Способ получения человеческого интерферона

Способ получения человеческого интерферона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

с;,. А н и

О П Е

ЙЗОБРЕТЕНИЯ пп 46 0870

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства

: (22) Заявлено 12.12.72 (21) 1856145/31-16 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 25.02.75. Бюллетень № 7

Дата опубликования описания 09.04.75 (51) М. Кл. А 611< 27. 00

Государственный комитет

Совета Министров СССР

flo делам изобретений и открытий (53) УДК 615.361.018. .46 (088.8) (72) Авторы изобретения

Т. Г. Орлова, В. Д. Соловьев, Л. М. Менткевич, О. Н, Щегловитова и В. П. Кузнецов

Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи

Академии медицинских наук СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к медицине и касается лекарственных препаратов.

Известен способ получения человеческого интерфе рона путем заражения клеток донора вирусом инте рфероногеном, инкубации, выделения и сбора интерферона.

Однако обеспечить производство сырьем— донорской кровью, кото рая широко применя-I ется во всех областях практической медицины, трудно.

Цель изобретения — расширить сырьевую базу и повысить активность целевого продукта.

Для этого в качестве субстрата используют клетки костного мозга, взятого от црупа человека, Пример. Заготовку клеток костного мозга проводят специализированной лабораторией, в которой параллельно заготавливают кровь л другие ткани при всестороннем медицинском контроле в течение пе рвых 5 час после смерти.

После общепринятой обработки операционного поля костный мозг берут стерильно из грудины, подвздошных костей и позвонков путем аспирации в стерильный шприц или методом промывания костей. Полученные клетки смешивают со средой 199 с 20% человеческой плазмы, содержащей 3 ед/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрепто2 мицина. Соотношение объема костного мозга и консервирующей жидкости должно быть в пределах 1: 2 — 1: 5.

Клетки костного мозга, полученные из разных костей одного трупа, объединяют вместе и хранят при 4 С до добавления вируса — интерфе роногена. Время хранения не должно превышать 72 час. 3а это время проводят основные медицинские контроли: определение содержания билли рубина в крови и патологоанатомический диагноз.

При определении уровня билли рубина в пределах нормы и при отсутствии противопоказаний к использованию трупного,костного

15 мозга со стороны судебно-медицинского исследования собранные клетки используют для производства интерферона.

Для получения интерферона по предлагаемому способу клетки костного мозга взвеши20 вают в концент1рации 10 ядросоде ржащих клеток в 1 мл в среде 199, содержащей 5% плазмы (или сыворотки), 100 ед/мл пенициллина, 50 ед/мл стрептомицина, и к ним добавляют вирус — интерфероноген в количестве

25 10 — 100 ТЦДщо на одну ядросодержащую клетку. Взвесь инкуби руют при 37 С 2 час в стационарном горизонтальном положении.

Затем из взвеси клеток выделяют нагруженные вирусом ядросоде ржащие клетки, ко30 торые взвешивают в концентрации 10 клеток

460870

Предмет изобретения

Составитель С. Щенева

Техред Е. Борисова Корректор А. Васильева

Редактор О. Стенина

Заказ 881/12 Изд. Хо 387 Тираж 559 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

3 на 1 мл среды 199, содержащей 5 — 10% плазмы (или сыворотки) и вышеуказанное количество антибиотиков, и инкубируют при 37 С

18 — 20 час. По окончании инкубации клетки отделяют центрифугированием при 1500—

2000 g в течение 15 мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость повторно центрифугируют. К очищенной жидкости добавляют

10 — 20%-ный раствор соляной кислоты до рН

2,2 — 2,4 и выдерживают не менее 4 — 5 суток, при 4 С, после чего отбирают образцы для контроля. стерильности, токсичности и активности. Стерильность контролируют высевом

1 мл раствора на бульон с тиогликоллатом и бульон Сабуро. После 10 суток инкубации бульон с тиогликоллатом при 37 С и бульон

Сабуро п ри 20 С посевы должны оставаться стерильными. Вирусологическую стерильность определяют введением по 0,2 мл жидкости в пробирки с 3-суточной культурой курицыных фибробластов и в аллантоисную полость 10дневных куриных эмбрионов. Через 3 — 4 суток культивирования при 37 С при наблюдении под микроскопом в монослое клеток не должно быть признаков цитопатического действия, а аллантоисная жидкость не должна соде ржать гемагглютининов. Противови русную ак- тивность раствора определяют по задержке цитопатического действия вируса везикулярного стоматита, взятого в дозе 100 ТЦДзе в пе1рвичной культуре клеток кожно-мышечной ткани 10 — 12-недельных эмбрионов человека или в перевиваемой культуре диплоидных клеток человека. Титр противовирусной активности должен составлять не менее 32 ед/мл в культуре фибробластов и не менее 250 ед/мл в культуре диплоидных клеток. Определение токсичности проводят в монослойной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов че4 ловека, причем через 2 — 3 суток инкубации при 37 С не должно быть никаких признаков дегенерации монослоя, а морфология клеток должна оставаться неизменной.

Весь цикл приготовления интерферона и его контроля занимает 14 — 20 дней. 3а это время получают результаты дополнительных исследований крови (реакция Вассермана и две осадочные реакции, посев крови на бактерио10 логическую стерильность). В случае отрицательных реакций полученный интерферон п ропускают через молекулярные разделители (например, Сефадкс à — 25 «грубый»), разливают в стерильные ампулы и замораживают при температуре — 40 . Затем из ампул откачивают воздух и подопревают до 30 — 35 С в течение 48 — 72 час. После высушива ния ампулы запаивают под вакуумом. Остаточная влажность не должна превышать 4%. Готовую про20 дукцию вновь контролируют на безвредность и вирусологическую стерильность, токсичность, а также безвредность путем внутрибрюшинного введения белым мышам весом

10 — 12 г по 05 мл раствора препарата. При

25 наблюдении в течение 5 суток мыши должны оставаться здоровыми. Кроме того, контроли руют физические свойства: растворимость и остаточную влажность препарата.

Способ получения человеческого инте рферона путем заражения клеток вирусом интерфероногеном, инкубации с последующим выде35 лением, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и расширения сырьевой базы для его получения, в качестве субстрата используют клетки костного мозга, взятого от трупа человека.