быть разделены. 11оэтому свяаанный протеин теряется как растворимый материал. Кроме того ЕМА — смола вследствие болев высоких концентраций протеина обрааует так сильно поперечные связи, что она окааывается лишь частично доступной для субстрата.

Предлохен способ получения нового нерастворимого в воде фермента, фиксированного на носителе посредством обрааования с ним ковалентных связеИ: пенициллинацилазы, ковалентно свяаанной с полимериаатом аыриламида, малеиновой кислоты и N,N -метиленбисак5 пиламида.

44697Х

Способ заключается в том, что смешанный полимериаат из акриламида, малеиновой кислоты и N, -метиленбисакриламида нагревают в вакууме и полученный ангидрид в течение нескольких часов при температуре нихе 20 С и при значении рН 5,0-6,5 вводят в реакцию с водным раствором пенициллинацилазы. 10

При этом аминогруппы фермента реагируют с ангидридными группами полимеризата, причем до ЗГй пенициллинацилазы связывается ковалентно с носителем и активность фермента, вводимого во взаимодействие с полимером — но.— сителем, полностью сохраняется.

Получение смешанного полимеризата осуществляют известныии методами. После смешанной полимеризации хелеобразную смолу продавливают через сито с отверстиями 0,5 мм, хорошо промывают и высушивают в вакууме. Полимеризованную дикарбоновую кислоту посредством двухчасового нагревания до 180 С переводят в ангидид дикарбоновой кислоты. Больше ч нагрев продолхать не следует, так как затем явно уменьшается способность смешанного полимеризата образовывать. связи.

Способность связи протеина,зз смешанного полимеризата зависит от числа присутствующих ангидридных групп и от величин.ы пор. При узко сшитом продукте способность к связи меньше, чем при менее 4о узко сшитых полимерах. Вследствие меньшего образования поперечных связей увеличивается способность набухания полимериаата, причем одновременно уменьшазтся проч- 45 ность на истирание.

Для ковалентной связи пенициллинацилазы изготовляют предпочтительно полимеризат из 45 ч акриламида,.3 ч. N N -метиленбисакриламида и 15 ч малеиновой кислоты.

Аминогруппы пенициллинацилазы реагируют с ангидридными группами полимериаата при рН 5 0 — b,á, предпочпипельно при рй 5,8. .Ган как вследствие сольволиза циклических ангидридных групп возникает слабокислый катионит, значение рН реакционной смеси медленно понихается, если в реакционную смесь непрерывно не добавляют аабавленный раствор едкой щелочи. елесообразно применять регулятор

4 значения рН, Специальные условия реакции имеют большое значение для выхода связанной пенициллинацилазы. Выход зависит полностью от рН. Так например при рН 5,8 оН рутвен 9И . пои пН 6.ф - 45ф и при рН - 4,5 - только 2d7o .

Температура реакции такхе имеет большое значение. Она долхна быть возмохно нихе. При более высоких температурах гидролиз циклических ангидридных групп протекает скорее, чем аммонолиз.

Предпочтительно работаю при +4 С.

Взаимодействие зависит, кроме того от ионной силы, его йроводят предпочтительно в буферном раствое с незначительной ионной силой. ри высоких буферных концентрациях полимеризат схимается, так что фермент медленнее пройикает в матрицу полимера и мохет медленнее реагировать. Предпочтительно прииейять 0,01-.О,ОР моль сфатного буфера. После взаииодействия отфильтровывают пенициллинацилазу на носителе и интенсивно промывают водо@ с 1 М растаором поваренной соли.

На 1 r фермента применяют,по меньшей иере 10 r смешанного полимеризата. Из этой смеси приблизи-. тельно 3-4 г прибавляют в раствор фермента в 25О мл 0,05 М фосфатного буфера при зйачении рН Ь,5 интенсивно размешивают и по истечении 2 ч добавляют маленькими дозами оетальной,сжшанный полимеризат. 3наяение рН в течение всей реакции поддерхивают постоянным посредством добавлени,я разбавленного раствора едкого натра. Если по прошествии

Ь ч отстоявшийся верхнир аодный слой содержит, еще не прореагировавший энзим, добавляют еще weшанный полимеризат. Соотношение

1 ч энзима к 15-20 ч смешанного полимеризата .является обычно достаточныи для полной реакции о6менного ра.злохения.

Пенициллинацилазу на носителе мохно хранить оез потерь ферментной эффективности.

Для определения ферментной . активности пенициллинацилазы на носителе инкубируют раствор

30 000 М. Ед/мл бензилпеницилинакалия при 37"С. Освобохденную, фенилуксусную кислоту при постоянно поддерхиваемом значении рН "/,B

44697I

5 титрируют, с 0,1 н. раствором едкого натра. Единица фермента (Е) является активностью . которая при этих условиях в 1 мин расщепляет 1 ммоль бенаилпвнициллина в 6-аминопенициллановую и фенилуксусную кислоту и при этом употребяет 1 ммоль раствора едкого натра.

Пример 1. Получение смешанного полимериаата.

Полимериаат 1, 450 r акрилшида, 22,5 r N,N -метиленбисакриламида и 150 г малеиновой кислоты

Растворяют в 3500 мл 0,05 М фос- атного оууера со аначенивм рН

6 в точке ааота, раабавляют

150 мл 5Яного водного раствора нитрила ропионовой кислоты и

150 мл 5 -ного раствора перекиси сульфата аммония. Реакционную смесь нагревают до 80 С аатвм выдерхивают в течение 15 ч при комнатной температуре и продавливают череа сито с величиной отверстий 0,5 мм. После тщательного промывания водой полимериаат высушивают выморахиванием и при давлении 20 мм рт.ст. в те- чение 2 ч нагревают в вакууме до

180 С.

Аналогично могут быть получены смешанныв полимериааты следующего состав, r:

П Ш 1У У

Акрильмид 450 450 450 450

I й,N -Метиленбис акриламид 30 45 45 135

М алвиновая кис лота 150 150 75 150

Полииериаьты обрабатывают далее, как укааано в примере 1.

Пример 2. Пенициллинацилааа на носителе

А 1.0 r пенициллиньцилааы с удельйой ферментной активностью

15 Е/мг растворяют в 00 мл U,U1

М буфера со аначением рН 5,8 йри

4 С при первмешивании в течение

5 ч, добавляют маленькими доаами

15 r смешанного полимериаата, полученного по примеру 1. Значеwe рН поддврхивают 5,8 раабавлвнныи аОН. По истечении 24 ч

6 отфильтровывают при 4"С и промывают 30U мл волы. Сыпой Фепмент на носжтеле (300 г, набухший) имеет дельную -активность U, LR8 К/мг.— *-

ыход ковалентно свяаанной пеницил. линацилаан составляет 9ф.

Аналогично осуществляется вааимодвйствие смешанных нолимериаатов.

Б. 15 г. Смешанного полимериаата П подвергают взаимодействию с

1 г пенициллинацилаан (15 Е/мг); выход 290 г сырого фермента на носителе с активностью 0,044 Е/мг.

Выход ковалентно свяаанной пенициллинацилааы составляет 35ф..

В. 15 г Смешанного полимериаата

Ш подвергают вааимодействию с 1 r пенициллинацилаан (15 E/Mã); выход 295 г сырого фермента на носителе с активностью 0,039 Е/мг.

Выход ковалентно свяаанной пеници» ллинацилааы составляет 77ф.

Г. 15 г Смешанного полимериаата

1У подвергают вааимодействию с 1 г пенициллинацилаан (15 Е/мг); выход

280 r сырого фермента на носителе с активностью О, 041 Е/мг. Выход ковалвнтно свяаанной пенициллинацилаан составляет 76,5ф.

Д. 15 г Смешанного полимвриаьть

У. подвергают вааимодействию с 1 r пенициллинацилааы (15 Е/мг);выход

65 сырого фермента на носителе с активностью 0,146 Е/мг. Выход ковалентно связанной пенициллиньцилааы составляет 6@.

ПРЕДМЕТ ИЗОД ЕТЕНИЯ

Способ получения ковалвнтно свяаанной с носителем пвнициллинацильаы, отличающийся тем, что смешанный полимвриаат иа акпйламидь, малеиновой кислоты и М,й -метйленбисакриламида нагревают в вакууме и полученный ангидрид вводят в реакцию с водным раствором пенициллинацилааы в течение нескольких часов при температуре нихв 20 С и при аньчении рН Ь,Р6,5.