Патент 461513

Способ получения -галактозидазы

 

о ц -нии

И306Р ЕТЕН И Я

<п1 461ИЗ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 12d 13/10 (22) Заявлено 26.02.68 (21) 1220657/1481537/

/28-13 (32) Приоритет 14.06.67 (31) 37980/67 (33) Япония

Опубликовано 25.02.75. Бюллетень № 7

Дата опубликования описания 31.03.75

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 577.15.07 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Хидео Сузуки, Иосико Озава и Осаму Танабе (Япония) Иностранная фирма

«Эйдженси оф Индастриал Сайенс энд Текнолоджи» (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

Таблица 1

Единицы

1.-галактозидазы

Сырье

0

3426

1776

Карбогидрат

16 Ксилоза

Целлоб иова

Лактоза

Малибиоза

Сахароза

Раффиноза

Растворимый крахмал

Декстран

Изобретение относится к способам получения L-галактозидазы.

Известен способ получения L-галактозидазы путем выращивания плесени Mortierella

Vinacea var. raffinoseutilizer (АТСС 20034) на питательной среде, содержащей индуктор галактозидазы, в присутствии источника углерода, азота и минеральных солей с последующим выделением Ь-галактозидазы из культуральной жидкости.

Предложенный способ позволяет повысить активность L-галактозидазы и снизить количество инвертазы, сопутствующей данному ферменту.

Это достигается тем, что в качестве индуктора используют лактозу.

Пример 1. Споры плесени Mortierella

Vinacea var. raffinoseutilizer инокулируют на среде, содержащей 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0) и следующие ингредиенты, %:

Карбогидрат (см. табл, 1) 0,2

Пептон 0,3

Мясной экстракт 0,3

КС, 0,2

MgSO4 ° 7НзО 0,2

После культивирования в течение 72 час при 30 С мицелий выделяют фильтрованием, тщательно промывают водой и измельчают в ступке с морским песком в пасту.

Измельченный мицелий суспендируют в объеме дистиллированной воды, равном объему культуральной смеси, из которой мицелий был выделен.

Как видно из табл. 1, только галактоза и олигосахариды, такие как раффиноза, малибиоза и лактоза, имеющие галактозидную

461513

Т аблица 2

Единицы

I:галактозидазы

Таблица 3

Сырье

Вес мицелия, исходя из сухого основания мг/100 мл среды

Показатели концентрации водородных ионов

Время культивирования, час

Количество единиц

1:галактозидззы

Пшеничные отруби

Рыбный жмых

9453

276

17381

39616

29984

25880

Соевый жмых

24

48

72

77

6,4

6,3

6,3

6,3

6,5

1,165

1,539

1,789

1,852

I,80I

33010

40 связь, вызывают образование 1 -галактозидазы в мицелии плесени, причем лактоза наиболее эффективна.

П р и м ер 2. 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0), содержащей, /о. 1,5 лактозы, 1 глюкозы, 0,3 мочевины, 0,2 сульфата магния и 0,2 хлористого калия, приготовляют в качестве основной среды, к которой прибавляют вещества, перечисленные в табл. 2, каждое в количестве 3% для приготовления культуральной среды, которую затем инокулируют плесенью и культивируют при 30 С в течение

72 час при встряхивании. Мицелий затем отфильтровывают, тщательно промывают водой и измельчают в ступке с морским песком в пасту. Паста превращается в суспензию при добавлении дистиллированной воды, количество которой равно количеству среды. Суспензию испытывают на ферментативную активность.

Табл. 2 иллюстрирует активность L-галактозидазы в мицелии, взятом из 1 мл проб нескольких сред.

Рисовые отруби

Сурепный жмых

Зерно

Солод

Солодовый жмых

Отходы зерна

Экстракт жидкости после замочки зерна

Пример 3. Приготавливают порции культуральной среды из основной среды (описанной в примере 2) и следующих веществ: рисовых отрубей, отфильтрованного экстракта, приготовленного из рисовых отрубей и горячей воды, продукта реакции между фильтратом, приготовленным по примеру 2, и бактериальной L-амилазой, которая продолжается до того момента, пока йодная реакция смеси не станет отрицательной.

Мицелий плесени, выросший на трех средах аналогично описанному в примере 2, имеет значения L-галактозидазы соответственно

32191, 34495 и 38250 ед.

Пример 4. 1/10 М фосфатной буферной смеси- (рН 6,0), содержащей, %. 1,5 лактозы, 3 рисовых отрубей, 0,3 мочевины, 0,2 сернистого магния и 0,2 хлористого кальция используют в качестве основной среды, к которой добавляют 0,2, 0,5 и 1 /о порошка солодового экстракта для приготовления культуральной

65 среды. Культивирование выполняют аналогично примеру 2, и анализируют активность 1 -галактозидазы в мицелии. Энзиматическая активность 27806 ед, была обнаружена в мицелии, выращенном на основной среде, 29634 ед. — на среде, содержащей 0,2 /ц солодового экстракта, 35577 ед. — на среде, содержащей 0,5% солодового экстракта, и

43349 ед. — на среде, содержащей 1 /о солодового экстракта соответственно.

Пример 5. 100 г лактозы, 100 г глюкозы, 100 г экстракта жидкости от замочки зерна, 100 г сульфата аммония, 30 г КН РО4, 30 r

MgS04 7Н20, 20 г NaCI и 100 г СаСОз растворяют в 8 л воды. Полученный раствор помещают во встряхиваемый ферментатор и после стерилизации при 120 С в течение 30 мин его охлаждают до 30 С. Затем в раствор добавляют стерилизованную воду до общего объема 10 л и в него инокулируют споры плесени, после чего следует культивирование при

30 С с перемешиванием при 200 об/мин и с продуванием воздухом со скоростью 5 л/мин.

Результаты испытаний при культивировании представлены в табл. 3.

Пр имер 6. 1/10 М фосфатный буфер (рН 6,0), содержащий, O : 0,75 лактозы, 2 глюкозы, 1,8 пептона, 1,8 мясного экстракта, 0,2 сернокислого магния и 0,2 хлористого калия инкулируют плесенью, которую культивируют со встряхиванием в течение 72 час.

Мицелий выделяют фильтрацией, тщательно промывают водой и взвешивают. Активность

L-галактозидазы 3500 ед. на 1 мл фильтрата, свободного от мицелия, и 28400 ед. в мицелии, собранном с 1 мл среды.

Серную кислоту добавляют к 10 r свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы, для доведения ее рН приблизительно до

5,2 с последующим добавлением фосфатного буфера (рН 5,2) и доведением водой полученного в результате раствора до 20 по Бриксу.

Мицелий затем добавляют к приготовленному разбавленному раствору свекольной мелассы, ведут энзиматическую реакцию при

50 С в течение 24 час при перемешивании.

Реакционную смесь фильтруют, и оставшуюся рафинозу и возросшее количество саха461513 розы определяют в фильтрате хроматографией на бумаге.

При добавлении мицелия с энзиматической активностью 450000 ед. расцепляется

70,4а/е исходной раффинозы и образуется

364 мг сахарозы. Соответствующие значения после добавления 900000 ед. энзиматической активности 81,5 /а и 544 мг, Пример 7. Плесень культивируют в условиях, аналогичных примеру 6, и определенное количество полученного таким образом мицелия используют в качестве источника энзима.

Серную кислоту и фосфатный буфер (рН 5,2) добавляют к 10 г свекольной мелассы и разбавляют смесь водой до концентрации 36 по Бриксу. Разбавленный раствор свекольной мел ассы перемешивают с

1700000 ед. энзима при 37 С в течение 24 час.

Затем реакционную смесь фильтруют и определяют расщепление раффинозы и образование сахарозы. Отфильтрованный мицелий тщательно промывают водой и вновь используют на последующей порции по способу разбавленного раствора и повторяют эту процедуру еще раз.

Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Увеличение РасКеплеколичества ние сахарозы, раффинозы, мг о

Остаточная

L-галактозидазная активность, М опыта

372

426

390

98

84

67,3

72,7

67,3

Пример 8. Плесень культивируют в среде, аналогичной описанной в примере 6. Выросший мицелий гомогенизируется в гомогенизаторе и подвергается воздействию УЗ-генератора (10 кг цикл) в течение 1 час. Измельченный мицелий центрифугируют для того, чтобы отделить часть, всплывающую наверх, от осадочной фракции и для каждой фракции определяют активность 1 -галактозидазы.

Энзиматическая активность равна 39а/а в поверхностной части и 61 /о в осевшей фракции.

Раффинозу из свекольной сахарной мелассы расщепляют посредством 1750000 ед.. на осадочной фракции в трех последовательных .опытах (как в примере 7).

Результаты представлены в табл. 5.

Раффинозу также расщепляют при помощи концентрирования верхней всплывшей части в вакууме. Добавляют 1750000 ед. L-талактозидазы в виде концентрата к 10 г свекольной мелассы, содержащей 1,088 r раффинозы. Доводят рН полученной в результате смеси до

5,2 и разбавляют ее водой и серной кислотой до 36 по Бриксу, оставляя на 24час при37 С..

Таблица 5

Остаточная

I -галактозидазная активность,,, Ра сщепление рафф ивовы, о

Увеличение количества сахарозы, мг М опыта

67,3

65,4

50,9

262

244

244

61

44

10

Степень расщепления раффинозы 65,3 /о возросшее количество сахара 260 мг.

15 П р имер 9. Среду, содержащую, /а. .1,5 лактозы, 0,5 глюкозы, 1 жидкости после замочки зерна, 0,1 мочевины, 0,1 сернокислого аммония, 0,3 КН РО4, 0,2 MgSO4 7НяО и 0,2

NaC1, инокулируют спорами плесени и куль20 тивируют при 30 С в течение 72 час. После сбора мицелия с 1 мл среды определяют, что он содержит 28000 ед. L-галактозидазы.

10 г навески свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы, разбавляют водой до

25 концентрации 15 по Бриксу, рН доводят до

5,2 добавлением серной кислоты и смешивают с мицелием, имеющим 980000 ед. Ь-галактозидазной активности. Смеси хранят при 20, 30, 40, 50, 60 и 70 С соответственно в течение

30 24 час при встряхивании, после чего измеряют расщеплением раффинозы.

Температура реакции, -С

Разложение раффинозы, бо

42,1

78,2

80,1

83,5

78,0

53,9

40

Расщепление раффинозы, о, рН реакционной жидкости

2,2

4

6

11,0

6I,2

80,5

80,7

51,9

38,1

12,0

65

45 10 r навески такой же свекольной мелассы также растворяют буферным раствором

M,1l vaine до 15 по Бриксу, их рН доводят до 2,2, 3,4, 5,6, 7 и 8 соответственно, после чего добавлялись 980000 ед. мицелия, и полученный в результате раствор встряхивают при

50 С в течение 6 час.

461513

Остаточная

L-галактозидазиая активность мицелия,,г, Расщепление раффииозы, о № опыта

2

77,3

74,6

65,3

79,4

66,6

58,3

Ео

7

Пример 10. 10 г навески свекольной мелассы разбавляют водой до 15 по Бриксу, доводят до рН 5,2 серной кислоты и смешивают с 980000 ед. мицелия, аналогично описанному в примере 9.

Смесь встряхивают при 50 С в течение

6 час.

Извлеченный мицелий тщательно промывают водой, добавляют к другой порции разбавленной свекольной мелассы и повторяют процедуру.

Результаты, полученные в трех опытах, представлены в табл. 6.

Таблица 6

Аналогичные результаты получают в тех случаях, когда разбавленную мелассу заменяют свекольным соком, экстрагированным из свеклы или после очистки.

Активность L-галактозидазы измеряют следующим образом.

Ферм ентативную реакцию осуществляют при 40 С в течение 2 час путем добавления

1 мл суспензии к смеси 0,5 мл (0,06 моля) мелибиозы и 0,5 мл (0,1 моля) фосфатной буферной смеси (рН 5,2). После завершения реакции реакционную смесь выдерживают в кипящей воде в течение 5 мин для инактивации

L-галактозидазы и к ней добавляют 1 мл

1,8%-ного Ва(ОН) ВН О и 1 мл 2%-ного

zno4 47H„o, После центрифугирования смеси при помощи глюкостат-метода измеряют количество глюкозы в поверхностном слое. Активность

L-галактозидазы, которая выделяет 1 мг глюкозы в этих реакционных условиях, определяют как одну единицу, Поскольку количество освобожденной глюкозы и концентрация энзима находятся в прямой зависимости до количества 1000 мг глюкозы, раствор фермента разбавляют для того, чтобы количество энзима стало внутри указанной выше зависимости, затем проводят ферментативную реакцию и количество освобожденной глюкозы умножают путем многократного разбавления.

Характеристики Mortierella vinacea var

raffinoseutilizer (АТСС, № 20034) следующие.

1. Микроскопическое наблюдение плодового тела, выросшего на среде агара солодового экстракта, показывает разветвленные спорангионосцы, имеющие в диаметре 3 — 4 мкм, спорангии бледно-коричневые, имеют почти круглую форму в диаметре 10 — 20 мкм и неправильно угловатые спорангиспоры — 2,7 — 5 мкм.

2. Микроскопическое наблюдение в различных средах.

Агар солодового экстракта. Мицелий имеег толстый войлокообразный вид и изменяется в краске от белого до бледно-коричневого в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимого пигмента.

Картофельно-глюкозный агар.

В мицелии наблюдается изменение окраски от белой до светло-коричневой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимый пигмент.

Дрожжевой экстракт-агар солодового экстракта.

Мицелий обнаруживает изменение окраски от белой до бежевой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимый пигмент. Наиболее подходящей температурой культивирования плесени в среде является температура около 30 С. Продуцирование L-галактозидазы быстро возрастает, спустя около 30 час и становится наиболее высоким примерно через 70 — 80 час.

Так как большая часть L-галактозидазы получается в мицелии, она может повторно использоваться добавлением к свекловичной мелассе, подвергается реакции с рафинозой, регенерируется и снова добавляется к другой свекловичной мелассе.

Около 80o/о L ràëàêòoçèäàçû, продуцируемой в среде, содержащей сою, становится неактивной, когда она поддерживается при температуре 60 С в течение 15 мин. Только около

38 /о L-галактозидазы, продуцируемой по предложенному способу, становится неактивной, когда она сохраняется при температуре

60 С в течение 15 мин. Так как ферментативная реакция может осуществляться при высокой температуре, соответственно можно сократить время реакции.

Инвертазная активность L-галактозидазы, черезвычайно низка по сравнению с активностью L-галактозидазы, получаемой в среде, содержащей сою. В 1 мл ферментативного раствора, полученного из среды, содержащей сою, включающего, например, 50000 ед. 1-галактозидазы, получается 18,1 ед. инвертазы, тогда как в 1 мл энзимного раствора, полученного по предложенному способу, включающего 50000 ед. 1 -галактозидазы, получается только 0,085 ед. инвертазы, т. е. активность инвертазы снижается, примерно до 1/200.

Причина этого заключается в том, что когда плесень культивируется в среде, содержащей или coro, или соевый жмых, получение инвертазы вызывается сахарозой, содержащейся в сое. Так как рафиноза при добавлении 1-галактозидазы к отбросной мелассе разлагается на сахарозу и галактозу, можно увеличивать выход свекловичного сахара.

Предмет изобретения

Способ получения L-галактозидазы путем выращивания плесени Mortierella Vinacea var.

461513

Составитель Г. Субботина

Редактор Е. Кравцова Техред О. Гуменюк Корректор 3. Тарасова

Заказ 727/16 Изд. Мз 384 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

raffinoseuti1izer (АТСС 20034) на питательной среде, содержащей индуктор галактозадазы, в присутствии источника углерода, азота и минеральных солей с последующим выделением L-галактозидазы из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности 1 -галактозидазы и снижения количества инвертазы, сопутствующей данному ферменту, в качестве индуктора ис5 пользуют лактозу.