Способ получения пептидов

Способ получения пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

0 и и c,,À::8

ИЗОВРЕТЕН ИЯ н 454736

Союз Советскив

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (51) М. Кл. С 07с 10352 (22) Заявлено 24.09.71 (21) 1700240 23-4 (32) Приоритет 26.09.70 (31) P 2047413.9 (33) ФРГ

Опубликовано 25.12.74. Бюллетень ."А 47

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088 S) Дата опубликования описания 27.02.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дитер Гиллессен (ФРГ) Ханс Кюнци, Рольф Штудер (Швейцария) Эрнст Байер и Манфред Муттер (ФРГ) Иностранная фирма

«Ф. Гоффманн — Ля Рош и Ко, АГ» (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (61) Зависимый от патента

Изобретение относится к получению пептидов на полимерных носителях в гомогенной фазе.

Известный способ получения пептидов на полимерном носителе в органическом растворителе состоит в том, что N-защищенную аминокислоту в виде соли конденсируют при нагревании в органическом растворителе с хлорметилированным полистиролом. N-защиту удаляют известными методами и необходимую аминокислотную последовательность создают конденсацией полимер — аминокислоты с соответствующими N-защищенными аминокислотами в растворе. После каждой стадии полимер — пептид отделяют от низкомолекулярных веществ осаждением. После постройки аминокислотной последовательности пептид отделяют от полимера. Применение известного способа связано с некоторыми трудностями. Вопервых, присоединение первой аминокислоты к полимеру требует относительно жестких условий реакции (нагревание в присутствии триэтиламина). Во-вторых, осаждение полимерпептида после каждой стадии происходит не полностью, вызывает его фракционирование и увлечение в осадок низкомолекулярных примесей. Это приводит к потерям целевого пептида и его загрязнению.

Предлагаемый способ получения позволяет избежать указанных трудностей. N-защищенную С-концевую аминокислоту создаваемого пептида связывают в мягких условиях в растворе сложноэфнрной связью с гидроксилсодержащим полимером — носителем с мол. в.

1С 10 000 — 100 000. В качестве полимера — носителя могут быть использованы полиэтиленгликоли, их сложные эфиры с лимонной кислотой, сополимеры полиэтиленгликоля с янтарной кислотой и т. д. Образование сложной

1s эфирной связи можно проводить, например, с помощью дициклогекснлкарбодинмида. Можно также предварительно вводить

С-концевую аминокислоту в мономер, а затем получать полимер-носитель с присоединенной

20 аминокислотой. N-защиту с полимер — аминокислоты удаляют, например, ацидолнзом или гндрированием. Полимер отделяют от низкомолекулярных веществ днализом, ультрафильтрацией, колоночной хроматографией пли про25 тивоточным распределением, а не осаждени10

15 ем, как в известном способе. Дальнейшее ступенчатое наращивание нептидной цепи ведут как обычно, применяя для образования амидной связи дициклогексилкарбодиимпд, алкнлхлорформнат, азпды нлп активнрованные эфиры N-защищенных аминокислот. Реакцию проводят в растворе в органических растворителях. Для водорастворимых полимеров — носителей возможно образование амидной связи в водной среде, В этом случае как конденсирующее средство применяют водорастворимый карбодиимид. После каждой стадии конденсации

N-защиту отщепляют подходящим способом и полимер отделяют от низкомолекулярных веществ. Разрушение связи готового нентида с полимером-носителем проводят известными методами, например щелочным гидролнзом или аммонолизом. Пептид отделяют от полимера одним из указанных методов.

Пример 1. Этерификация БОК -валил-ОН с ПЭТ " (мол. в. 20000).

20 г ПЭГ 4,34 г БОК-валил-ОН и 4,12 г

ДЦК""""" растворяют в 200 мл СН С1 и перемешивают при комнатной температуре без доступа влаги в течение 5,5 суток. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, прибавляют 100 мл 4 н. НС1/диоксана, перемешивают при комнатной температуре в течение

30 мин и выпаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют примерно в 1 л воды. Образующийся при этом осадок выделяют при помощи фильтровального вспомогательного вещества. Фильтрат доводят до рН 6 при помощи

КаОН или триэтиламина и ультрафпльтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10 пока в фильтрате можно обнаружить свободный валин. Фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток высушивают смесью бензола с абсолютным этанолом (80/20)до постоянного веса.

Выход Н-валил-ПЭГ 19,35г. Содержание аминокислоты 80%, или 0,08 ммоль/г (аминокислотный анализ).

Б. Синтез пептида. 5 r Н-валил-ПЭГ растворяют в 50 мл СН С1 и прибавляют 0,1 мл триэтиламина. После прибавления 0,44 r БОКглицил-ОН (2,5 ммоля) и 0,515 r ДЦК (2,5 ммоля) перемешивают 2 часа при комнатной температуре, выпаривают досуха в вакууме, в течение 30 мин обрабатывают прн комнатной температуре 40 мл 4 н. НС1/дноксана и снова выпаривают досуха в вакууме. Маслянистый остаток растворяют в 500 — 700 мл воды, осадок отделяют, фильтрат доводят до рН

6 при помощи NaOH илн трнэтиламнна и подвергают ультрафильтрацпн через Днафло ультрафильтр УМ 2. Фильтрат обрабатывают.

Выход Н-глицил-валил-ПЭГ 4,85 г.

Указанным образом к Н-глицил-валил-ПЭГ прибавляют триэтнламнн и приводят в реакцию с 2,5 мм БОК-аланил-ОН и 2,5 ммоль

* БОК вЂ” трет-бутоксикарбоиил

*"ПЭà — полиэтилеигликоль

**""ДЦК вЂ” лициклогексилкарбодиимид

ДЦК. После отщенления защитной группы и ультрафильтрации получают 4,75 г Н-аланилглнцнл-валил-ПЭГ. Соответствующим взаимодействием Н-аланил-глицил-валил-ПЭГ с

БОК-лейцнл-OH и ДЦК получают Н-лейцилаланил-глицнл-валил-ПЭГ (4,5 г). Аминокислотный анализ гидролизованной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцнл =1,08: 1,00: 0,90: 1,04.

В. Отщенление тетрапентида от носителя.

Раствор 4,0 г Н-лейцил-аланил-глицил-валилПЭГ в 75 м воды и 1,5 мл 1 н. КОН перемешивают в течение 2 час при комнатной температуре, точно нейтрализуют 1,5 мл 1 н. НС1 и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр

УМ 10 до тех пор, пока не будет собрано 3,5 л фильтрата. Он дает после выпаривания в вакууме 280 мг сырого продукта, который частично освобождают от NaC1 дигерированием абсолютным метанолом. Метанольный раствор обеспечивают углем, фильтруют и выпаривают досуха. Остаток растворяют в воде и лиофнлнзуют. Получают 191,5 мг сырого тетранентида, амннокислотный анализ которого показывает следующее соотношение аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил=1,03:

: 1,00: 0,85: 1,07. Доля нептида в сыром веществе составляет 35% (аминокислотный анализ), т. е. рассчитанный на первую аминокислоту (валин) общий выход составляет 45%.

Вещество идентично заведомому образцу, полученному но методу Меррифилда.

Пример 2.

А. K 4,34 r БОК-валил-ОН и 2,8 мл триэтнламина в 80 мл СН С1 нрикапывают при неремешиванни при — 5 С 1,91 мл этилового эфира хлоругольной кислоты в 20 мл СН С1, через 30 мнн при — 5 С прибавляют охлажденный (— 5 С) раствор 20 г ПЭГ (мол. в.

20000) и 2,4 г (20 ммоль) диметиламинопиридина в 100 мл СН С1 . Реакционную смесь перемешивают в течение часа при — 5 С и 65 час нрн комнатной температуре. Для блокировки не нрореагировавших гидроксильных групп перемешивают реакционную смесь 4 часа с

10 ммолями уксусного ангидрида и 10 ммоль триэтнламина нри комнатной температуре и вьшаривают в вакууме досуха. Остаток обрабатывают 30 мин при комнатной температуре !

00 мл 4 н. НС1 в диоксане, выпаривают досуха в вакууме и растворяют примерно в 1 л воды. После фильтрации и установки рН ультрафнльтруют и обрабатывают как описано выше. Выход 19 г Н-валил-ПЭГ. Содержание аминокислоты 60%, или 0,06 ммоль/г (аминокислотный анализ).

Б Исходя из 12,7 г Н-валил-ПЭГ, синтезируют описанный в примере 1Б тетрапептид тем же образом. Реагенты: 1 ммоль триэтиламина, 4,0 ммоля БОК-аминокислоты, 4,0 ммоля ДЦК. Получают 11,5 г Н-лейцил-аланилглицил-валил-ПЭГ со следующим соотношением аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил =-0,88: 0,86: 1,11: 1,00.

454736

15 г0

65

В. Как описано в примере I В, гидролизуют

10 г Н-лейцил-ал анил-глици ч-валил-ПЭ Г в

100 мл воды и 3 мл 1 н. КОН. После нейтрализации, ультрафильтрации и обработки получают 300 мг сырого тетрапептида, который имеет следующее соотношение аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил=0,96: 0,91:

: 1,24: 1,00. Для пептида в сыром продукте составляет 41% (аминокислотный анализ), т. e., считая на первую аминокислоту (валил), общий выход составляет 57% от теопетпческого.

Пример 3. К 6 r Н-валил-ПЭГ (80%, 0,5 ммоля валина и 0,09 мл тпиэтилампна (0,6 ммоля), раствопенным в 600 мл СН.СI.. прибавляют 1,05 г БОК-глицил-ОНФ (3.5 ммоля) и перемешивают 24 часа при комнатной температуре. После выпаривания в вакууме остаток перемешивают 30 мин при комнатной темпепатуре с 60 мл трифторуксусной кислоты/СН.CI> (1: 1) и вновь выпаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют примепно в

700 мл воды, фильтруют и фильтрат доводят до рН б при помощи NaOH.

После ультрафильтпации (диафло ультрафильтр УМ 10) обрабатывают как описано в примере 1Б. Выход Н-глицил-валил-ПЭГ

5,88 r.

Аналогично примеру 1Б Н-глицпл-валилПЭГ обрабатывают БОК-лейцил-ОНП. Получают 5,6 r Н-лейцил-аланил-глпцил-валилПЭГ со следующим соотношением амттнокпслот: валил: глицил: аланил: лейцил= 1,00:

: 0,70: 0,78: 0,71. 5,6 г Н-лейцпл-аланпл-глпцил-валил-ПЭГ гидролизуют по прпмепу I В п отщепленный тетрапептид обрабатывают соответственно. Получают 250 мг сырого тетрапептида со следующим соотнотпением аминокислот: валил: глицттл: аланил: лейцттл=1,00:

: 0,83: 0,93: 0,88. Доля пептида в сттпо т тетрапептиде составляет 32%, т. е., считая v„-: первую аминокислоту (валин), обтттттй выход составляет 50% от теоретического.

Пример 4.

A. 10 г ПЭГ (мол. в. 20000), 1,75 г БОт глицил-ОН и 2.06 г ДЦК растворяют в 100 мл

СН2С1 и перемешивают в течение 6 суток прп комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, прибавляют

100 мл 1,2 н. HCI в ледяной уксусной кислоте и перемешивают 20 мин при комнатной темпер атуре.

Растворитель отгоняют в вакууме, а к остатку прибавляют 100 мл воды. Полученныч осадок отделяют центрифугированием. Прозпачньтй верхний слой декантируют, доводят „n

DH б триэтиламином и ультрафильтрутот через

Диафло ультрафильтр УМ 10 до тех пор, пока чльтрафильтрат еще содержит глицил-ОН.

Остаток выпаривают в вакууме и следы воды дважды азеотропно отгоняют с бензолом. Продукт сушат в экссикатопе до постоянного веса.

Выход Н-глицил-ПЭГ 9,8 г, содержание аттттнокислоты 0,06 ммоль/r.

Б. 9,8 г Н-глицил-ПЭГ растворяют в 60 м.ч

СН С12 и нейтрализуют 0,7 ммоля N-метилморфолпна. В отдельном сосуде раствопяют

3 ммоля БОК-лейцпл-ОН в 5 мл СН.С1. и

1 мл:тттатетттлсттопмахтттда, нейтпалттзуют 3 ммоля Х-метилмог>фолпна, охлаждают 70 — 20 С, прибавляют 2,6 ммоля ттзобутттлхлопофомтттата и перемешивают 10 мпн прп — 20 . Смешанньш ангттдрттд ппибавляют при — 20 С к раствору Н-глттцпл-ПЭГ и переметтитвают в течение часа прп — 20 п 2 часа прп 4 С. Раствопптель отгоняют. остаток обрабатывают

15 мпн ппп комнатнотт тнмпературе 50 мл

1,2 н. HCI в ледяной уксусной кислоте п опять выпариватот в вата уме досуха. Остаток паствопяют в 100 мл воды, доводят до пН 6 водньтм паствопом апетата натппя и ультпат1тттчттр ют чепез Диафло ультпафильтр УМ 10.

Остаток выпаппвают в вакууате досуха, дважды азеотрогно вьтсутттттватот с бензолом и сутпат в эксспкаторе. Выход Н-лейцил-глттцттлПЭГ 9.5 г.

Аналогично сочетают другие амттнокислоты в вттде следутотттпх ттпоттзводньтх". БОК-аланттлОН, БОК- (О-бензпл) -тпеонил-ОН, ROK-лейцпл-ОН, ВОТ -валттл-ОН, БОК/О-бензтт.т) -тпеопп,l-ОН, БОК-валил-ОН. После последнего сочетания пол чают 8,0 г.

Н-валттч-тпеонил - валил - лсйцпл — тпеонил-! бснзпл бензпл а laнпл-лейцпл-глттцпл-О-ПЭГ

Ана чиз аминокислот гттдролизттпованной пробы этого вещества даl следующий результат: глттцпл: лейппл: аланил: треонил: валил=1,0: 1,89: 1,67: 1,0. Значенття для отдельных амттнокпслот получили из результатов анализов аминокислот на промежуточных ступенях.

Пример 5.

A. Лимонную кттслотч этерифицируют в сложный эфир с ПЭГ (мол. в. 6000 т с помоnIbEo эквпмо,тяпного количества ДЦТ (пассчцтано на ПЭГ) в метт ленхлопиде (10%-ный раствор) в течение 3 суток. Растворите,чь отгоняют, остаток пастворяют в воче и полученньпт осадок отттентрттфугттпт тот. Раствор ультрафттльтпутот (Ааттткон, УМ-2-фильтр) упаривают г-. вакvyiEe и остаток сутпат до постоянного веса. Выхоч 80",от теопет:тческого. Высушенный полтптер этерпфицттруют БОК-ва,lIl;I-ОН и ДЦК (оба компонента в 5-кратном избытке, счтттая на 0,2 ммоль/г функциональ ных гр пи на полтптепе) в 10о/р-ном растворе в СНзС1-. в течентте 3 суток при комнатной темттерат ре. Содержание аатттнот<ттслотьт в полимере после прттнятой обработктт тт отщеттления ВОТ -группы с 4 н. НСI/диоксан:

: 0.2 ммо,чь/г.

Б. По ДЦК-методу по.ч чают следующие актттв1тпованньте c,тожные эфиры:

*) 3-кратный избыток ПчГ, считая на функциональные группы лимонной кислоты

464736

БОК-глицил-ОНФ, ) (ЯФ вЂ” e-нитрофенпл

БОК-лейцил-ПХФ ", БОК-глутаминил-ОНФ.

Сочетания проводят следующим образом.

1 ммоль (5 г) Н-валил-полимера растворяют в 50 мл СН С1 /диметилформамид (1: 1), нейтрализуют 1,2 ммоля N-метил-морфолина и прибавляют 3 ммоля активированного эфира

БОК-аминокислоты. Через 5 мин к раствору прибавляют еще 1,2 ммоля N-метил-морфолина и перемешивают 2 часа при комнатной температуре. Растворитель отгоняют в вакууме, к остатку прибавляют 50 мл 4 н. НС1/диоксана и оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре. После повторной отгонки растворителя растворяют остаток в смеси воды/этанола (3: 1) и ультрафильтруют при помощи Диафло ультрафильтра УМ-2. Остаток сушат. Выход Н-глицил-лейцил-валил-полимера 4 г. Результат аминокислотного аналпза гидролизованной пробы: валил: лейцил: глицил: глутаминил=1,0: 0,9: 1,0: 0,98.

2,0 г Н-глутаминил-глицил-лейцил-валил-полимера перемешивают 4 час в 0,2 н. КОН (50 мл) при комнатной температуре, нейтрализуют 2 н. НС1 и пропускают через колонну (2,5;к,100 см) с Сефадексом G-25. Сырой пептид Н - глутамипил — глицил - лейцил — валилОН получают с выходом примерно 50%.

Аминокислотный анализ дает следующие значения: валил: лейцил: глицил: глутаминил=1,0: 0,88: 1,05: 0,98.

Пример б.

А. ПЭГ (мол. в. 4000) этерифпцпруют 10кратным избытком БОК-глицил-ОН и ДЦК в

10%-ном растворе СН С1 в течение 5 суток при комнатной температуре. После этого отщепляют защитную группу, растворитель отгоняют, остаток растворяют в воде и полученный осадок отделяют центрифугированием.

Раствор ультрафильтруют с Диафло ультрафильтром УМ-2, растворитель отгоняют и остаток сушат. Содержание аминокислоты найдено аминокислотным анализом как 100%-ное.

Малеиновую кислоту подвергают взаимодействию с и-нитрофенолом и ДЦК, получая диОНФ-эфир малеиновой кислоты. Выход примерно 80% от теоретического, температура плавления 185 †1 С. На двойную связь полученного таким образом сложного эфира малеиновой кислоты присоединяют йодоводород.

Полученный ди-и-нитрофениловый эфир монойодянтарной кислоты подвергают взаимодействию с Ag-солью БОК-валил-ОН, получая ди-ОНФ-эфир БОК-валил-О-янтарной кислоты.

Эквимолярные количества ПЭГ-глицил-Н (нейтрализованный N-метил-морфолином) и ди-ОНФ-эфира БОК-валил-О-янтарной кислоты растворяют в СН С! диметилформамидс (1: 1; 10-ный раствор) и перемешивают прп комнатной температуре 24 часа. После этого отгоняют растворитель, остаток растворяют в воде и ультрафильтруют (Диафло ультра"") 1 Х9 . я I1T;1_#_JlOp$0klll, 10

60 фильтр УМ-10), пока толидиновая проба в ультрафильтрате не станет отрицательной.

Фильтрат упаривают в вакууме и остаток сушат. Аминогруппы Н-глицил-ПЭГ после этого подвергают взаимодействию с ангидридом 3сульфопропионовой кислоты. Из полученного продукта отщепляют БОК-группу прп помощи

4 н. НС1/диоксана. Полученный полимер имсет мол. в. выше 20000 (согласно удержаншо).

Б. 2 г полученного полимера и 6 ммолей

БОК-лейцил-ПХФ перемешивают l; 20 мл

СН С1 /диметилформамида (1: 1) 3 ",ас при комнатной температуре (через 5 мпн прибавляют к реакционной смеси 2 ммоля N-метилморфолина). После этого отгоняют растворитель в вакууме, остаток обрабатывают 20 мин

40 мл 4 н. НС1/диоксана и растворитель опять отгоняют. Остаток растворяют в 100 мл воды и хльтрафильтруют (УМ-10). Воду выпаривают и остаток сушат.

Выход 1,9 r. Анализ: валил: лейцил=1,0:

: 0,95.

В. 1,9 r дипептид-полимера перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре в

0,2 н. водного КОН, нейтрализуют 2 н. НС! и ультрафильтруют через УМ-10-фильтр. Фильтрат выпаривают в вакууме. Выход сырого продукта 350 мг. Содержание пептнда составляет 70%. Аминокислотный анализ: валил:

: лейцил = 1,0: 0,97.

Пример 7. Сначала этерифицируют БОКглицил-ОН с ПЭГ (мол. в. 200) согласно примеру бА. Удаление изоыточных компонентов проводят ультрафпльтрацией с Диафло фильтром УМ-2 или хроматографией на Сефадексе. Полученный продукт конденсируют аналогично примеру б с ди-ОНФ о-эфиром малепновой кислоты. К продукту конденсации присоединяют йодоводород и йодированный продукт подвергают взаимодействию с Ag-солью

БОК-аланил-ОН.

В качестве растворителя применяют вместо эфира диоксан. После этерификации растворитель отгоняют, остаток растворяют в воде и ультрафильтруют (УМ-10-фильтр). После сушки остатка получают 95% этерифицированного полимера.

После отщепления защитной группы сочетают с БОК-лейнил-ПХФ.

Выход дппептидполимера 1,95 г (93% от теоретического).

Аминокислотный анализ: алании: лейцил=

1,0: 1,01. Отщепление пептида от полимерного носителя дает 300 мг сырого продукта.

Выход:ю данным аминокислотного анализа

80% от теоретического: аланпл: лейцпл =

1,0 : 1,0.

Пептид однороден при тонкослойной хроматографии в системе ледяная уксусная кислота (бутанол) вода (3: 1: 1).

Пример 8.

А. 10 г ПЭГ (моль. г. 20000), 1,1б r БОКизолейцил-ОН и 1,03 г ДЦК растворяют в 454736

*) U — бензилоксикарбонил

100 мл CH Cl и перемешивают 6 суток при комнатной температуре без доступа влаги. Реакционную смесь выпаривают досуха в вакууме, прибавляют 50 мл 4 н. НС1/диоксана и перемешивают 30 мин при комнатной тем.!ературе. После отгонки растворителя остаток растворяют в 100 мл воды и выпавший осадок отделяют центрифугированием. Отдекантированный раствор доводят до рН 6 при помощи

2 н. NaOH и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ-10. Фильтрат выпаривают досуха в вакууме и сушат. Выход Н-изолейцил-ПЭГ 9,8 г. Содержание изолейцила, согласно аминокислотному анализу, 0,07 ммоль

/r (70% от теоретического) .

Б. Полученный продукт сочетают по очереди с БОК производными аланнна, валина и фенилаланнна по следующей схеме. 10%-ный водный раствор полимера доводят до рН 39 при помощи 4 н. КаОН или 5 í. H SO„H охлаждают до 4 С. В отдельном сосуде растворяют БОК-аминокислоту (5-кратный избыток по сравнению с амипокомпонентной) в 2—

3 мл диметилформамида и прибавляют к водному раствору полимера, поддерживая рН 3,9 постоянным. При тех же рН и температуре при перемешивании прибавляют эквимолярное

БОК-аминокислоте количество и-толуолсульфоната N-циклогексил-N -1р- (N-метил-морфолино) -этил) - карбодиимид-и - толуолсульфонат, поддерживая рН 3,9 при помощи 5 н.

Н SO4. Примерно через 15 мин, когда рН больше не изменяется, доводят рН до 7,0 при помощи 4 и. NaOH и перемешивают 30 мин при комнатной температуре.

Затем рН опять доводят до 3,9 н снова прибавляют эквнмолярное количество конденсирующего средства. Раствор оставляют на 3—

4 часа при рН 7,0 и комнатной температуре и ультрафильтруют. Выпариванием в вакууме получают тетрапептнд-полимер.

В. Тетрапептид-полимер (9 г) обрабатывают 24 час 2 н. КОН в смеси воды/диоксаиа (9 г в 50 мл) нейтрализуют и подвергают гель-фильтрации через колонну (2,5 (80 см) с Сефадексом G-15 в водном растворе. Воду отгоняют (при 40 С). Остаток растворяют в метаноле, растворитель отгоняют и пептнд сушат. Выход сырого Н-аланил-валил-фенилизолейцил-ОН: примерно 300 мг (не совсем свободен от солей). Амииокислотный анализ дает выход примерно 0,5 ммоля (75 о от теоретического, считая на содержание аминокислоты в полимере).

Результат анализа после хроматографии на колонне: изолейцил: фенил: валил; аланил = 1,0: 0,99: 0,90: 0,97.

Пример 9.

А. 20 г ПЭГ (мол.,в. 20000), 5,0 г Ц" -валил-ОН» 4,2 г ДЦК растворяют в 200 мл

СН С12 и перемешивают 10 суток при комнатной температуре без доступа влàжности.

К реакционной смеси прибавляют 1,2 iiз ле5

60 5 дяной уксусной кислоты, перемеши вают еще

20 час и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 300 мл МеОН, прибавляют

5 мч 4 н. НС1/МеОН и гидрируют,над Pd/С при комнатной температуре н нормальном давлении, пока поглощается водород. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют примерно в 1 л воды и образующийся осадок отделяют. Фпльтрат ультрафильтруют через

Диафло ультрафильтр УМ-10 и его обрабатывают дальше, как описано в примере 1А.

Выход 18,8 г Н-ва,тил-ПЭГ НС1.

Содержание аминокислоты 88%, или

0,088 ммоль/г (аминокислотный анализ).

Б. 10 г Н-валил-ПЭГ. НС1 растворяют в

50 мл СН С1, охлаждают,до — 20 и раствор доводят до рН 8 — 9 прибавлением 0,11 мл

N-метилморфолина. 1,05 г Ц-,глицил-ОН растворяют в 10 мл тетрапидрофурана, охлаждают до — 20, прибавляют 0,55 in N-метилморфолина и 0,65 мл изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты и перемешивают

5 мин при — 20 . Эту смесь прибавляют к охлажденному до — 20 раствору Н-IBàëèëПЭГ и перемешивают 30 мин ниже — 10, 30 мин ниже 0 и 3 час при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 200 vn

МеОН, прибавляют 1,25 мл 4 н. НС1/МеОН и

Pd/С и гидрируют,при комнатной температуре и нормальном давлении до окончания поглощения,водорода. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме Аосуха, остаток растворяют примерно в 1 л воды, фильтруют и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ-10. Фи IbTpBT от ультрафильтрации вы наяривают досуха в вакуу»е, сушат при помощи бензола/абсолютного этанола (80/20) и ночь в экссикаторе до постоянного веса.

Выход Н-глицил-валил-ПЭГ.НС1 8,0 г.

Аналогично доводят 4,0,г Н-глицил-валилПЭГ НС1 до рН 8 — 9 при помощи 0,05 мл

N-метилморфолина и подвергают взаимодействию с раствором смешанного ангидрида, изготовленным из 500 мг Ц-аланил-ОН, 0,22 мл

N-метилморфолина и 0,26 in изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 5 мл тетрагидрофурана. После отщепления защитной группы и ультрафильтрации получают 3,8 г

H-aëàHin-глицил-валил-ПЭГ- НС1. Соответствующим взаимодействием этого продукта с

Ц-лейцил-ОН, N-метилморфолином и изобутиловым эфиром хлормуравь иной кислоты получают после отщепления защитной группы и ультрафильтрации 3,5 r Н-лейцил-аланилглицил-валил-ПЭГ НС1.

Анализ аминокислот гидролизированной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот: валил: глицил:

: алани7: :лейцил=1,00: 0,89: 0,92: 0 94.

В. 3,4 г Н - лейцил - аланил - глицил - валилПЭГ. НС1 гидролизуют аналогично примеру

l в 62 мл воды при помощи 1,25 мл 1 н, 4о4736

Сос-авитель А. Васильев

Корректор T. Хворова

Редактор Н. Джараглти

Техред Т.

Миронова

Изд, Хо 239

Подписное

3 .: к; 250, I5

Тираж 506

Сапунова, 2

Trrrrorpar1rrrsr, rrp.

КОН. После нейтрализации, ультрафильтрации и обработки получают 163 мг сырого тетрапептида Н-лей цил-аланил-глицил-валилОН, который имеет соотношение аминокислот валил: глицил: аланил: лейцил=1,00: 0,94:

: 0,96: 0,96. Доля пептида в сыром пептидном материале составляет 44 /, (аминокислотный анализ), т. е., считая на первую аминокислоту (валин) выход составляет 65%.

П р и м eip 10. 4,0 г Н-глпцил-валил-ПЭГ. .HCI растворяют в 25 мл CH CI, доводят до рН 8 — 9 при помощи 0,05 мл N-метилморфолина и прибавляют раствор 700 мг LI,-лейцилаланил-ОН в 3 мл диметилформамида. К реакционной массе прибавляют 230 мг N-о ксисукцинимида и 420 мг ДЦК и перемешивают

6 час при комнатной температуре. Смесь выпаривают в вакууме досуха, остаток,растворяют в 200 мл МеОН и после прибавления

0,5 мл 4 н. HCI/МеОН и Pd/С гид рируют прп комнатной температуре и нормальном давлении до окончания поглощения водорода. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха и остаток растворяют примерно в 1 л воды. Полученный осадок отделяют и фильтрат ультрафильтруют и оорабатывают.

Выход Н-лейцил -аланил -гли цил -валилПЭГ HCI 3,8 г.

3,7 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ПЭГ.

HCI гидролизуют и обрабатывают аналогично примеру IВ. Получают 161 мт сырого тетрапептида Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ОН с соотношением аминокислот валил: глицил:

: аланил: лейцил=1,00: 0,97: 0,86: 0,83. Доля пептида в сыром пептидном материале составляет 45 /о (аминокислотный анализ), т. е., считая на первую аминокислоту (валин), выход составляет 61 ",о .

Пример 11.

А. Аналогично примеру 9А подвергают взаимодействию в течение 13 суток 20 г ПЭГ (мол. в. 20000) с 5,0 Ц-про-ОН и 4,2 г ДЦК.

После отщепления защитной группы и диафильтрации получают 19,3 г 8- про-ПЭГ НСI.

Содержание аминокислоты 50%, пли 0,05 ммолb/ã (аминокислотный анализ).

Б. 10 г Н-про-ПЭГ.НСI растворяют в смеси 20 мл СН С1 и 40 мл диметилформамида, охлаждают до — 30 и раствор доводят до рН

8 при помощи 0,07 мл триэтиламина.

700 мг пироглутамил-гис-И На растворяют в смеси 10 мл диметилсульфо ксида, 10 мл диметилформамида и 6,3 мл 2,4 н. НСI/тетрагидрофурана при 0, охлаждают до — 20, прибавляют 0,5 мл изоамилн итрита, перемешивают в течение 30 мин при — 20 и нейтрализуют прибавлением 2,1 мл триэтиламина.

Эту смесь прибавляют к также охлажденному до — 30 раствору Н- про-ПЭГ, перемешивают 30 мин ниже 0 и 15 час при 4, выпаривают досуха в ваку уме, остаток растворяют примерно в 1 л воды, ультрафильтруют через

Диафло ультрафильтр УМ-10 и обрабатывают.

Выход пироглутамил-про-ПЭГ 9,9 r.

Найдено соотношение аминокислот про:

: глу=1,00: 0,65. Этот продукт растворяют в

50 мл СН,С1 и доводят до рН 8 при помощи триэтиламина, снова подвергают той же реакции с 700 мг пироглутамин-гис-N O> и обрабатывают как олисано выше.

Выход 9,5 г пи роглутамин-гис-.про-ПЭГ.

Этот продукт показывает соотношение аминокислот про: глу=1,00: 1,00.

В. 5,0 г пироглутамин-гис.про-ПЭГ растворяют в смеси 250 мл МеОН и 25 мл СНаС! .

Раствор при — 5 насыщают сухим ХНз, хранят в течение 36 час при комнатной температуре, еще раз насыщают при — 5, хранят в течение 4 суток прои,комнатной температуре и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в МеОН, выпаривают досуха, растворяют в 750 мл .воды и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ-10. После этого концентрируют раствор сначала до

250 мл и затем диафильтруют с 1,5 л воды.

Фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют примерно в 20 мл МеОН, обрабатывают углем, фильтруют, выпарива1от досуха в вакууме, растворяют в 100 мл воды и лиофилпзируют. Выход сырого пироглутамин-тис-про-NHq 210 мг. Соотношение аминокислот в веществе про: гис: глу = 1,00:

: 0,87: 1,03. Доля пептида в сыром материале составляет 28 (аминокислотный анализ), что соответствует выходу 63о/о, считая иа первую аминокислоту (пролин) .

Предмет изобретения

Способ получения пептидов, о т л и ч а юшийся тем, что аминокислоту, которая связана сложноэфирной связью с растворимым B воде и (или) органическом растворителе гидроксилсодержащим полимером с мол, в.

10 000 — 100 000, например пол иэтилснгл пколем, сочетают в гомогенной фазе известными методами с другими аминокислотами, отделяя полимер — пептид от низкомолекулярных веществ после каждой стадии с помощью диализа, колоночной хроматограф ии, ультрафильтрации или противоточного распределения, и после построения необходимой последовательности пептид отделяют от полимера известными способами.