Способ очистки -аспарагиназы

Способ очистки -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Й И Е (ц 459475

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства 436085 (22) Заявлено 27.07.73 (21) 1952276/28-13 с присоединением заявки ¹ (32) Приоритет

Опубликовано 05.02.75. Бюллетень ¹ 5

Дата опубликования описания 22.04.75 (51) М, Кл. С 0?g 7, 028

С 12с! !3/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий (53) УДК 57?,15.08 (088.8) (?2) Автор з изобретения

В. И. Максимов, Г. А. Молодова, В. М. Денисов, Т. И. Беспалова, Т. И. Данилова и T. П. Уваркина

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ L-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментов из микроорганизмов, как способ очистки фермента 1-аспарагиназы, выделенной из клеток Escherichia

col i.

Известен способ очистки 1-аспарагиназы по основному авт. св. № 436085, по которому биомассу Escherichia со1! в виде ацетонового порошка, содержащую L-аспарагиназу, обрабатывают водой при 37, подкисляют, центрифугируют, осадок отбрасывают, а к раствору, содержащему фермент, добавляют сульфат аммония до 50% от насыщения и нагревают

30 мин до 55, центрифугируют, осадок отбрасывают, а к раствору, содержащему фермент, повторно добавляют сульфат аммония до полного насыщения. Выпавший осадок содержит частично очищенную 1 -аспарагиназу.

С целью получения более очищенной L-аспарагиназы предложено после фракционного осаждения 1 -аспарагиназы сульфатом аммония полученный осадок растворять в буферном растворе в присутствии стабилизатора и осуществлять многократное фракционирование органическим растворителем, преимущественно этанолом.

Целесообразно фракционирование органическим растворителем проводить при температуре 20 — 30 С, осадок растворять в буфере, например в трис-буфере, рН 8,5, содержащем в качестве стабилизатора 0,01 М раствор

1-аспарагина и отделение сульфата аммония проводить лишь после повторных фракциони5 рований органическим растворителем. Для отделения фермента 1 -аспарагиназы от низкомолекулярных веществ можно использовать хроматографию, например, через сефадекс

G — 25.

10 Способ состоит,в следующем. Очистку 1аопарагиназы ведут по известному способу до получения частично очищенного препарата, содержащего остатки сульфата аммония, способного стабилизировать 1-аспарагиназу. Да15 лее без предварительного удаления сульфата аммония очистку 1 -аспарагиназы проводят методом спиртового фракционирования.

Для осаждения L-аспарагиназы применяют достаточно высокую концентрацию спирта, 20 получающуюся при добавлении 1,5 — 2,5 объемов (предпочтительно 2 объема) на 1 объем раствора фермента, т. е. составляющую в итоге 55 — 62%.

Для повышения степени очистки 1-аспара25 гиназы фракционирование спиртом проводят при повышенной температуре (20 — 30 С). Для увеличения выхода путем предотвращения денатурации фермента необходимо добавлять дополнительно стабилизатор 1.-аспарагин.

30 Повышение температуры на стадии спирто459475

Таблица

Способ очистки L-аспарагиназы в единой технологической схеме

Удельная активность, ме/мг белка

Условия

Общий выход, (температура, время) Технологические операции

Обработка отмытых водой клеток Е.coll ацетоном и отделение ацетона

Высушивание ацетонового порошка Е. coll

Экстракция в воду

Комнатная

То же

100

0,5 — 1,5

37 С, 2 — 4 час

Комнатная

Подкисление до рН 4,3 — 4,6

Отделение ферментного экстракта от биомассы

Е, cali

Нагревание с (NH4)ISO (45 — 50 ) 3 — 5

То же

55 "С, 0,5 час

Отделение ферментного раствора от осадка денатурированных белков

Осаждение фермента с (ИН4),SO4 (85 — 90;б) Комнатная

10О С, 10 — 12 час

Отделение осадка с 1-аспарагиназой и его растворение в буфере

Первое фракционирование этанолом с двумя центрифугированиями и растворением

Второе фракционирование этанолом в тех же условиях

Обессоливание на сефадексе 6 â€

Лиофилизация

10 — 20

60 — 100

Комнатная

20 — 30

20 — 30ч

Комнатная

120 — 150

120 — 150

120 †1

Замороженное состояние белков отделяют фильтрованием через складчатый бумажный фильтр (или центрифугированием 15 мин при 6000 об/мин). К супернатанту добавляют сульфат аммония до 90% насыщения (400 г соли на 1 л жидкости) и оставляют стоять в холодильнике на ночь, после

10 чего центрифугируют. Осадок, содержащий

1 -аспарагиназу, вместе с остатками раствора сульфата аммония растворяют в 60 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего 0,01 М

1 -аспарагина, К раствору добавляют,при ком15 натной температуре два объема спирта (концентрация, не ниже 98 /о), осадок отделяют центрифугированием и растворяют при комнатной температуре в 16 мл трис-буфера, рН

8 5, содержащего 0,01 М 1-аспарагина, 20 Нерастворившуюся часть балластных белков отделяют центрифугированием. К супернатанту повторно добавляют два объема спирта при комнатной температуре, осадок собирают центрифугированием и растворяют в

25 12 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего

L-аспарагин при комнатной температуре. Нерастворившуюся часть балластных белков пового фракционирования влияет на качество получаемого продукта, так как удельная активность L-аспарагиназы, полученной на стаПример 1. Культуру Е. coli В 318 выращивают в ферментере емкостью 250 л на среде с 5 /о кукурузного экстракта с добавлением солей в течение 10 час с аэрацией и перемешиванием при рН 7,0 — 7,2, после биомассу отделяют центрифугированием, промывают водой, обрабатывают ацетоном при,комнатной температуре и высушивают, получают сухой ацетоновый порошок Е. coli, содержащий

1 -аспарагиназу, 50 r ацетонового порошка

E. coli размешивают в 1 л дистиллированной воды и оставляют стоять при 37 С в течение

2 час. Далее к экстракту при комнатной температуре добавляют 1,0 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5, скоагулированный осадок отделяют центрифугированием (15 мин при

6000 об/мин) и отбрасывают.

К супернатанту, являющемуся подкисленным водным экстрактом 1-аспарагиназы, добавляют сульфат аммония до 50% от насыщения (275 г соли на 950 мл экстракта). Раствор помещают в водяную баню на 30 мин при

55 С, охлаждают до комнаТной температуры и скоагулированный осадок денатурированных дии спиртового осаждения при 20 — 30 С, в

5 — 10 раз больше той, которая получается на этой стадии при 4 — 5 С.

459475

Предмет изобретения

Составитель В. Максимов

Техред А. Камышникова

Корректор В. Брыксина

Редактор В. Смирягина

Заказ 678/18 Изд. № 335 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., p,. 4/5

Типография, пр. Сапчнова, 2 вторно отделяют центрифугированием. Раствор с 1 -аспарагиназой пропускают через колонку с сефадексом G — 25 (2,2)(38 см), собирают белковую фракцию и лиофилизируют.

Полученная 1 -аспарагиназа представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в буферах, рН около 8. Удельная активность

130 — 150 ме/мг белка, общий выход в расчете на биомассу около 40%.

Пример 2. Препарат, полученный по примеру 1, до обессоливания и лиофилизации осаждают при комнатной температуре одним объемом спирта и ставят на несколько дней в морозильник. При этом образуются кристаллы 1-аспарагиназы и сульфата аммония. Кристаллы отделяют центрифугированием и далее обрабатывают как в примере 1 после спиртового осаждения. Удельная активность

180 ме/мг белка, выход 60 — 80%. Чистоту полученного таким образом препарата аспарагиназы контролируют электрофорезом в,полиакриламидном геле, получают 1 полосу, что указывает на гомогенность белка.

Активность определяют инкуб ацией фермента с 1-аспарагином в трис-буфере, рН 8 5 по освобождающемуся аммиаку методом несслеризации. Для освобождения фермента от стабилизаторов (сульфата аммония и 1-аспарагина) раствор перед определением активности обессоливают на сефадексе G — 25. Активность выражают в ме/мг белка (1 ме — соответствует 1 микромолю продукта, образовавшегося при инкубации в течение 1 мин при

37 С). Белок определяют по Лоури, причем перед определением раствор очищают полностью от сульфата аммония.

1. Способ очистки 1-аспарагиназы по авт. св. № 436085, отличающийся тем, что, с

1О целью получения более очищенной L-аспарагиназы, после фракционного осаждения 1-аспарагиназы сульфатом аммония, полученный осадок растворяют в буферном растворе в присутствии стабилизатора и осуществляют

15 многократное фракционирование органическим растворителем, преимущественно этанолом.

2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракционирование органическим раство20 рителем осущетвляют при 20 — 30 С.

3. Способ по пп. 1 — 2, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют трис-буфер при рН 8,5.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся

25 тем, что при растворении осадка в качестве стабилизатора используют 0,01 М раствор

1 -аспарагина.

5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что после фракционирования органиче30 ским растворителем осадок растворяют и пропускают через хроматографическую,колонку, например сефадекс G — 25.