Способ плучения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты

Способ плучения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ пц 469266

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимьш от патента (22) Заявлено 14.03.72 (21) 1759089 28-13 (51) М. Кл. С 12d 13/06 (32) Приоритет 31.05.71 (31) 38143 (33) Япония

Опубликовано 30.04.75. Бюллетень ¹ 16

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 663.18(088.8) Дата опубликования описания 19.11.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дзиносуке Абе, Тецуо Ватанабе, Цумому Ямагути, Куние Мацумото и Тадасиро Фудзи (Япония) Иностранная фирма

«Тойо Езо Компани Лтд.» (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-АМИНО-ДЕЗАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРАНОВОЙ КИСЛОТЫ

5 0Н

C00b.

К вЂ” CO — КН

C00N

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способу получения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты с помощью энзимного препарата, полученного из Bacillus megaterium.

Известен способ получения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДСА) общей формулы

Предлагаемый способ получения кислоты ферментативным путем заключается в том, что на соль общей формулы где R — бензильная или феноксиметильная группа, М вЂ” щелочной металл, воздействуют культуральной жидкостью, полученной при выращивании штамма Bacillus megaterium В-400 FERM ¹ 748, являющегося продуцентом энзпма ацеламид амидогидролазы.

Штамм В-400 принадлежит к виду Bacillus

5 megaterium, выделен из почвы и продуцирует энзим, способньш разлагать амидную связь 3метил-7-феноксилацетамид — Л - цефам-4-карбоновой кислоты и 3-метил-7-фенпл-ацетамидЛ -цефам-4-карбоновой кислоты.

1. Морфологические характеристики (косая культура на бульоновом агаре при 30 С в течение 18 — 24 час): клетки стержневидные, главным образом, длин ными цепями с круг15 лыми концами, размер 1,2 — 1,5Х2,0 — 3,5 мк, кожицы нет, подвижные с ресничками (по периферии), грамположительные.

На соевом arape (при 30 С 5 суток) споры овальные размером 1,0 — 1,2Х1,5 — 2,0 мк. По20 ложение — центральное до парацентрального.

Спорангия не точно набухающая.

П. Поведение в различных культурных средах.

Пластинки на агаровом бульоне (30 С, 25 24 час) . Хороший рост, круглая культура с выгибами, малораспространенная, белая до светло-желтой, блестящая, мягкая, влажная, просвечивающаяся; нет изменения окраски среды.

469266

Таблица 1

Образование газа

Образование кислоты

Углевод

Арабиноза

Ксилоза

Глюкоза

Маннов а

Фруктоза

Галактоза

Рибоза

Рамноза

Мальтоза

Сахароза

Лактоза

Трегалоза

Рафиноза

Целлобиоза

Сорбитол

Маннитол

Инозитол

Глицерин

Глюцитол

Салицин

Инсулин

Крахмал

К вЂ” СΠ— МН

0= М .-- CH

С005

65

Косая среда на агаровом бульоне (30 С, 24 час). Хороший рост культуры, гладкая поверхность, малораспространенная, блестящая, влажная. Колонии бело-молочные, просвечивающиеся; цвет среды не меняется.

Бульон (30 С, 2 суток). Хороший рост культуры, равномерная мутность с осадком, кожицы нет.

Палочки из желатинового бульона (30 С, 20 суток). Поверхностная культура к центру по линиям палочек. Нет разжижения желатина.

Лакмусовое молоко (30 С, 20 суток). Не пептонизировано; лакмусовый пигмент восстановлен; культуральная жидкость становится желто-коричневой.

Соевая агаро вая косая культура (30 С, 24 час). Культура белого до желтовато-белого цвета, поверхность гладкая и мягкая. Хорошее образование спор, Глюкозо-нитратная агаровая косая культура (30 С, 3 суток). Скудная.

Косая культура на тирозиновом агаре (30 С, 3 суток). Хорошая, среда коричневая.

Картофель (30 С, 5 суток). Хорошая культура, колонии розовые до коричневых, поверхность ровная и влажная, изогнутая и блестящая; среда становится коричневой приблизительно на 3-й день.

III.Ôèçèîëîãè÷åñêèå свойства.

Оптимальные условия роста: аэробные при рН 7,0 — 8,0 и 28 — 35 С. Условия размножечия: аэробные, рН 5 — 10, при 7 — 45 С. Кислотостойкость низкая, при рН ниже 5,0 роста иет.

Отношение к кислороду: аэробная, нет роста в глюкозном бульоне при анаэробных условиях. Индол не продуцируется. Образуется сероводород. Реакция денитрификации: газы не образуются. Нитраты восстанавливаются.

Образование катал азы — положительное, уреазы — положительное. Крахмал гидролизуется. Цитраты утилизируются (в среде Козера и Христинсона). Лакмусовый пигмент восстанавливается. Метиленовый синий восстанавливается. В картофельной среде образуется водорастворимый пигмент.

IV. Ферментируемость углеводов (см. табл. 1).

Предлагаемую 7-амино - дезацетоксицефалоспорановую кислоту (7-АДСА) можно изменить путем сорбции деацилирующего энзима Се (I) на носителе, не инактивирующем этот энзим.

Для этого добавляют водный распвор Ce(I) к этому носителю для деацилирования Ce(l) и из реакционной жидкости выделяют

7-АДСА, Штаммом, продуцирующим энзим, который способен деацилировать Ce(I), является Bacillus megaterium E-400 FERM-P № 743.

Энзим, способный разлагать амидную связь

Ce(I), согласно изобретению получают аэробным выращиванием Bacillus megaterium

В-400 FERM № 748 при 25 — 37 С в течение

12 — 60 час в среде, обычно применяемой для выращивания бактерий, т. е. в питательной среде, содержащей соответствующие количества источников азота (например: пептон, мясной экстракт, кукурузная барда, экстракты дрожжей, сухие дрожжи, соевые продукты разложения протеина или соевые выщелоченные продукты), источников углерода (например: меласса, глюкоза или глицерин); неорганические соли и, в некоторых случаях, другие ускоряющие рост вещества. Обычно используют аэрационное перемешива|ние жид кой культуры.

Вышеуказанный энзим, представляющий собой обычно оксо-энзим, в энзимной реакции применяется в виде фильтрата культуры или в виде энзимного препарата, полученного из фильтрата культуры. Этот препарат получают путем очистки энзима известным методом, например, концентрированием фильтрата культуры или осаждением энзима полунасыщением или насыщением растворимой солью, на пример сульфатом аммония или хлористым натрием, или осаждением с помощью добавления гидрофильного органического растворителя, например метанола, этанола или ацетона. Осадок растворяют в воде и полученный раствор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану, при этом можно удалять низкомолекулярные примеси. Исходя из разницы в сорбции на сорбенте или в средстве с фильтрующим гелем, можно также удалять низ комолекуля р|ные примеси, окра

469266

15 ю в форму водорастворимой натриевой или калиевой соли и применяют в концентрации от

0,1 до 20 мг/мл, лучше от 2 до 5 мг/мл, рН реакционной жидкости поддерживают в интервале 7 — 8 при температуре 30 — 45 С, предпочтительно от 35 до 40 С, в течение 5—

30 час, Реакцию можно остановить на любой стадии, устанавливая время, при котором выход 7-АДСА становится максимальным.

Тип носителя меняют в зависимости от ти- щ па используемого продуцирующего энз им штамма для деацилирования Ce (I) . Однако при выборе носителя учитывают его способность сорбировать деацилирующий энзим без шенные вещества, протеины и т. п. из культуральной жидкости при использовании обычных способов, например, сорбционной или ионообменной хроматографии, или фильтрующим гелем.

Энзимный раствор можно подвергнуть выпариванию при пониженном давлении, вымораживанию и т. и. обработке с получением стандартного энзимного продукта в виде тзердого вещества, или его можно использовать как таковой для обработки Ce(I).

Если требуется дальнейшая очистка энзимного препарата, то можно применить обычные способы очистки протеинов и энзимов, в которых применяются сорбенты, фильтрующие гелипт. и.

Энзимную реакцию ведут следующим обра зом: Се(1) растворяют в воде или буферном растворе, а затем обрабатывают вышеуказанным энзимным препаратом. Се (1) переводят его инактивации. Например, если применяют такие неорганические носители, как целит, белую землю, активную глину, каолин, активированный уголь или оиликагель, такие ионообменные смолы как СМ-целлюлоза, СМцефадекс С-25, или Асберлит С-50, Довекс-50, то деацилирующий энзим для Ce(I), продуцирующийся Bacillus megaterium В-400, хорошо сорбируется без инактивации. Но если применяют в качестве носителя двуокись алюминия, порошок целлюлозы, ДЕАЕ-целлюлозу, ДЕАЕ-цефадекс-25 или анионообменную смолу, то деацилирующий энзим плохо сорбируется, а в случае сорбции сильно инактивируется.

При сорбции деацилирующего Ce(I) анзима на носителе рН фильтрата культуры штамма, продуцирующего деацилирующий

Ce(I) энзим, доводят до постоянного рН для деацилирующего энзима. Например, при сорбции деацилирующего энзима, продуцируемого Bacillus megaterium на целите, рН фильтрата культуры составляет, как правило, 6 — 8. Сорбцию деацилирующего энзима на носителе проводят периодическим способом или по способу с колонкой.

Количество носителя зависит от количества и титра энзима фильтрата культуры продуцирукнцего деацилирующий энзим штамма и степени сорбцип деацилирующего энзима носителем. При сорбции энзима перио4О

65 дическим способом количество используемого носителя должно составлять от 5 до

15 вес. /ц от количества фильтрата культуры. При периодической работе смесь фильтрата культуры и носителя перемешивают, затем носитель отделяют и промывают водой, а в случае сорбции с помощью колонки носитель, набитый в колонку, смачивают водой или буферным раствором, в котором рН доведен до стабильного значения; фильтрат культуры пропускают через колонку, затем колонку промывают водой, и получают носитель, который сорбирует деацилирующий энзим.

Ce(I) получают известными методами. В предлагаемом способе Ce(I) используют в виде водорастворимой соли щелочного металла, например натриевой или калиевой.

Далее водный раствор Се(1) обрабатывают деацилирующпм эпзимом. сорбированным на носителе. Предварительно добавляют к раствору буферный раствор с таким же рН, как и соответствующий рН деацилирующего энзима. Эту энзимную реакцию ведут непрерывно на колонке.

Концентрация Ce(I) зависит от титра энзима, т. е. от способности его деацилировать

Се (I), и от расхода; однако желательно, чтобы количество непрооеагировавшей Се (I) в выходящей реакционной жидкости не увеличивалось. Обычно концентрация Се (1) составляет 0,1 — 2,0 / по весу, лучше от 0,5 до

1,0 / по весу. Концентрация зависит также от типа носителя.

Вышеуказанную реакцию проводят при соответствующих рН и температуре, лучше при оптимальных рН и температуре для деацилирующего Ce(I) энзима. Однако подбирают такие условия реакции, чтобы образ ющаяся в реакционной жидкости 7-АДСА выходила в возможно большей концентрации. Длительность реакции регулируют путем увеличения или уменьшения добавляемого количества водного раствора Ce(l). Обычно реакция заканчивается до того, как водный раствор Ce(I) проходит через слой носителя в колонке. Однако в том случае, когда степень деацилирования Ce(I) низка и в реакционной жидкости остается большое количество Ce(I), реакционную жидкость снова добавляют в этот слой носителя или в другой, сорбировавший деацилирующий энзим, при этом получают реакционную жидкость с большой степенью деацилирования Ce(I).

При проведении энзимной реакции водный раствор Ce(I) добавляют непрерывно в слой носителя, на котором сорбирован деацилирующий энзим. Однако степень деацилирования

Се (I) постепенно уменьшается за счет миграции различных бактерий и т. п. Вредное воздействие из-за загрязнения сводится к минимуму, если в верх колонки добавлять толуол.

Согласно изобретеншо один слой носителя можно использовать более 10 дней, при этом

469266

7-АДСА выделяется с ббльшими выходами при малых затратах.

Выделение 7-АДСА из полученной таким образом реакционной жидкости осуществляют известными способами. Например, рН реакци- 5 онной жидкости доводят до 2 и промывают ее гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом, бутилацетатом или метилиизобутилкетоном, для удаления непрореагировавшей Ce(I), затем водный слой кон- 10 центрируют и доводят его рН до 3,7 при охлаждении для осаждения 7-АДСА изоэлектрически, Можно также довести рН реакционной жидкости до -3,7, концентрировать ее и охладить, выпавший осадок промыть ацетоном 15 для удаления непрореагировавшей Се (I) и побочно полученной карбоновой кислоты. Таким образом можно выделить 7-АДСА.

Метод измерения активности сорбированного энзима. 20

Носитель с сорбированным деацилирующим энзимом взвешивают в 1-образной пробирке.

В пробирку добавляют 4,5 мл 0,1 М фосфатного буфер ного раствора (рН 7 5), и пробирку встряхивают 10 мин (на трясучке Мо- 25 нод термостатного типа) при 37 С. Затем добавляют 0,5 мл (10 мг/мл в единицах свободной кислоты) водного раствора натриевой соли 7-фенилацетамиддезацетоксицефалоспорановой кислоты, и полученной смеси дают реагировать в течение 30 мин. По окончании реакции реакционную жидкость сразу же охлаждают и в реакционной маточной жидкости, освобожденной от носителя, определяют 7АДСА по методу TNBS. Энзимный титр, обра- З5 зующий 100 у/мл 7-АДСА, принимают за

100 единиц (и) .

Методы определения 7-АДСА.

I. Реакционную жидкость подвергают испытанию на микроорганизмы (37 С, 16 час) по 40 методу бумажных дисков или чашечному методу с использованием Bacillus subtilis

PCI-219 в качестве испытуемого штамма, измеряют диаметр кружка ингибирующего рост этого штамма. По стандартной кривой для 45

Ce(I) рассчитывают количество Ce(I); разницу между исходным количеством Ce(I) и оставшейся Ce(I) выражают в процента.: к исходной Ce(I). Этот процент представляет собой степень разложения исходной Ce(I). 50

II. В определенном количестве реакционной жидкости доводят рН до 2,5 с помощью 1 н. соляной кислоты, промывают 3 раза половинным количеством бутилацетата, затем рН доводят до 7,5 с помощью 1 н. водного раствора 55 едкого натра. Затем определенное количество обработанной таким образом реакционной жидкости обрабатывают хлорангидридом кислоты, соответствующей кислоте в боковой цепи исходной Се(1), а затем подвергают тако- 60 му же испытанию микроорганизмами, как и в определении по методу 1. Из количества полученной Се (I) рассчитывают количество

7-АДСА и выражают его в процентах; этот процент представляет собой выход 7-АДСА. 65

III. Метод TNBS. К 1 мл пробы добавляют

2 мл 0,3 М раствора фосфатного буфера (рН

8,0) и 2 мл 0,1%-ного раствора TNBS; полученной смеси дают реагировать в темноте при

50 С в течение 90 мин. После охлаждения в реакционную жидкость добавляют мл 6 н. соляной кислоты и определяют поглощение при 395 ммк; количество 7-АДСА рассчитывают по стандартной кривой для 7-АДСА.

Пример 1. Получение энзимных препаратов.

20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (о/о ): полипептон 1, дрожжевой экстракт 1 и хлористый натрий 0,5,— загружают в чашечпый ферментатор на 30 л и стерилизуют 20 мин паром при 120 С. Затем в стерильных условиях переносят в эту культуральную среду 200 мл затравочной культуры

Bacillus megaterium В-400 FERM-P М 45, которую выращивают 24 час при 30 С в культуральной среде вышеуказанного состава и ферментируют при 30 С в течение 48 час с аэрацией и перемешиванием при расходе воздуха

20 л/мин и 300 об/мин мешалки. По окончании ферментации клетки удаляют с помощью центрифуги-сепаратора Вестфалия и получают 17,4 л фильтрата культуры.

Пример 2. Фильтрат культуры из примера 1 выпаривают до 1/3 объема при наружной температуре 30 — 35 С, и в концентрат добавляют сульфат аммония до достижения 80% насыщения. Выпавший осадок растворяют в дистиллированной воде и обессоливают с помощью колонки с Цефадексом С-25; обессоленный раствор замораживают и получают 24,3г стандартного энзимного продукта.

Пример 3. 20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (/о): глюкозы

0,5, глицерина 0,3, мясного экстракта 1,0 и полипептона 1,0, — загружают в чашечный фермептатор на 80 л и стерилизуют 20 мин паром при 120 С. Затем в стерильных условиях в ферментатор вносят 200 мл затравочной жидкости Bacillus megaterium B-400 РЕЯМ-P № 748, которую выращивают при 30 С в течение 20 час в культуральной среде вышеуказанного состава и фер ментируют при 30 С в течение 72 час при аэрации и перемешивании, при расходе 20 л/мин воздуха и 300 об/мин мешалки. По окончании ферментации клетки удаляют с помощью центрифуги Вестфалия, фильтрат выпаривают до 1/3 объема при наружной температуре 30 — 35 С. К концентрату добавляют ацетон до его содержания 60О/О, выпавший осадок выделяют фильтрованием и сушат. получают 25,5 г стандартного энзимного продукта.

П р и мер 4. 4 г сырого энзима, полученного по примеру 2, растворяют в 500 мл воды, рН полученного раствора доводят до 7,5 с помощью водного 1 и. раствора едкого натра. К этому раствору добавляют 2 г натрия 3-метил7-феноксиацетамид-Л -цефам-4 - карбоксилата и полученную смесь выдерживают при 37 С в течение 15 час. Затем реакционную смесь ос469266

10

Таблица 2

Относительная степень сорбиии,, Носитель

100,0

100,0

100,0

81,2

Целит

Лктпвпрованный уголь

СМ-целлюлоза

Амберлнт CG-50

20 вобождают от протеинов с помощью Диафильтра G-10H, рН доводят до 2,5 с помощью

l н. соляной кислоты, 3 раза промывают половинным количеством бутилацетата и затем доводят рН до 6,5 с помощью l н. раствора едкого натра. Эту. жидкость сорбируют в колонке 2+15 см с набивкой из Довекс-18 (кислотного типа) и элюируют 1 н. уксуснои кислотой. Затем измеряют поглощаемость каждой фракции при 260 ммк биологической пробой после распыления на нее феноксиацетилхлорида на фильтровальной бумаге; фракции, содержащие 7-амино3-метил-Л -цефам - 4 — карбоновую кислоту, собирают и .подвергают вымораживанию.

Высушенный таким образом продукт растворяют в дистиллированной воде, количество которой берут как можно меньше, полученный раствор доводят до рН 3,7 с помощью l н. соляной кислоты, затем выстаивают в течение ночи при охлаждении льдом для осаждения бесцветных кристаллов. Кристаллы промывают ледяной водой, которую берут в возможно меньших количествах, промывают ацетоном, сушат и получают 792 мг 7-амино-3-метил-Л -цефам-4-карбоновой кислоты с т. пл. 240 — 242 С (разл.), выход 69,6",в.

Вычислено, в/а. С 44,85; Н 4,70; K 13,08.

С„.H>pUl>O>S

Найдено, в/в. С 45,02; Н 4,58; Х 12,95.

П р и мер 5. К раствору 10 мг сырого энзима, полученного по примеру 2, в 5 мл 1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,5) добавляют 5 мг натрий 3-метил-7-фенилацетамид-Л -цефам-4-карбоксилата, реакция протекает при 37 С в течение 5 час. Затем определяют степень разложения 3-метил-7-фенилацетамид-Л -цефам-4-карбоновой кислоты и выход 7-АДСА по вышеуказанному методу определения 1. Получают, соответственно, величины 95 /о и 91 /в

П р имер 6, Пример 4 повторяют, но вместо натрий 3-метил-7-феноксиацетамид-Л -цефам-4-карбоксилата берут натрий 3-метил-7фенилацетамид- Л - цефам -4 - карооксплат и получают 349 мг 7-амино-3-метил-Л -цефам-4карбоновой кислоты с т. пл. 239 — 241 С (разл.), выход 73,5в/в.

Пример 7. рН 10 л фильтрата культуры

Bacillus megaterium В-400 FERN-P,гЪ 748, полученного по примеру 2, доводят до 7 с помощью уксусной кислоты. К фильтрату культуры добавляют 500 г диатомной земли и полученную смесь перемешивают 30 мин. В течение этого времени рН поддерживают равным 7. Затем реакционную жидкость центрифугируют на центрифуге корзинчатого типа, затем промывают водой и получают 750 г влажного целита (энзимный титр 1200 ед г).

П р им ер 8. рН фильтрата культуры Bacillus megaterium B-400 FERN-P Xe 748, полученной по примеру 2, доводят до 7. К каждому литру фильтрата отдельно добавляют по

50 г целита (Гифло Супер Цел), активированлого угля, СМ-целлюлозу и Амберлий

CG-50. Полученные смеси перемешивают в течение 30 мин. В это время рН поддерживают около 7. Затем каждый носитель выделяют фильтрованием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной сорбции для каждого носителя, принимая за 100 /в-ную сорбцию энзима степень сорбции целитом. Результаты представлены в Tao;I. 2.

Пример 9. Целит с сорбированным деацилпрующим энзимом (энзимный титр

1800 ед/г), полученный по примеру 8, промывают буферным раствором 0,01 М фосфата (рН 7,5), набивают в колонку, снабженную рубашкой (5р,50 см) и промывают в течение

1 час при определенном расходе (объемная скорость 0,5) этим же буферным раствором.

Нар .жн1ю температуру колонки поддерживают определенной путем пропускания,в рубашку колонки теплой воды при 37 С. Затем через колонку пропускают 6л (5 мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7-фенилацетамиддезацетоксицефалоспораната при определенной скорости (объемная скорость

0,5), вытекающую жидкость фракционируют на отдельные фракции (количество каждой фракции 10,8 мл). Для завершения реакции требуется 16 час. Доводят рН до 6 н выпаривают до 1/10 объема. Конце:-.ðàò доводят до рН 3,7 с помощью 6 н. соляной кислоты, при этом образовавшаяся 7-АДСА начинает выпадать в осадок. Для завершения осаждения концентрат охлаждают льдом, осадок отфильтровывают. промывают небольшим количеством ледяной воды, ацетоном и после сушки получают 14.0 r белой 7-АДСА с т. пл. 240—

242 С, выход 72,4 /в. Этот продукт растворяют в водном растворе едкого натра (05 н.), раствор обесцвечивают активированным углем, доводят рН до 3,7 с помощью 6 н. соляной кислоты и охлаждают льдом для осаждения 7-АДСА. Затем 7-АДСА отфильтровывают, промывают небольшим количеством ледяной воды, ацетоном и сушат, при этом получают 11,4 г очищенного продукта.

Пример 10. Пример 9 повторяют, цо вместо Целита с сорбированным деациlиру ощим энзимом для получения 7-АДСА берут активированньш уголь с сорбированным энзимом, СМ-целлюлозу с сорбированным эпзимом и Амберлит CG-50 с сорбированным энзимом. Результаты представлены в табл. 3

469266

Таблица 3

Количество продукта, г

Носитель

Выход, %

Актпвированный уголь

СМ-целлюлоза

Амберлит CG-50

37,5

32,9

31,3

58,2

51,8

48,5

Предмет изобретени я нр н

000 ь1

R-C0 NH

О сн

9 001"1

Составитель М. Ларина

Редактор H. Спиридонова Техред T. Миронова Корректор E. Рогайлина

Заказ 3074/7 Изд. № !475 Тираж 529 Подписное

Ц1-!И!!ПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раугдская наб, д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Пример 1. Для получения культуры проводят такое же выращивание, как в примере

1. 1 л этой культуры переносят в резервуар для выращивания культуры на 250 т, в котором находится 200 л среды, такого же состава как в примере 1, и ведут выращивание при

30 С в течение 48 час. Для получения 350 л культуры (фильтрата) работают 2 резервуара на 250 л. К фильтрату культуры добавляют 3,5 кг целита и смесь перемешивают

30 мин, поддерживая рН среды 7. Затем смесь дегидратируют на центрифуге, остаток промывают водой и получают 5,2 кг влажного целита (энзимный титр 5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхлоридную колонку размером 120 900 мм и через нее пропуска|от раствор (5 мг/мл) 7-фенилацетамидо-дезацетоксицефалоспорановой кислоты в фосфатном буферном растворе 0,05 M (рН 7,5), поддерживая температуру 37 С (общее количество

1,8 кг), 360 л расход 5 л/час, Элюирование заканчивают в течение 72 час и получают всего 375 л элюата. К этому элюату дооавляют

290 л ацетона, рН полученной смеси доводят до 4,0 с помощью 6 и. соляной кислоты, перемешивают в течение 30 мин и выстаивают в течение ночи для выпадения осадка. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат. Получают 1130,2 г кристаллов 7-АДСА (чистота 90,0%) выход 89,2%.

Способ получения 7-амино-дезацетоксицефа10 лоспорановой кислоты (7-АДСА) общей форм чы отличающийся тем, что, на со Ib общей

20 формулы где R — бензильная ..ли феноксиметильная

30 группа, М вЂ” щелочной металл, воздействуют культура IbIIOH жидкостью, полученной при выращивании штамма Bacillus megaterium

Б-400 FERN! № 748, являющегося продуцентом энзима ацеламид амидогидролазы.