Способ получения антибиотика реумицина

Способ получения антибиотика реумицина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

т Всвсем зн я ла емти ° ..е., . к=

5нйям.> м, л="-

ОПИ САНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскнк

Социалистических

Республик (1 ) 4 522 3 7

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено0109.66 (21) 1100276/31-16 с присоединением заявки P6— (23) Приоритет (43) Опубликовано 2510.77.Бюллетень Р639 (45) Дата опубликования описания 2911.77 (5!) М. Кл.

С 12D 9/14

Гвщврвтввнныт ноиитвт

Соната Мнниотров СССР ио двиаат наобрвтвивв н отирытнй (53) УДК

615 ° 779 ° 934 (088. 8) В. A. Семенова, 3. Т. Синицына, В. Г. Королева, P ° A. Вейс, С. М. Навашин, Н. К. Соловьева, A. Д. Кузовков, И. П. Фомина, М. И. Михайлова, Т. И. Орешникова, Е. Ф. Опарышева, Е. К. Березина, T. Г. Терентьева, M. М. Тайг, И. A. Сторожев, Л. A. Штегельман, A. Н ° Шнеерсон, A. С. Ничипорук, П. М. Бычкова, Г. Н. Гинзбург, Д. Ф. Филорикьян, К. И. Скоромнова и Г. К. Исаева (7l) заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА РЕУМИЦИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности.

Способ получения антибиотика реумицина в патентной литературе не описан. 5

Целью изобретения является получение антибиотика реумицина, обладающего противоопухолевой активностью. для этого культуру hctinomgces гесса

bvuncus штамм та 5000-23 выращивают 10 на среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционными методами.

Морфолого-культуральные признаки реумицина.

Морфология: спороносцы прямые, споры овальные, собранные в цепочки. 20

Культуральные приэнакит на агаризованных синтетических средах (среда

Гаузе 9 1, СР-1 с глюкозой и другие) зрелая культура (8-12 дней роста) имеет хорошо развитый воздушный мицелий 25 розового цветат субстратный мицелий от кремоватого до темно-каштанового цвета. Среда приобретает окраску аналогичную цвету субстратиого мицелия.

На агаризованной органической среде 30 (кукурузная М 6): воздушный мицелий скудный, цвет кремовый или бледно-розовый; субстратный мицелий — бесцветныи, пигмент в среде отсутствует.

Физиологические свойства: желатина разжижается, молоко пептонизируется, сахароза инвертируется, крахмал не гидролнзуется, на клетчатке роста нет.

Культура Act. rectus Ью uraeus шт. 9 5000-23 хорошо использует различные источники углеводовт арабинозу, ксилозу, рамноэу, глюкозу, манно3у, галактозу, мальтоэу, раффинаэу, слабо лактозу; не потребляет маннит, сорбит и другие многоатомные спирты.

Лнтимикробные свойства: культуральная жидкость Act. cactus, muS шт. 9 5000-23 практически не обладает антагонистическим действием в отношении ряда граммположительных ($Ьвравцй.

<хи eus, Вж1н . зиЫНаэ и др.), . граммотрицательных (EàñÜñï . сос1 и др. ки сл стоу ст ой чи выx (Mucobacte рМе() бактерий и дрожжеподобных организмов (ссикИсто аСМсапэ и др. ) .

Освоен процесс глубинного биосинтеза реумицина в условиях опытных ферментеров.

Для получения антибиотика реумиця» на культуруАс1. жсвлм UlloUs ыт.

452237

ti 5000-23 выращивают на жидких питательных средах с различными источниками азотистого питания как органи-ческого (кукурузный экстракт, рыбная, соевая мука, пептон и др.), так и ми нерального происхождения (аммонийный и нитратный . азот), и различными источниками угленодистого питания (глюкоза, крахмал, глицерин) н различных сочетаниях; рН среды 6,8-7,0.

Температура культивирования 26-28 С

Основные ингредие"ты питательной среды потребляются к 40-64 ч ферментации; этот период сопровождается максимальным накоплением мицелиальной массы.

Противоопухоленая актинность в культуральной жидкости появляется на 16

20 ч роста и достигает максимума к

64-90 ч.

Контроль эа накоплением антибиотика в процессе ферментации производится с помощью метода Миамура, основанного на подавлении дегидразной активности опухолевых клеток или метода культуры ткани.

Культуральная жидкость, обладающая + способностью подавлять дегидраэную активность опухолевых клеток в разве« денни 1:80, 1:160 удонлетворяет требонаниям для выделения и очистки препарата.

Протиноопухолевое вещество содержится в культуральной жидкости, главным образом, в растнореином состоянии.

Контроль процесса выделения противоопухолевого вещества из культуральной 5 жидкости, а также оценка получения препаратов осуществляются биологическим способом в опытах на животных с привитыми опухолями. Для выделения антибиотика из культуральной жидкости 40 могут бить использованы а) адсорбция на активированном угле с последующей десорбцией ацетоном или другими органическими растворителями) б) экстракция не смешинающимися с водой 46 органическими растворителями : спиртом эфирами, хлорированными углеводородами, бутиловым спиртом, этилаце. татом и др.) в) адсорбцня ионообменными смолами и десорбция растворами ф5 кислот.

Ив концентратов, полученных первыми двумя (а, б) способами, противоойухолевое вещество осаждают избытком петролейного и диэтилового эфира. По- ® лученный таким образом препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета, растворимый в воде, низших спиртах, диметилформамиде и нерастворимый в петролейном эфире.

Противоопухолевое действие реумицина изучают на моделях следующих перевинаемых опухолей животных опухоль

Эрлиха в плотной и асцитной формах, саркома 180 (С-180) н асцитной и плотной фоомах, саркома 37 (С-37) н асцитной и плотной формах, лимфаденоз НК/лн лимфосаркома-1 (ЛИО-1) млшей, карциносаркома Уокера н саркома 45 (C-45) крыс.

Пример 1. Зрелой (8-12-дневной) культурой Act. rectos brvneus шт. 9 5000-23 с агаризованной среды

CP-1 с глюкозой засевают маточные колбы (Эрленмейера на 750 мл) с ферментационной средой (125 мл) следующего состава (%): кукурузный экстракт 0 5 (по сухому весу), сернокислый аммоний 0,35> глюкоза 1,0, крахмал 1,5, натриЯ хлористый 0,5, кальций углекислый 0,5.

Засеянную культуру выращинают на круговой качалке (скорость вращения 230240 об/мин) при температуре 26-28 С в течение 48 ч. Из маточных колб стерильной пипеткой отбирают мицелиальную массу и засевают партию посевных колб с той же средой, выращивают на качалке н течение 48 ч.

В ферментеры (емкость 45 л) помещают ферментационную среду (25 л) вышеуказанного состава, стерилизацию которой проводят при 122-124 С в течение

35 мин. Затем эту среду засевают посевным мицелием (2% к объему среды).

Процесс ферментации протекает 8590 ч при слабокислом (6,6) или нейтральном (6,8-7,0) значении рН и полнеем .-.отребленип углеводов к 60-64 ч.Противоопухолевая (антидегидразная) активность появляется к 16-20 ч глубинного роста культуры и достигает максимума к 64-88ч. За активную культуральную жидкость принимается такая, которая в разведении 1:80 способна подавлять дегидразную активность раковых клеток.

По достижении максисума активности процесс ферментации заканчивается. Затем из культуральной жидкости выделяют и химически очищают биологически активное вещество. Для этого 18 л нативного раствора с рН 6,8-7,0 помещают в аппарат, снабженный мешалкой, и при непрерывном перемешинании проводят подкисление 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 3-2,5 (определяют по индикатору бромфенолу синему). Затем приливают в аппарат б л н-бутилового спирта, что составляет 30% от объема нативного раствора, и в течение 30

40 мин при непрерывном перемешивании проводят экстракцию активного вещества в бутанол. По истечении указанного времени мешалку выключают и оставляют жидкость расслаиваться. Через 3-4 ч сливают нижний слой (маточный раствор) а затем верхний (T экстракт) - в бутыли.йаточннк засасывают в аппарат при\ линают, б л бутаиола (20% от натинного раствора) и в течение 15-20 мин при непрерывном перемешивании проводят вто

pyro экстракцню. По окончании ее отключают мешалку, и после отстаивания в

452237

Составитель Т. Головина

Техрад Н.Бабурка . Корректор М. Демчик

Ред ктор H. Спиридонова

Заказ 3364/5 Тираж 541 Подписное

ЦКИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушскал иаб., д. 4/5

Филиал ППП Патент,.г. ужгород, ул. Проектная, 4 аппарате в течение 30-40 мин нижний слой сливают в трап, а верхний (g бутанольный экстракт) объединяют с бутанольным экстрактом и в течение ночи выдерживают в холодильнике; при этом происходит частичное расслаивание эмульсии. Часть прозрачного верхнего слоя отделяют, а стойкую эмульсию разрушают фильтрованием под вакуумом через слой ваты и фильтровальной бумаги °

Получают 8-9 л экстракта темно-коричневого цвета, который упаривают под вакуумом до объема 15-20 мп, и добавлением 150-200 мл петролейного эфира (10-кратный объем) осаждают препарат.

Осадок отфильтровывают, промывают вначале петролейным, а затем диэтиловым эфиром и высушивают при комнатной температуре в вакуум-экснкаторе до постоянного веса.

3)

Получают 2-3 r антибиотика, который представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета, частично растворимый в воде. его распределяют между водой и бутанолом. Из водного раствора получают 0,8-1,5 r кремового порошка, хорошо растворимого в воде, низших спиртах, а также диметилформамиде; ограниченно растворимого в ацетоне, хлороформе, бензоле (как на хо- 30 лоде, так и при повышенной температуре); практически не растворимого в петролейном и диэтиловом эфирах. Препарат считывается активным, если он обладает антидегидразной активностью 35 в концентрации 1 мг/мл.

Пример 2. 19 л культуральной жидкости, полученной по способу, описанному в примере l, после отделения мицелиальной массы (pH 6-7) перемешивают в течение 40-50.мин с 95 г активированного угля. Уголь отфильтровывают, проьивают 2-3 раза дистиллированной водой (300 мл) и высушивают на воздухе. Элюацию активного вещества проводят дважды десятикратным количеством ацетона (950 мл), Ацетоновые экстракты объединяют, упаривают в вакууме (10-20 мм рт.ст .) при температуре водяной бани 35-40 С и остаток в виде маслянистой массы темно-желтого цвета растворяют в 20 мп метилового спирта. Двухкратной экстракцией петролейным эфиром (2 раза по 20 мл) удаляют масла, а метанольный слой упаривают в вакууме. Остаток растворяют в

10 мл смеси метилового и бутилового спиртов (1:1), и активное вещество осаждают 70 мл эфира. Маточный раствор (темно-желтого цвета) сливают декантацией, осадок хорошо отжимают на фильтре Шотта, промывают эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Получают

0,7 л препарата в виде аморфного порошка кремового цвета, соответствующего по свойствам препарату, полученному по примеру 1.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика реумицина, отличающийся тем, что культуру Ас(Ьюжусез vectvs bvunevs штамм Ф 5000-23 выращивают на среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционньвии методами.