Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

O Il H C A H, H -E-- - 459895

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 15.06.63 (21) 842207/31-16 (32) Приоритет (51) М. Кл. С 12с1 9/14

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Опубликовано 05.02.75. Бюллетень № 5 (53) УДК 615.779.931 (088,8) до делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 11.04.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Сильви Пинер и )Кан Предом (Франция) Иностранная фирма

Рон-Пуленк, С. А. (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к области медицины.

Способ получения предложенного антибиотика в патентной литературе не известен.

Целью изобретения является получение нового антибиотика, обладающего активностью в отношении ряда гр ам-положительных и грам-отрицательных микроорганизмов, а также противоопухолевой активностью.

Эта цель достигается тем, что культуру

Streptomyices coeruleorubiclus 8899 или 31723 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, в течение 2—

5 дней при температуре 23 — 35 С и начальном рН среды 6,0 — 7,8 с .последующим выделением, очисткой и разделением целевого продукта известными приемами.

Новый антибиотик растворим в хлорированных растворителях, таких как хлороформ и дихлорэтан, относительно растворим в подкисленной воде с величиной рН от 3 до 4, очень слабо растворим в спиртах и практически не растворим в воде, бензоле и простом эфире. Он характеризуется следующими физическими свойствами: красно-оранжевый аморфный порошок с характерным спектром (см. фиг. 1), Путем хроматографии на различных адсорбентах или противоточным распределением препарат разделяют на два активных составляющих компонента. Один из активных компонентов (13.057. R.P,) представляет собой красный аморфный порошок, т. пл. 155 — 170 С, 5 с характерным спектром (см. фиг. 2), растворим в спиртах и хлороформе, очень мало растворим в воде и кстонах, практически не растворим в бензоле и простом эфире. Другой активный компонент (13.213Я.P.) красно10 оранжевый аморфный порошок, с характерным спектром (фиг. 3), мало растворим в спиртах, практически не растворим в воде, бензоле и простом эфире.

Пример 1, В 170-литровый бродильный

15 чан загружают:

Отвар кукурузной муки (Corn steep) 2,400 кг

Сахарозы 3,600 кг

Карбоната кальция 0,900 кг

20 Сульфата аммония 0,2-10 кг

Воды до получения 100 л.

Величина рН этой среды культуры составляет 6,15. Ее стерилизуют текучим паром при

122 С в течение 40 мин. После охлаждения

25 объем бульона составляет 120 л, а величина рН 7,20. Среду затем засевают 200 смз штамма «Streiptomyces 31.723», находящегося в конической колбе, которую при этом взбалтывают. Культуру выдерживают при 26 — 27 С в те459895

3О

65 чение 27 «ac, †..ðè переиешивании и аэрации стерильным воздухом. После этого она приголНа g;i>i засева гроизводящей культ; pbi.

Производящую культуру вырабатывают в

800-литровом бродильно ;. чане, куда помещают следующие и;- гредиепты:

Соевая мука 20 кг

Барда 2,500 кг

Крахмал 10 кг

Соевое масло 2,500 л

Хлористый натрий 5 кг

Вода до получения 465 л.

Величину рН полученной таким образом среды доводят до 7,20 с помощью 400 см концентрированного едкого патра. Среду затем стерилизуют текучим паром при 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона составляет 500 л, а величина рН

6,75. Затеи среду засевают 50 л указанной культуры в 170-литровом бродильном чане.

Культуру выдерживают при 28 С в течение

67 час при взбалтывании и аэрации стерильным воздухом. Величина рН этои среды 7, 740 объем сусла 520 л. Количество присутствующего в среде антибиотика составляет

29 ед//см .

Пример 2. Засевают питательную среду в

170-литровом бродильном чане в тех же условиях, что и в примере 1, но с помощью

200 см культуры штамма «Streptomyces

8899», находящейся в конической колбе, которую при этом взбалтывают.

Производящую культуру зате;i вырабатывают в 800-липровом бродильном чане, загруженном таким же образом, как это указано в примере 1.

Величину рН среды доводят до 8 — 10 с помощью концентрированного едкого натра. Затем среду стерилизу."от текучим паром при

122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона составляет 500 л, а величина

P Н 6,80. Затем среду засевают с помощью

75 л указанной культуры в 170-литровом бродильном чане. Культуру выдерживают при

26 — 27 С в течение 67 час при взбалтывании и аэ ации стерильным воздухом. Величина рН этой среды равна 7,40, а объем сусла 5;5 .. р

Количество присутствующего в среде антибиотика составляет 9,1 ед/см, Пример 3. Сусло, полученное как описано в примере 1 (520 л при титре 29 ед/см ), помещают в чан, снабженный мешалкой.

Величину рН доводят до 1,8 с помощью концентрированного раствора щавелевой кислоты.

Взбалтывают в течение часа, а затем добавляют 20 кг вспомогательного материала для фильтрации. Смесь отфильтровывают на фильтр-прессе, а осадок после фильтрования промывают 100 л воды, подкисленнои до р Н

2 с помощью щавелевой кислоты. В фильтрат, объем которого составляет 612 л, добавляют концентрированный раствор едкого натра до тех пор, пока величина рН не достигнет 4,5.

После этого фильтрат направляют на колонку, содержащую 20 л Лмберлита 1RC 50 в кнслотном цикле (диаметр ко io iки 1о,2 c;,:, высота колонки 200 си, высота с;.oi с::олы в колонке

110 c»). Фильтрат пропускают через слой

Лмберлита снизу вверх при расходе !0 л/час.

Затем колонку промывают 100 л воды, из расчета 50 л/час, циркулирующей снизу вверх, rIoc ie 3 Ioro ее riромывают 75 л метанола, содержащего 10% воды. Метанол циркулирует сверху вниз при расходе 50 л/час в течение полуторачасов. Удаляют промывочные воды и колонку вновь элюируют раствором следующего состава:

Хлористый натрий 10 г

Вода 100 cMç

Метанол до получения 1000 см .

Объем элюата, который содержит большую часть антибиотика, составляет 100 л. его концент рируют под пониженным давлением и при температуре 35 С до получения объема

10 л.

Концентрат постепенно экстрагируют при рН 7,5 двумя порциями хлороформа по 5 л.

Величину рН хлороформного экстракта доводят до 4 с помощью раствора уксусной кислоты в хлороформе (10: 100 по объему), затем экстракт концентрируют при 30 С под пониженным давлением до получения объема

100 см . Лнтибиотик осаждают добавлением

1 л гексана, цептрифугируют, промывают и высушивают. Получают 9 г красного аморфного порошка с титром 1400 ед/мг.

Пример 4 17,1 г сырого п родукта, полученного таким образом, как это описано в примере 3 (титр-1530 ед/мг) растворяют при взбалтывании в смеси, составленной из 1,5 л хлористого метилена, 0,3 л четыреххлористого углерода и 1,8 л воды. Величину рН доводят до 3 добавлением 8 см 1 н. соляной кислоты. После декантации водную фазу обрабатывают 7 л хлористого метилена и 200 смэ

0,1 н. едкого натра, чтобы довести величину рН до 7,5. Снова декантируют и экстрагируют водную фазу при рН 7,5 с помощью 3 5 л хлористого метилена. Экстракты хлористого метилена соединяют и концентрируют до 100 см .

После добавления в концентрат 1 л гексана получают продукт осаждения, который отфильтровывают, промывают и просушивают при 30 С под пониженным давлением. Получают 9,15 r антибиотика в виде красно-оранжевого аморфного порошка с титром

2180 ед/мг.

Пример 5. Готовят смесь, состоящую из хлористого метилена, четыреххлористого углерода и буферного раствора Мак Ильвэна с рН 5,8 буферного раствора (20 см этого буферного раствора приготавливают добавлением 12,09 см 0,2 м раствора двузамещенного фосфата натрия Na>HPO4 к 7,91 см 0,1 м лимонной кислоты (в соотношении 2: 1: 3, по объему). Когда смесь приходит в равновесие, разделяют обе фазы. Растворяют 10 r продукта с титром 1750 ед/мг (полученного способом, описанным в примере 4) в смеси, состоящей из

1 л каждой фазы. Эту систему подвергают

459895 противоточному распределению в 6 переходов в 5-литровых колбах, используя при этом тяжелую фазу (растворитель) в качестве подвижной фазы, а легкую фазу (водную) — в качестве стационарной фазы. Каждый раз используют 1 л каждой фазы. Производят раздельный сооп смеси низких (смесь Л) и высших (смесь В) фаз четь.рех первых колб и смесь низших (смесь С) и высших (смесь Д) фаз трех последних колб.

Величину рН смеси В доводят до 7,5 добавлением 300 см lн. едкого патра, à ":àòåì производят постепенное экстрагирование смеси ЧЕТЫРЬМЯ, .Д-ВЫМЯ и ОДНКМ ЛптРОМ ХЛОРОфОРJ ..а. Хчопофорг, овые экстракты и смесь Л cOci диняют и кон<.,ептрируют под понижен bIM давлением до объе:а 700 см . Ко щентрат промыва1от,чв)!ìß поpïèями воды по 50 см до рН 7,5, а про ..ыво гпые маточные растворы

ЭКСтРаГИРУЮт ДВУМЯ ПОРГИЯМИ ХЛОРО< СРМа ПО

100 см .,",îí!:е".-,рат и;.Омывают, а хлороформовые э -<еп = .>,"ав.чеп",ем до по-!у ения объема 70 см, Затем добавляют 700 см гексана, и полученный ос",ïîr< фильтруют, промывают и высушивают под пониженным,чавлением

1 пои -емпеп;.туре 30 С. Пол ; кают 5.,1 г аракI ции F,, в основном содержа:цей первый активный компонент.

Смесь Д постепенно экстпагипуют добавлением 3 л, а зате. я 1,5 л x,÷îðèñòîãî метилена.

Экстракты хлористого метилепа и смесь С соединяют Yi ко 1пентпиру1от пол nOrn æåníûì давлением до 800 см . Концентрат ппомь.вают

400 см воды, а затем снова ко центрируют до получения объема 700 см . После этого добавляют 1 л гсксана, и полученный осадок фичьтруют, промывают и высушива от под пониженным давлением пОи температуре 30 С.

Получают 3,7 r фракции F, в основном содержащей второй активный компонент.

Пример 6 10 г пгодукта. подобного Фракции F, . пnоnсe.л е eрастворения в 200 см системы этилацетат — метанол — 0,067 мол/М/15 (буферный раствор фосфата с рН 5,5 (в соотношении 8:3: 5, ro объему) подвергают противоточному распределению в 110 переносов в аппарат Крейга с 50 ячейками (50 переносов в аппарате с 60 переходов согласно методу единичного извлечения «single withdrawal»), причем операцию начипают в первых двух ячейках. Собирают смесь высших фаз из ячеек с 0 по 37 (3,8 л) и концентрируют ее до получения 300 см . Этот концентрат и смесь низших фаз ячеек с 0 r.о 37 /3,8 л) соединяют и концентрипуют до 800 см . Величину рН доводят до 8 добавлением 180 сма 1 н. едкого натра. Получен ый раствор постепенно экстрагируют добавлением 800, а затем 400 см хлороформа. Хлороформовые экстракты концентрируют до 400 см и nrомывают 400 см подщелоченной воды с рН 8; промывочные маточные растворы экстрагируют 200 см хло роформа. Промытый концентрат и хлороформовые экстракты соединяют, концентрируют

6 до 400 см, промывают 400 см по<щелоченной воды с рН 8, концентрируют до 100 см, к ним добавляют

200 см бутанола и снова концентрируют

5 до 100 см . Величину рН полученного бутанолового раствора доводят до 3,5 добавлением

30 см бутанола, насыщенного lн. соляной кислотой, и раствор выдерживают в течение

12 час при 4 С. Образуются кристаллы, кото10 рые фильтруют, промывают и высушивают.

Получают первые 4,55 г хлоргидрата сырого продукта первого активного компонента. Путем концентрации кристаллизационных маточных растворов до 100 см, добавления 1 л гек15 сага, а затем фильтрации, промывки и просушивания осадка получают вторую порцию

2,5 г хлоргидрата сырого продукта первого активного компонента.

Пример 7 3,75 г хлоргидрата сырого про20 дукта первого активного компонента, полученного способом, описанным в примере 6, растворяют B 40 см диоксана, содержащего 20% воды. Полу енный раствор Фильтруют, а затем и нему,чобавляют сначала в течение двух

25 гасов 15 c;r безво.чпого диоксапа, а затем в течение 30 ми 235 см безводного диоксана.

Получают прочукт в виде кристаллов, который центрифугпруют, промывают и просушиВа.or. Получают 2,75 г хлоргидрата продукта

50 первого а1<тивного компонента — красно-оранжевых кристаллов B виде игл, которые плавятся, Оаспадаясь при 225 — 230 С. Ч итр 151 ед/мг.

0,208 г этого соединен.. растворяют в смеси сос Оящей из 200 с,; 150 см бута-Р

35 но,ча. Затем добавляют 3,4 см 0,1 í. ечкого патра, декантируют и э <страгпруют водную д азу с по.; ощью 50 см бутапола. Бутаноловь1е экствактт1 соединяют, промывают двумя

J порциями по 100 с Р почщелоченной воды с

40 рН 8 И КонцЕПтрнруЮт,чо ОбЬЕМа 10 СМ . ПОз лученный концентрат обрабатывают 50 см геf

45 амопфпого порошка с титром 160 еч/мг.

П р им ер 8. 5 г продукта, подобного фракции F, полученной по способу примера 5, пос.че растворения в 200 см системы этилацетат-метанол- 0,067 мол (M 15) буферный

50,раствор фосфата с рН 5,5 (в соотношении 8:

:3: 5, по объему) подвергают противоточному распределению, аналогично описанному в примере 6. Собирают смесь высших фаз из ячеек с 36 до 89 (5,3 л) и концентоируют ее до по55 лучения 800 см . Концентрат постепенно экстрагируют двумя псрцчями хлористого метилена по 800 см, а затем 800 см хлороформа.

Получепные экстракты собирают. концентрируют до 400 смз. промывают двумя порциями

60 по,00 см воды с рН 7,5 и, наконец, концентрируют до 10 см . Добавлением 100 см гексапа Обпазуется продукт осаждеш<я, который фильтруют, п ромывают и высушивают под пониженным давленис: . Получают 1,1 г антибиотика второго активного компонента в виде красно-оранжевого а морф, о порошка с титром 2650 ед/мг.

Пример 9 500 л сусла культуры,:полученного как указано в примере 2, обрабатывают способом, описанным в примере 3. Получают

8,5 r сырого продукта с титром 395 ед/мг.

17 г сырого продукта, подобно этому, подвергают очистке способом, описанным в примере 4, но хлористый метилен заменяют этилацетатом. Получают 3 г антибиотика с титром 1300 ед/мг.

Пример 10 12,4 г продукта, полученного способом, описанным в примере 9, подвергают противоточному распределению в 50 переходов в системе бутанол- М/3 буферный раствор ф о сф а та с р Н 7,35.

Путем экстрагирования бутанолом низших фаз ячеек с 12 по 35, концентрации бутаноловых экстрактов, промывки и добавления гексана получают первую порцию 1 г хлоргидрата продукта первого активного компонента, а после концентрации маточных растворов— вторую порцию 1,1 r хлоргидрата продукта первого активного компонента. После рекристаллизапии в водном диоксане две эти порции представляют собой красно-оранжевые иголки, плавящиеся, распадаясь при 225—

230 С. Титр 67 ед/мг.

В результате обработки ячеек с 36 по 49 получают 1,1 г сырого продукта второго активного компонента с титром 1800 ед/мг. После противоточного распределения в 50 переходов в системе бутанол — этилацетат — буферный раствор Мак Ильвэна с рН 4 (в соотношении

3: 7: 10, по объему) получают 0,5 г продукта второго активного компонента в виде краснооранжевого аморфного порошка с титром

2000 ед/мг.

Пример 11 625 л сусла, приготовленного способом, описанным в примере 2, помещают в чан с мешалкой. Величину рН доводят до

9 добавлением концентрированного раствора едкого натра, Взбалтывают в течение 30 мин, затем добавляют 32 г вспомогательного материала для фильтрации.

Смесь фильтруют на фильтр-прессе и промывают 275 л воды. В фильтрат, объем которого составляет 780 л, добавляют 156 кг хлористого натрия, а затем с помощью 12 н. соляной кислоты величину рН доводят до 3. Потом фильтрат экстрагируют 260 л бутанола.

Бутаноловый экстракт концентрируют под пониженным давлением при температуре 35 С до

-получения 4 л. Сырой антибиотик осаждают из раствора, осветленного 32 л петролейного эфира, центрифугируют, промывают и высушивают в сушильном шкафу при 30 С под вакуумом. Получают 227 г сырого продукта в виде коричнево-красного порошка с титром

45 ед/мг.

50 г предыдущего сырого продукта растворяют в 200 см бутанола, насыщенного водой, и полученный раствор хроматографируют при рН 4 через колонку, содержащую 500 см окиси алюминия. После фиксации антибиотика начинают проявление и элюирование добавлением 4 л бутанола, насыщенного водой.

Таким образом собирают 3 окрашенных фракции с соответствующими объемами 450, 1500 и

5 1500 см . Первую фракцию концентрируют под пониженным давлением до 50 см, а затем обрабатывают 500 см гексана; получают 8,3 r продукта с титром 68,5 ед/мг. Две последние фракции соответственно концентрируют под

Ip пониженным давлением до 100 см, затем обрабатывают 1 л гексана; получают соответственно 4,4 г продукта с титром 216 ед/мг и

1,35 r продукта с титром 800 ед/мг.

Пример 12 425 л сусла, приготовленного

15 способом, описанным в примере 1 (титр

40 ед/см ), подкисляют до рН 1,8 щавелевой кислотой и фильтруют. Осадок после фильтрования промывают 100 л воды, подкисленной до рН 2 щавелевой кислоты; получают

20 500 л фильтрата. Этот фильтрат последовательно 2 раза экстрагируют до рН 8 добавлением 150, затем 100 л хлороформа. Экстракты соединяют и экстрагируют водой до рН 4; получают соответственно 80 и 50 л. Полученный

25 водный экстракт подщелачивают до рН 8 1н. раствором едкого натра и экстрагируют сначала 40, а затем 20 л хлороформа. Полученные таким образом хлороформовые экстракты подкисляют до рН 4 раствором уксусной кислоты щ в хлороформе (10: 100, по объему). Подкисленный экстракт концентрируют при 30 С под пониженным давлением до 50 см . Затем сырой антибиотик осаждают 500 см гексана, центрифугируют, промывают и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом при 30 С.

Получают 680 мг продукта в виде красного порошка с титром 1080 ед/мг.

Прим ер 13 500 мг антибиотика, полученного способом, описанным в примере 4, растворяют в 100 см 1 н. серной кислоты и полученный раствор в течение 20 мин нагревают на водяной бане. После охлаждения экстрагируют тремя порциями этилацетата по 200 см, экстрагированный органический раствор за45 тем просушивают на безводном сульфате натрия, фильтруют и концентрируют до небольшого объема. После фильтрования, промывки и сушки получают 218,5 мг кристаллов.

150 мг полученных кристаллов растворяют

ы в 3 см хлороформа и 1 5 см бензола. Раствор хроматографируют на бумаге (20 листов бумаги для хроматографии марки «Аршь № 310», пропитанной ацетоновым раствором, содержащим 20% формамида) . Затем проявляют в течение 90 мин с помощью смеси хлороформ-бензол (2: 1), насыщенной формамидом. Основную зону Rf=0,86 вырезают на всех 20 листах бумаги, и полученные

20 зон измельчают в смесителе в приво сутствии метанола. Смесь фильтруют, концентри руют и в нее добавляют 10 объемов воды. Полученный осадок фильтруют, промывают и высушивают под пониженным давлением; получают 120 мг кристаллов, 170 мг

65 кристаллов, идентичных полученным, раство459895 ряют в 15 см диоксана с 20% воды. Затем по капле добавляют воду, подкисленную до рН 4 0,1 н. соляной кислотой, Образовавшиеся кристаллы фильтруют, промывают и высушивают; получают 130 мг агликона продукта в виде красно-о ранжевыx иголок, плавящихся при температуре 160 С, а затем при

225 †2 С.

Пример 14 500 мг антибиотика первого активного компонента, полученного способом, описанным в примере 7, обрабатывают серной кислотой, как это описано в примере 13, и получают 300 мг кристаллов, которые после очистки способом, описанным в том же примере 13, дают 202 мг ггликона продукта первого активного компонента в виде красно-оран/500 /400 /300 1200 1100 /ООО 950 900 850 ВОО 750 70/7 050

2000

У /О

/2 /3 14 /5

Фиг./

1500 /400 /500 200 //00 /000 950 900 850 800 750 700 650!

70 б0

"0

// 12 /3 /4 /5

g /0

Юиг.2!

УО

70 бО

5 0

ЗО

10 жевых иголок, плавящихся при 160 С, а затем при 225 — 230 С. Этот агликон идентичен агликону продукта 9865 R. P.

5 Предмет изобретени я

Способ получения антибиотика, о т л и ч а юшийся тем, что культуру Streptomyces соегцleorubidus 8899 или 31723 выращивают в аэ10 робных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, в течение 2 — 5 дней при температуре 23 — 35 С и начальном рН среды

6,0 — 7,8 с последующим выделением, очист15 кой и разделением целевого продукта извест«)»; ными приемами.

459895

2000 (4 Ц

Ю II Q 3

7 8

Фиг. 3

Типография, пр. Сапунова, 2

/00

70 бО

so о

60О НОО 3300 (200 ИОО 000 У50 900 850 800 750 700 65 0

Составитель Т. Головина

Редактор Т. Караиова Техред Т. Миронова Корректор А. Дзесовз

Заказ 849/11 Изд. № 382 Тираж 529 Подписи"."

ЦНИИПИ Государственного комитета Сонета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Я-35, Раугнская наб., д. 4!5