Способ получения 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты

Способ получения 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАЙ И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ пц 463702

Ьюз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт, свидетельства (22) Заявлено 25.04.73 (21) 1936310/28 13 (51) М. Кл. С 124 13 00 с присоединением заявки №

ГосудвРственный комитет (32) Пр нори гет

Совета Министров СССР ло делам изобретений Опубликовано 15.03.75. Бюллетень № 10 (53) УДК 663.14.038.9 (О 8 8.8) и открытий

Дата опубликования описания 26.09.75 (72) Авторы изобретения Г, К. Скрябин, И. И. Старовойтов, С. Ю. Пширков, М. Ю. Нефедова, Г. И. Яковлев и В,. М. Аданин (71) Заявитель Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6ОКСИМЕТИЛ-2-НАФТОЙНОЙ

КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению

6-оксиметил-2-нафтойной кислоты с помощью микроорганизмов.

Известен способ получения 6-оксиметил-2нафтойной кислоты путем окисления 2,6-диметилнафталина.

В известном способе 6-оксиметил-2-нафтойную кислоту получают химическим путем прямым окислением кислородом 2,6-диметилнафталина при 200 С под избыточным давлением в титановом реакторе в присутствии таких катализаторов, как окись азота и селен.

Недостатками этого способа являются жесткие условия процесса (высокая температура, давление), использование дорогостоящих материалов для аппаратуры (титановый реактор) и низкий выход 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты.

С целью упрощения процесса и повышения выхода продукта по предлагаемому способу проводят окисление 2,6-диметилнафталина с помощью микроорганизмов из рода Pseudomonas, выращенных на минерально-солевой среде, содержащей источники углерода в виде ароматических соединений.

Из рода Pseudomonas используют вид putida штамм 7.

Окисление 2,6-диметилнафталина до 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты протекает одностадийно как в опытах с растущими культурами бактерий, так и при использовании отмытых (покоящихся) клеток микроорганизмов, предварительно выращенных на мине5 ральных средах, содержащих источники углерода, азота и микроэлементы.

В качестве источников углерода, необходимых для роста бактерий, используют соединения ароматического характера — нафталин

10 или соли салициловой кислоты.

При замене этих источников углерода на другие, в частности на углеводы, нормальные парафины, жирные кислоты окисление 2,6-диметилнафталина до 6-оксиметил-2-нафтойной

15 кислоты бактериями Pseudomonas putida штамм 7 не наблюдается.

Характеристика бактерий Pseudomonas putida штамм 7.

Штамм выделен из почвенных образцов, взятых на территории Енакиевского коксохимического завода.

Культуральные признаки: колонии на твердых питательных средах гладкие, плоские, блестящие, бесцветные или серовато-бе25 лые. На стандартной среде, предложенной

Кингом и др. образует флуоресцирующий пигмент.

На мясо-пептонном бульоне растет сплошной пленкой, продуцируя при этом зеленый

30 флуоресцирующий пигмент.

463702

Морфология культуры: клетки палочковидные с округленными концами (1,5—

3,0;х,0,6 м), подвижные (с двумя, тремя жгутиками), грамотрицательные.

Э к о л о г и ч е с к и е п р и з н а к и: растет при 4 — 37 С, не растет при 41 С. Оптимальная температура роста 28 С.

Физиологические признаки: растет на обычных питательных средах органических и минеральных, ассимилирует углеводы за исключением ксилозы. На минеральных средах растет предпочтительнее с нитратной формой азота, чем с аммиачной. Желатину не разжижает, молоко не изменяет, нитраты восстанавливает, крахмал не гидролизует, инозит не усваивает.

Биологические признаки: окисляет нафталин до салициловой кислоты. Салицилат окисляет полностью.

Пример 1. Культуру Pseudomonas putida штамм 7 поддерживают на косяках с мясопептонным агаром (МПА). Инокулят готовят путем разведения в стерильной водопроводной воде культуры, выросшей на косяках с

МПА. Плотность суспензии клеток, используемой в качестве инокулята, составляет 2,0 единицы по шкале оптической плотности нефелометра. 5 мл такого инокулята используют в качестве посевного материала на один матрац. Культуру выращивают в медицинских матрацах в течение 40 ч при 29 — 30 С на минеральной среде следующего состава, :

КзНРО4 1,0

КНзРО4 0,1

ИН4ИОз 0,2

Мдзо,.7Н О 0,005

FeSO4. 7НзО 0,001

CaClз 6НзО 0,001

CuSO4 5НзО 0,0002

НзВОз 0,00006

ZnSO4 НзО 0,002

МпЬО Н О 0,00003

NaçÌî04. 2НзО 0,003

NiClз 6НзО 0,0005

Нафталин 1,0

Агар 2,0

Дистиллированная вода до 100.

Среду разливают в медицинские матрацы по 250 мл в каждый и после стерилизации в течение 30 мин при 1 ати проводят «заквашивание» среды в матрацах.

После 40 ч роста культуру смывают с агаризованной среды фосфатным буфером рН

8,5 — 8,8. Бактериальную суспензию фильтруют через стеклянный фильтр Мо 1 для отделения частиц нафталина и центрифугируют 10 мин при 8 — 10000 об/мин, дважды промывают фосфатным буфером рН 8,5 — 8,8 и ресуспепдируют в том же буфере.

100 мл бактериальной суспензии с оптической плотностью 2,2 единицы вносят в медицинские колбы на 750 мл и одновременно до5

45 бавляют по 100 мг (0,64 моля) 2,6-диметилнафталина в каждую.

Реакцию трансформации проводят при 29—

30 С в колбах на качалке. Через 60 ч опыт заканчивают.

Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 8 — 10 000 об/мин. Надосадочную жидкость упаривают на роторном испарителе при 40 С, концентрируя первоначальный объем в 4 — 5 раз. Сконцентрированную надосадочную жидкость охлаждают до +5—

6 С, и к охлажденному раствору приливают четырех-пятикратный объем этилового спирта, охлажденного до 0 С, для осаждения белков. Осадок белков отделяют фильтрованием через стеклянный фильтр М 1. Фильтрат подкисляют 10О/о НСl до рН 3,0 и упаривают досуха на роторном испарителе при 40 С. Сухой остаток экстрагируют абсолютным этанолом и проводят препаративное выделение конечного продукта трансформации путем тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» UV-254 размером 15х,15 см в системе бензол — метанол — ледяная уксусная кислота (45: 4: 2).

В качестве элюирующего агента применяют абсолютный этанол.

Элюат упаривают досуха на роторном испарителе и высушивают под вакуумом. Концентрацию конечного продукта определяют спектрофотометрически с использованием стандартных кривых. Выход продукта составляет 0,3 моля (46 /о).

Пример 2. Культуру Ps. putida штамм 7 поддерживают на косяках с МПА. Инокулят готовят как в примере 1.

Культуру выращивают в течение 72 ч при

29 — 30 С на минеральной среде того же состава, что приведен в примере 1, но в качестве источника углерода добавляют 2 /, салицилата натрия или калия. Далее процесс трансформации 2,6-диметилнафталина и выделение конечного продукта проводят как в примере 1. Выход 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты составляет 0,29 моля (45 /о).

Предмет изобретения

1. Способ получения 6-оксиметил-2-нафтойной кислоты путем окисления 2,6-диметилнафталина, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода продукта, окисление проводят при помощи микроорганизмов из рода Pseudomonas, выращенных на минерально-солевой среде, содержащей источники углерода в виде ароматических соединений, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из рода Pseudomonas используют вид ðutida.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из вида Pseudomonas putida используют штамм 7.